Alta resolução Monte Whole
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada pela

Cite this Article

Copy Citation

Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Este artigo incide sobre todo o monte de hibridização in situ (desejo) de embriões de peixe-zebra. A tecnologia VONTADE facilita a avaliação da expressão do gene, tanto em termos de distribuição do tecido e fase de desenvolvimento. Protocolos são descritas pela utilização de desejo dos embriões de peixe-zebra utilizando sondas de ARN anti-sentido marcadas com digoxigenina. As sondas são gerados através da incorporação de nucleótidos ligados com digoxigenina, através de transcrição in vitro de modelos de genes que foram clonados e linearizado. Os córions de embriões colhidos em estádios de desenvolvimento definidos são removidos antes da incubação com sondas específicas. Seguindo um processo de lavagem para remover o excesso de sonda, os embriões foram incubados com o anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. Com o emprego de um substrato cromogénico para a fosfatase alcalina, a expressão do gene específico pode ser avaliada. Dependendo do nível de expressão do gene de todo o processo pode ser completado dentro de 2-3 dias.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um poderoso modelo animal para o estudo do desenvolvimento dos vertebrados, a doença, o comportamento e no rastreio de drogas 1-3. Embriões de peixe-zebra pode ser obtido em grandes quantidades a partir de um único cruzamento. Fertilização e desenvolvimento ocorre ex utero e os embriões opticamente claras desenvolver rapidamente. Eventos críticos de desenvolvimento ocorrem durante as primeiras 48 horas pós-fertilização (hpf). Isto inclui o aparecimento de órgão primórdios e o início de citodiferenciação. Knockdown ou sobre-expressão de proteínas pode ser alcançada através da microinjecção de embriões com anti-sentido morfolino (MO), os oligonucleótidos ou ARNm, respectivamente, no estádio de uma ou duas células (0,75 HPF).

O desejo de embriões zebrafish facilita o estudo da expressão espaço-temporal de genes específicos de interesse. Aplicação da técnica DESEJO seguindo microinjeção de embriões com mRNA ou MO para o excesso de express ou os níveis de proteína específicas knockdown revela regulação diferencial de outros genes.

As mudanças nos padrões de expressão de genes pode ser correlacionada com as alterações fenotípicas e revelar a função de genes alvo durante a organogénese precoce. Uma vez que as sondas podem ser preparadas e armazenadas de antemão, a técnica pode ser aplicada a ISH para revelar os padrões de expressão de genes para pelo menos 20 genes de cada vez utilizando placas de seis poços e fizeram cestas personalizadas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Todo-mount Hibridização In Situ de embriões Zebrafish

1.1 Preparação de Embriões

  1. Coletar embriões em estágios de desenvolvimento necessários. Por favor, veja Kimmel et al. 5 para descrição estágio embrionário.
  2. Remover córions manualmente usando uma pinça (Dumont Relojoeiros Fórceps não. 5).
  3. Fix embriões em uma solução a 4% de paraformaldeído (PFA), composto em PBS (Tampão fosfato salino) durante a noite a 4 ° C.
  4. Lavar embriões com PBS, pelo menos 3 x durante 5 min cada, à temperatura ambiente.
  5. Loja embriões em 100% de metanol (MeOH) à temperatura de -20 ° C até ser utilizado para a futura aplicação de técnicas, incluindo todo o monte de hibridação in situ.
  6. Congelar embriões encenado em nitrogênio líquido para extração e armazenamento de RNA a -80 ° C.
  7. Extrair o RNA a partir de embriões encenado e sintetizar ADNc para amplificação por PCR e clonagem subsequente.
  8. 1.2 Síntese de sondas de RNA marcadas com digoxigenina

    1. Amplificação por PCR e clonagem de genes para o modelo da sonda. Reacção de PCR instalação com volume total de 50 ul, como mostrado na Tabela 1. É mais DNA genómico ou de cDNA menos na reacção de PCR como molde. Incluir 10 min tempo de extensão a 72 ° C após o último ciclo de certificar-se de que os produtos da reacção de PCR são de comprimento completo e 3 'adenilada, a fim de facilitar a clonagem TOPO.
    Reagente Volume
    Molde de ADN 100 ng
    PCR Buffer (10x) 5 ul
    de dNTP (10 mM) 2 ul
    Os iniciadores (10 mM) 1 uM cada
    Adicionar água para um volume final de 49,7 mL
    Taq polimerase (5 unidades / & #956, l) 0,3 mL
    Volume de reação 50 ul

    Tabela 1. Reacção de amplificação por PCR.

