高解析度全山
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

在脊椎动物的发育和疾病的基因功能研究的模型,小热带鱼,斑马鱼已成为一种流行。靶基因表达的时间和空间可以由

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

本文着重介绍整个安装的斑马鱼胚胎原位杂交(WISH)。无论是在组织中的分布和发育阶段基因表达的愿望技术有助于评估。议定书描述使用WISH斑马鱼胚胎,使用地高辛标记的反义RNA探针。通过在体外转录的基因已被克隆和线性化的模板,将地高辛联核苷酸探针所产生的。收获定义的发育阶段的胚胎绒毛膜特异性探针孵化前被删除。经过洗涤步骤,以除去多余的探针,胚胎用碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体孵育。通过采用碱性磷酸酶的显色底物,特定基因的表达进行评估。根据不同的基因的表达水平,就可以完成整个过程需要2-3天。

Introduction

斑马鱼( 斑马鱼 )已经成为一个强大的动物模型,为研究脊椎动物的发育,疾病,行为,以及在药物筛选1-3。斑马鱼的胚胎,可以得到大量从一个单一的十字路口。测土配方施肥和发展发生子宫外和透明的胚胎发育迅速。关键发育事件发生在第一受精后48小时(HPF)。这包括器官原基的外观和细胞分化的启动。击倒或过度表达的蛋白质可以通过在吗啉代反义寡核苷酸(MO)胚胎的显微注射,或上面的一个或两个细胞阶段(0.75 HPF)的分别的mRNA。

斑马鱼胚胎的愿望,有利于利益的特定基因的时空表达的研究。后的愿望技术应用显微注射胚胎mRNA或MO过表达式ESS或击倒特定的蛋白质水平揭示微分调节其他基因。

可以是相关的基因表达模式的变化与表型的变化,在器官发生早期揭示的靶基因的功能。由于探头可以预先制备和贮存,原位杂交技术可以应用在一个时间使用六孔板和定制的篮子,以显示至少20个基因的基因表达模式。

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Protocol

1。整个安装原位杂交斑马鱼胚胎

1.1胚胎的制备

  1. 收集胚胎发育阶段所需。请参阅基梅尔 5萌芽阶段的描述。
  2. 删除手动绒毛膜使用钳(杜蒙列表镊子5号)。
  3. 修复胚胎在4%的多聚甲醛(PFA)的PBS中的溶液(磷酸盐缓冲盐水),在4℃下过夜
  4. 胚胎用PBS洗净,每次5分钟,在室温下至少3倍。
  5. 商店胚胎在-20°C在100%甲醇(甲醇),直到用于未来应用原位杂交技术,包括整个安装。
  6. 冻结上演胚胎总RNA的提取和存储在液氮中,在-80℃下
  7. 上演胚胎中提取RNA合成cDNA进行PCR扩增和随后的克隆。
  8. 1.2合成地高辛标记的RNA探针

    1. 探针模板的PCR扩增和克隆。设置,总体积为50μl的PCR反应,如表1中所示。使用基因组DNA或更小的cDNA为模板,在PCR反应中。包括在72℃10分钟的延伸时间的最后一个周期,以确保PCR反应产物的全长和3'端腺苷化,以促进TOPO克隆。
    试剂
    模板DNA 100毫微克
    PCR缓冲液(10X) 5微升
    dNTPs浓度(10毫米) 2微升
    引物(10毫米) 各1μM
    加水至最终体积为 49.7微升
    Taq聚合酶(5单位/&#956升) 0.3微升
    反应体积 将50μl

    表1中。PCR扩增反应。

    1. 验证的大小的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳。的估计大小的PCR产物为探针的合成是接近1 kb的。
    2. 特别要注意避免核酸开展实验,无菌条件下使用无核酸水的污染。在观察多个产品,凝胶净化适当大小的PCR产物,然后再继续使用TOPO TA克隆试剂盒克隆。优化PCR反应,以消除拖尾的外观和多个频段。
    3. 下进行,如表2中所示的TOPO克隆反应。联合TOPO载体和PCR产品,并在室温下孵育5分钟。
    试剂 化学感受细胞 电感受态细胞 新鲜的PCR反应产品 1-4微升 1-4微升盐水 1微升稀释盐溶液 1微升水总成交量5微升总成交量5微升 TOPO载体 1微升 1微升 最终成交量 6微升 6微升