    1. Verificar se o tamanho do produto de PCR utilizando electroforese em gel de agarose O tamanho estimado do produto de PCR para a síntese da sonda está próximo de 1 kb.
    2. Tome especial cuidado para evitar a contaminação nuclease realizando o experimento em condições estéreis e usar água livre de nuclease. No caso de produtos múltiplos são observados, purificar em gel do produto de PCR de tamanho apropriado antes de prosseguir com a clonagem TOPO, utilizando o Kit de Clonagem TA. Optimizar a reacção de PCR para a eliminar o aparecimento de manchas e de múltiplas bandas.
    3. Realizar a reacção a clonagem TOPO, tal como indicado na Tabela 2. Combinar TOPO Vetor e produto de PCR e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    Reagente As células quimicamente competentes Células competentes Electro Produto da reacção de PCR fresco 1-4 mL 1-4 mL Solução Salina 1 ul Solução Salina diluído 1 ul Água Até ao volume total de 5 ul Até ao volume total de 5 ul TOPO vector 1 ul 1 ul Volume final 6 mL 6 mL

    Tabela 2. Reacção clonagem TOPO.

    1. Incorporar / introduzir o produto de clonagem TOPO em um células competentes tiro. To processo é chamado de transformação.
    2. Incubar as células transformadas a 37 ° C durante pelo menos 1 hora a 260 rpm para garantir a expressão dos genes de resistência a antibióticos. Placa da mistura de transformação (50-100 ul) em pré-aquecido Luria Bertani (LB), as placas de agar contendo 50 ug / ml de ampicilina e X-gal Incubar a 37 ° C durante a noite.
    3. Determinar a presença do inserto com base no aparecimento de colónias brancas ou luz azul. O vector TOPO contém o gene lacZ que codifica β-galactosidase. Na presença de X-gal, a produção de β-galactosidase de forma a cor azul. DNA ligado no plasmídeo perturba a formação de β-galactosidase e as colónias brancas funcionais são produzidos. As colónias brancas ou luz colónias azuis confirmar a presença da inserção.
    4. Escolha as colónias brancas a partir da placa de ágar utilizando pontas de pipetas estéreis e colocá-las no tubo estéril de 10 mL contendo 4 mL de meio LB e a cultura a 37 ° C na incubadora agitaçãotor durante a noite a 200 rpm.
    5. Purifica-se o ADN de plasmídeo utilizando o kit de ADN de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante.
    6. Linearizar ADNc seguinte de purificação de plasmídeo por digestão de 5 ug de ADNc para cada sonda com a enzima de restrição apropriada que tem um único sítio, localizado a 3 '(para as sondas de sentido) ou 5' (para sondas anti-sentido) para a inserção.
    7. Purifica-se o ADN linear utilizando o método de extracção com fenol / clorofórmio. Adicionar um volume igual de rotação com fenol / clorofórmio, o vértice vigorosamente durante 30 segundos, durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir a fase aquosa superior tubo limpo e adicionar um volume igual de clorofórmio. Girar durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir a fase aquosa superior tubo limpo. Adicionar acetato de sódio a 10% (3 M) e 2,5 vezes o volume de etanol a 100% para precipitar o ADN e armazenar a -20 ° C durante a noite. Girar durante 15 min a 13.000 rpm a 4 ° C. Remover o etanol e lavar o sedimento com etanol a 75%. O protocolo pode ser parada e o DNA pode ser stored a -20 ° C, é reiniciada no dia seguinte. Girar durante 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar cuidadosamente a pelete durante 2 minutos à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em 10 mL de água tratada com DEPC e incubar a 55 ° C durante 20 min. Quantificar a concentração de ADN usando o espectrofotômetro UV.
    8. Avaliar a pureza por electroforese em gel de agarose utilizando 1 fil de DNA em gel de agarose a 1% e que funciona para cerca de 30 min.
    9. Configure reacção de marcação RNA. Utilizando um frasco de reacção livre de RNase, adicionar 1-5 ug de ADN purificado a estéril, livre de RNase, água bidestilada tratada com DEPC para um volume de 13 ul. Resfriar o tubo de reação sobre o gelo e adicione os seguintes reagentes (ver Tabela 3):
    Reagente Volume
    NTP mistura rotulagem (10x) 2 ul
    Lustre Transcriçãoer (10x) 2 ul
    Protector de inibidor de RNase 1 ul
    RNA polimerase SP6 ou
    RNA polimerase T7 2 ul
    Volume final 20 ul

    Tabela 3. Reacção de marcação de ARN.