    表2中。TOPO克隆反应。

    1. TOPO克隆产品纳入/引入到一杆能干细胞。 Ť他的过程被称为转型。
    2. 转化的细胞在37℃下孵育至少1小时,以260 rpm以确保表达的抗生素抗性基因。板预热的Luria Bertani(LB)琼脂平板,含50μg/ ml氨苄青霉素和X-gal的转化混合物(50-100微升)。孵育37℃过夜。
    3. 确定插入基于外观白色或淡蓝色菌落的存在。 TOPO载体包含lacZ基因编码β-半乳糖苷酶。在X-gal的存在下,β-半乳糖苷酶的生产形成蓝色。产生的DNA片段连接到质粒破坏了形成功能性β-半乳糖苷酶和白色菌落。白色菌落或浅蓝色殖民地的确认存在的插入。
    4. 挑选白色菌落琼脂平板上,用无菌枪头,将它们放置在无菌的10毫升管含4毫升的LB培养基和培养,在37°C,在晃动的温浴器以200rpm过夜。
    5. 纯化的质粒DNA,用质粒DNA的试剂盒,根据制造商的指示。
    6. 线性化的cDNA以下质粒纯化每个探头,有一个独特的站点位于3'(感探头)或5'(反义探针)插入适当的限制性内切酶消化5微克的cDNA。
    7. 纯化的线性化的DNA用酚/氯仿抽提方法。加入等体积的苯酚/氯仿,顶点大力,持续30秒,旋转3分钟,在4℃下以13,000 rpm上层水相转移到干净的试管中,并加入等体积的氯仿。在4℃下以13,000 rpm的3分钟的自旋上层水相转移到干净的试管。加入10%的醋酸钠(3米)和2.5倍体积的100%乙醇沉淀DNA,并储存于-20°C过夜。在4℃下以13,000 rpm 15分钟自旋除去乙醇,并用75%乙醇洗涤沉淀。该协议可以停止和DNA可以被ST在-20°C相或第二天恢复。在4℃下以10,000 rpm 10分钟自旋小心除去上清液,持续2分钟,在室温下干燥沉淀。将沉淀重悬于10μl的DEPC处理过的水和孵育在55℃下20分钟。量化DNA浓度用紫外分光光度计。
    8. 通过琼脂糖凝胶电泳,使用1μl的DNA在1%琼脂糖凝胶上运行约30分钟,评估纯度。
    9. 设置RNA贴标反应。用无RNA酶的反应瓶中,加入1-5微克纯化的DNA模板,无菌的,无RNase的DEPC处理过的双蒸水至体积为13微升。冷藏冰和反应小瓶中添加下列试剂( 见表 3):
    试剂
    NTP标记混合物(10倍) 2微升
    转录的buffER(10倍) 2微升
    保护核糖核酸酶抑制剂 1微升
    RNA聚合酶SP6
    RNA聚合酶T7 2微升
    最终成交量 20μl的

    表3中。,RNA标记反应。

    1. 轻轻地混合试剂,然后以2,000 rpm离心收集在底部,持续30秒,在室温下孵育2小时,将反应混合物在37℃。
    2. 加入2微升的无RNA酶的DNA酶I。下孵育30分钟,在37℃,并通过加入2微升的0.2M EDTA(pH 8.0)中,使反应停止,以去除模板DNA。
    3. 通过加入2.5微升4M的LiCl和75微升100%的乙醇,沉淀出反应产物。混合解决方案,并保持在-20℃,45分钟Øŗ存放于-20℃过夜和协议恢复第二天。
    4. 在4℃下以13,000 rpm离心悬浮液30分钟,然后用500μl的70%乙醇再延长10分钟,2分钟干燥储存在-20℃,离心,洗涤沉淀,重悬在50μl孵育在37℃下在30分钟
    5. 验证探针的质量和完整性,约30分钟,在1%琼脂糖凝胶上运行1-2毫升。这也证实了在预期的大小在凝胶上运行的单品的存在下。
    6. 量化的探针浓度,使用分光光度计测定RNA的量。从该反应中的产率是约10μg的RNA(100〜200毫微克/微升)。

    1.3全安装在原位杂交

    1. 第1天
      1. 补液
        1. 准备使用尼龙筛(孔径大小小于1毫米)和Eppendorf管的篮子。构建筐切割机克Eppendorf管中(1.5毫升)以除去的锥形端部。要找出个别篮子使用不同颜色的管子,并卸下前轮圈其中一半。
        2. 切小块尼龙网覆盖的Eppendorf管的切割端。通过在通风橱中的电热板之间设置到中高加热棒的管的切割端的尼龙网眼。冷却后,除去过量的尼龙网丝从筐,并将其储存在室温下在100%甲醇中。
        3. 使用第3由100%的六孔板的孔中,然后,准备连续稀释在PBS(75%[体积/体积的甲醇,50%[体积/体积]甲醇和25%[体积/体积]甲醇)的甲醇PBST(磷酸盐缓冲液含0.1%吐温20),在接下来的3个井。
        4. 待胚胎在原位杂交程序使用定制的篮图A 1a和1b所示。使用RNase-free的解决方案的杂交重刑在6孔培养板中的步骤(4毫升/孔),为了实现这一目标,将第一阱中的6筐。地点篮与RIM首先由轮辋连续排列的不同颜色的篮子没有。 6的基因表达模式使用这种安排,可同时测定。
        5. 将脱水相同的胚胎发育阶段到相同的购物篮( 参见 图1)。
        6. 的移动筐在6孔板以及从一个到下一个的每个步骤(5分钟)再水合胚胎。使用六口井填充适当的缓冲。胚胎每个稀释度进行一次。在这种方式中,胚胎洗涤6次,5分钟/洗涤。补液脱水胚胎是通过用PBS代替甲醇,然后由100%PBST洗涤3倍。
      2. 通透性月刊用蛋白酶K(10微克/毫升),在室温下再水化的胚胎,使它们可渗透的,如表4中所示 萌芽阶段(小时受精后) 消化期(蛋白酶K) 最多6个 15秒 6-12 30秒 12-18 3分钟 24 12-15分钟 48 25-30分钟 72 40分钟 96-120 50分钟

        表4中。通透反应。

      3. Postfixation和PBST清洗
        1. 修复的胚胎,在4%多聚甲醛(重量/体积),在1x PBS中孵育20分钟。
        2. 去除残留的多聚甲醛洗涤胚胎3X,5分钟/洗,在1x PBST。
        </ LI>
      4. 准备的乙酰乙酰化混合物(125微升三乙醇胺和27微升的醋酸酐10毫升DDH 2 O)和孵化胚胎两次,每次10分钟。为了最大限度地减少内源性磷酸酶活性,准备乙酰混合物新鲜时需要。要去除多余的试剂,两次胚胎在PBST洗(10分钟/洗涤)
      5. 的预杂交 Prehybridize胚胎筐胚胎转移到1.5毫升无菌的Eppendorf管中,用200μl的杂交混合物孵育2-4小时,在70℃的水浴中。
      6. 预吸附的抗体从篮子中取出约50个胚胎,并将它们传送到1.5毫升无菌Eppendorf管。用抗DIG-AP抗体(1:500)用封闭缓冲液(PBST中1个,2%小牛血清[体积/体积],2毫克/毫升牛血清白蛋白的相互作用[BSA]),在室温下2-4小时,孵育然后将其存储在4℃过夜。从孵化器中删除在早上ð允许胚胎达到室温。
      7. 杂交添加100-200纳克的探针到预杂交胚胎和孵育过夜,在70℃水浴中。
    2. 第2天
      1. 盐水柠檬酸钠(SSC)洗
        1. 取50毫升的试管杂交的混合物(HM),:2X SSC和0.2倍SSC在烧杯中的水在70℃水浴中,他们至少20分钟prewarm。删除含有该探针的杂交反应混合物中,加入1 ml预热的杂交混合物的管,并孵育15分钟,在70℃下填充六孔板预热的HM的2×SSC中与各种稀释度的替换100%通过50%至25%HM HM,以除去过量的试剂。
        2. 在等待的同时,填补六孔板2倍SSC洗涤,并保持在70°C。
        3. 15分钟后,这里的胚胎从管保持在6孔板中填充稀释篮子HM s的具有2×SSC洗杂交胚胎购物篮以及从一个移动到下一个(15分钟,在70℃水浴中)。洗涤胚胎2倍,15分钟/洗涤,在100%的2×SSC在70℃下
        4. 置另一水浴中在65℃下填补六孔板高严谨的0.2×SSC中洗涤,以避免非特异性的转录与探针杂交。
        5. 胚胎后洗涤两次用2×SSC在70℃下,按照进一步在0.2×SSC中洗涤30分钟,在65℃下
      2. 用PBST洗涤准备六孔板与连续稀释的0.2×SSC在PBST如下:75%(体积/体积)0.2×SSC,50%(体积/体积),0.2×SSC,25%(体积/体积)的0.2倍SSC,和剩余的两个阱100%PBST。清洗篮移动以及从一个到下一个(5分钟,在室温下为每个步骤使用摇杆)杂交的胚胎。
      3. 预孵育垫上预温育胚胎在室温下3-4小时BLO他妈的缓冲区(1X PBST,2%小牛血清体积/体积],2毫克/毫升BSA)。
      4. 抗地高辛抗体孵育胚胎用抗DIG-AP抗体(1:5000)的溶液中,在封闭缓冲液,在4℃下轻轻摇动过夜孵育
    3. 第3天
      1. PBST清洗准备六孔板,4毫升/ PBST。孵化的胚胎洗净篮子移动在6孔板PBST 15分钟期间的6倍。胚胎可以储存在4℃下,继续第二天的协议。
      2. Prestaining Prestain 2个15分钟洗涤用缓冲液,在室温下轻轻摇动prestaining BCIP(5 -溴-4 -氯-3 -吲哚基磷酸酯)和NBT(氮蓝四唑)的存在下在孵化前的胚胎。 BCIP和NBT是用于碱性磷酸酶活性的发色底物。由于探针附着碱性磷酸酶日紫色表示ê发展目标基因的表达。胚胎可以储存在4℃下,继续第二天的协议。
      3. 染色法
        1. 在室温下,在黑暗中与BCIP及NBT 30分钟孵育胚胎。
        2. 每30分钟使用立体显微镜监测染色反应。反应时间从15分钟,16小时,取决于基因表达水平变化。反应时间更短和更长的高表达基因的为弱表达基因。感探测器将探测信号,如果感兴趣的基因表达互补反义(AS)成绩单。
      4. 停止反应后达到所需的染色强度,使反应停止,转移到孔中,反应终止液(1倍的PBS液,pH5.5,1mM EDTA的溶液,0.1%吐温)含有胚胎的筐。这将避免颜色的进一步发展。的胚胎冲洗10分钟,2倍摇杆温柔AG在室温下itation。
      5. Postfixation
        1. 孵育20分钟的多聚甲醛的PBS中的4%(重量/体积)中的胚胎。
        2. 用PBST洗的胚胎(5分钟/洗涤)三次,以除去残留的多聚甲醛。在4°C,存储固定的胚胎在黑暗的一站式解决方案
      6. 安装,观测和图像采集
        1. 胚胎转移到一个六孔板中,含有100%的甘油,使用可能的最小体积的PBS。将6孔板在摇臂上,轻轻地在黑暗中在室温下搅拌过夜。
        2. 放置在100%甘油中的胚胎,然后在立体显微镜下观察信号。
        3. 获取图像,并保存为Tiff文件格式或任何其他类型可以生产高品质的图像,例如Photoshop( 图3-6),通过使用图像处理软件。

    I N原位杂交

    1. 来实现双标记的方法如上所述从1.1 - 1.3.1.7使用,但包括地高辛,荧光素标记的探针在杂交过程中同时孵育。
    2. 按照同样的步骤,杂交后洗即SSC和的PBST洗涤(步骤1.3.2.1和1.3.2.2)和阻塞孵化(步骤1.3.2.3)。执行顺序如下文所述的抗体和染色反应。
    3. 孵育胚胎AP耦合抗地高辛抗体(1:5000),在4℃,轻轻搅拌。
    4. 洗净和孵化BCIP-NBT(的步骤1.3.3.1 - 1.3.3.6)。
    5. 检测后,洗两次胚胎用PBST,在室温下20分钟。
    6. 在PBST中,在65℃下孵育胚胎用1mM EDTA的溶液30分钟,以灭活的抗地高辛抗体。
    7. 在100%甲醇孵育胚胎其次在75%,50%,25%甲醇机智补液ħPBST PBST 1小时。
    8. 孵育过夜AP耦合荧光素(1:2,000)封闭液在4℃,轻轻摇动的胚胎。
    9. 清洗胚胎用PBST(步骤1.3.3.1)和染色前的胚胎,2次15分钟与预染色缓冲液(0.1米的Tris-盐酸,pH为8.2)在室温下,轻轻摇动,在孵化前的存在下固红。协议可以被停止和胚胎可以被存储在4℃下轻轻摇动,恢复第二天。
    10. 一个快速红色片剂在2毫升染色缓冲液使用前立即溶解。
    11. 启动耐晒红试剂染色缓冲胚胎的染色反应。
    12. 停止时达到所需的染色强度的染色反应。这可能需要从几个小时,在室温下染色时,在4℃,过夜一天或两天立即停止反应,如果染色强度不会进一步发展或开始出现非特异性性时相比,检测控制。
    13. 按照上述程序的其余步骤即固定后,安装,观测和图像采集(steps1.3.3.5和1.3.3.6)。

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Representative Results

每筐50个胚胎(每个基因/实验条件),该基因的表达模式,可以实现在一个实验中使用的协议。几乎所有的胚胎显示一个特定的基因表达模式相似。 原位杂交染色的代表性实例示于图3-6中

的正义和反义核糖探针,合成的cDNA对应于PC5.1,PC5.2 6,SCL/tal-1 7,GATA-1 8,9,FLK / kdrl的10,1112 DLX2的fkd7 / FOXA1 13,14,15,胰岛素和胰蛋白酶16已被使用Taq DNA聚合酶,通过放大段的全长mRNA的构造,并克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen公司)。真实性个别扩增子测序证实。经过验证克隆取向,合成了相应的反义核糖探针使用协议17修改18,19这里描述的使用SP6或T7 RNA聚合酶。在图2中, 原位杂交技术在整个安装涉及的步骤简要说明。紫染色观察与利益的riboprobe杂交后代表的丰度和网站的特定基因的表达。比如PC5.1耳囊和侧线原基24hpf内的前部和后部的部分显示了非常离散表达强烈本地化内的前部和后部的侧线神经丘72 HPF(图3)。对比度PC5.2中高表达,在高通滤波器96( 图4)的肝脏和小肠内无处不在的表达在中枢神经系统内的体节,耳泡和原肾管具有鲜明的区域化。缺失的基因表达时,使用各自的读出的核糖探针作为阴性对照。 ( 图4b)。表达分析的血液标记显示SCL/tal-1染色对双边颅细胞内,并在中间的细胞团(ICM)。虽然染色加塔-1还可以看出内的ICM的表达模式是不同的。后脑,主间血管内和的ICM(图5)中的表达,观察FLK / kdrl的嘘染色中观察到:脊索(图5)中的表达,在34 hpf DLX2是定位于端脑,间脑,下丘脑和颅外胚间充质的拱门和fkd7/foxa1表达在24 HPF,主要见于底板和底索。胰腺癌标志物的表达模式表明胰岛素染色在胰腺内分泌和外分泌胰腺的胰蛋白酶(图6)。这些结果显示具有高分辨率的表达模式表示​​的概述的协议的成功两个高,低丰度的基因的表达的检测。可以采取进一步的清晰图像后,利用共聚焦显微镜上安装的胚胎显微玻片20。子的协议的最优化过程中的最佳条件下进行实验时所获得的结果的例子示于图7。 表达较差的高背景信号注意到下的通透性和不足之间的杂交55-60℃。

图1
图1。 Eppendorf公司尼龙制备和使用的网筐持有上演胚胎 。一个可容纳六Eppendorf公司尼龙网筐。该图像显示了6孔无菌板,含有6个离心尼龙网筐用于在PBS中连续稀释的甲醇。

图2
图2。图表显示原位杂交技术在整个安装所涉及的步骤 。定影后上演胚胎可以被存储在甲醇中,在-20℃直至使用。探头可以预先合成,并保持在-80℃。小等分存储探头是明智的,如果他们是在长时间使用。一般来说整个安装在原位杂交实验,在3天或4天就可以完成。弱表达基因的染色反应在室温下16小时或更长的时间进行染色反应时在4°C 点击这里查看更大的fIGURE。

图3
图3 原位杂交分析,整个安装PC5.1的表达进行了使用24 HPF和72 HPF上演胚胎。(一)横向视图显示非常离散24 HPF胚胎内表达PC5.1前后部的耳囊和侧线原基使用PC5.1反义的riboprobe的的。在72 HPF特定的染色观察内的前部和后部的侧线神经丘(二)基因表达缺失使用PC5.1感的riboprobe作为阴性对照。 点击这里查看大图

gether.within页=“总是”> 图4
图4。使用PC5.2防责任感和使命感核糖探针进行原位杂交分析PC5.2在24 HPF和96 HPF整个安装。 (一)横向视图24 HPF胚胎无处不在中枢神经系统的表达,体节耳泡和原肾管。在肝脏和肠道的特殊染色见于96 HPF使用PC5.2反义的riboprobe的的。(二)基因表达缺失使用PC5.2感的riboprobe作为阴性对照。 点击这里查看大图

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图5。全安装原位杂交分析在24 HPF使用SCL/tal-1的riboprobe显示的脑神经细胞内的双边和中间细胞团(ICM)染色 ;,在ICM GATA-1的riboprobe染色; FLK / kdrl表达后脑,主要和间血管内,在ICM。在脊索嘘染色观察。

图6
图6。全安装原位杂交分析在34 HPF使用DLX2的riboprobe透露的表达DLX2 24 HPF fkd7/foxa1的表达,主要见于在地板p 端脑,间脑,下丘脑和颅外胚间充质拱门 ;迟到和底索胰岛素染色观察胰腺外分泌胰腺内分泌和胰蛋白酶的表达。

图7
图7。足够的通透性和适当的杂交温度是至关重要的原位杂交信号清晰。 原位杂交分析全安装在24 HPF和使用嘘的riboprobe的48 HPF透露内脊索和floorplate的表达没有背景信号,当胚胎通透蛋白酶K消化12-15分钟,在70℃下杂交不完整的表达模式和高背景信号时,观察胚胎消化不充分,(蛋白酶K处理5分钟),或在低温下杂交(60°C), 点击这里查看大图

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Discussion

我们已经开发了改进的方法具有高的分辨率的可视化RNA。的原位杂交程序,进行了使用简单的量身定制筐与多孔底的(图1)。胚胎的处理,在无菌条件下,在6孔培养板中,在室温下使用RNase-free的解决方案。

是由不同颜色的Eppendorf管中,以分隔胚胎筐。筐带或不带的轮辋是用于容易取向,并确定为对应于一个特定的探针的购物篮内的胚胎。

预杂交在65℃下和杂交在70℃,用50%去离子甲酰胺被认为是特别重要的,以获得高的分辨率的信号。此外孵化胚胎碱性的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,15分钟后用PBST洗涤两次,培养结束后的抗DIG抗体,BCIP的存在下在孵化前NBT有利于高品质的外观,清晰的信号。在我们的手中,我们经历的通透性和固定的最佳时间和杂交在70°C的胚胎中获得明确的信号是非常关键的。通透性不足产生高背景信号。延期通透性或定影不充分导致的退化的胚胎,,而延长定影抑制信号检测。杂交55-60°C之间,也产生了高的背景信号(图7)。

义探针,将检测到的信号的AS成绩单,如果感兴趣的基因编码的反义(AS)的成绩单。在染色反应停止后胚胎在甲醇中放置30分钟或更长的时间将该信号转换为一个真正的紫色,并消除非特异性染色。固定胚胎可以存储在黑暗中在停止溶液中,在4℃下,数个月。

的优点和disadvantag的ES的心愿

愿望是一个高效的技术特征的时空靶基因的表达在胚胎发育过程中的幼虫阶段。该协议还允许可视化的RNA表达两个基因或RNA和蛋白表达的共定位在同一时间使用适当的修改,这取决于实验目标。这种高分辨率的协议可以被用于检测RNA的表达在许多组织和细胞类型。它可用于非常低丰度的RNA的检测,以最小的背景信号。然而,可视化组织内部隔层内的基因的准确表达需要使用组织切片原位杂交。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
  3. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
  4. Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
  5. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  6. Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
  7. Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
  8. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
  9. Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
  10. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124-381 (1997).
  11. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  12. Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
  13. Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
  14. Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
  15. Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
  16. Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
  17. Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
  18. Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
  19. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
  20. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).

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