    1. Misturar suavemente, em seguida, o reagente de recolha na parte inferior de uma breve centrifugação a 2.000 rpm durante 30 segundos à temperatura ambiente e incubam-se a mistura de reacção durante 2 horas a 37 ° C.
    2. Remover o ADN molde por adição de 2 ul de ARNase isento de ADNase I. Incubar durante 30 min a 37 ° C e parar a reacção por adição de 2 ul de 0,2 M EDTA (pH 8,0).
    3. Precipitar os produtos da reacção por adição de 2,5 mL de LiCl 4M e 100 ul de etanol 75%. Misturar a solução e manter a -20 ° C durante 45 min or armazenada a -20 ° C durante a noite e o protocolo é reiniciada no dia seguinte.
    4. Centrifugar a suspensão durante 30 min a 13.000 rpm a 4 ° C, em seguida lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 70% conservado a -20 ° C, centrifugar durante mais 10 minutos, seco durante 2 minutos, e voltar a suspender em 50 ul e incubar aos 30 min, a 37 ° C.
    5. Verifique a qualidade da sonda e integridade executando 1-2 ml em gel de agarose 1% para cerca de 30 min. Isto é confirmado pela presença de um único produto executado no tamanho esperado para o gel.
    6. Quantificar a concentração da sonda através da medição da quantidade de RNA usando espectrofotometria. O rendimento desta reacção é de cerca de 10 ug de ARN (100-200 ng / ul).

    1.3 Todo-mount Hibridização In Situ

    1. DIA 1
      1. Reidratação
        1. Prepare cestas usando malha de nylon (menos de 1 mm tamanho dos poros) e tubos Eppendorf. Construa as cestas por cutting tubos Eppendorf (1,5 ml) para remover as extremidades cónicas. Para identificar cestas individuais usam diferentes tubos coloridos e remova a parte superior jantes de metade deles.
        2. Corte pequenos pedaços de malha de nylon para cobrir as extremidades do corte dos tubos Eppendorf. Cole as extremidades de corte dos tubos para a malha de nylon, aquecendo-os em um prato quente elétrico (conjunto entre médio e alto) em um exaustor. Depois arrefeceu-se remover o excesso de malha de nylon dos cestos e armazená-los em 100% de metanol, à temperatura ambiente.
        3. Preparar diluições sucessivas de metanol em PBS (75% [vol / vol [metanol, a 50% [vol / vol] de metanol e 25% [vol / vol] de metanol) utilizando os primeiros três poços das placas de seis poços, seguido por 100% PBST (solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween-20) durante os próximos três poços.
        4. Assunto embriões in loco o processo de hibridação com os cestos feitos sob encomenda, como mostrado na Figurea 1a e b. Utilizar soluções RNase até a hibridizaçãopasso ção em placas de 6 poços (4 mL / poço). Para alcançar este objectivo, o lugar até 6 cestos no primeiro poço. Cesta lugar com borda em primeiro lugar seguido por cestas sem bordas em cores diferentes dispostas consecutivamente. Usando este regime de até 6 padrões de expressão genética pode ser determinado simultaneamente.
        5. Coloque embriões desidratados do mesmo estágio de desenvolvimento para a mesma cesta (ver Figura 1).
        6. Rehidratar embriões movendo cestas de um poço na placa de seis poços com o seguinte (5 minutos para cada etapa). Use seis poços cheios com tampão apropriado. Os embriões são submetidos a uma vez cada diluição. Desta forma os embriões são lavados 6x, 5 min / lavagem. Reidratação dos embriões desidratados é alcançado através da substituição de metanol com PBS e, em seguida, por lavagem 3x com PBST 100%.
      2. Permeabilização Digest os embriões reidratado com proteinase K (10 ug / ml) à temperatura ambiente para tornar os tecidos permeáveis, como mostrado na Tabela 4 Fase embrionária (horas após a fertilização) Período de digestão (Proteinase K) Até 6 15 seg 6-12 30 seg 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min

        Tabela 4. Reacção permeabilização.

      3. Postfixation e PBST Lava
        1. Fix embriões por incubação em paraformaldeído a 4% (p / vol) em 1x PBS, durante 20 min.
        2. Remover paraformaldeído residual por lavagem 3x embriões, 5 min / lavagem em PBST 1x.
        </ Li>
      4. A acetilação Preparar a mistura de acetilação (125 ul de trietanolamina e 27 ul de anidrido acético em 10 ml de ddH 2 O) e os embriões a incubar duas vezes durante 10 minutos cada. Para minimizar a atividade de fosfatase endógena, prepare a mistura de acetilação fresco quando necessário. Para remover o excesso de reagentes, os embriões lavar duas vezes em PBST (10 min / lavagem)
      5. A pré-hibridação Prehybridize embriões por transferência de embriões a partir de cestas de 1,5 ml tubos Eppendorf estéreis e incubação com 200 mL mistura de hibridização por 2-4 horas em um banho de 70 ° C de água.
      6. De pré-adsorção do anticorpo remover cerca de 50 embriões dos cestos e transferi-las para um tubo Eppendorf de 1,5 ml estéreis. Incubar com anticorpo anti-DIG-AP (1:500) do anticorpo utilizando um tampão de bloqueio (1x PBST, 2% de soro de vitela [vol / vol], 2 mg / ml de albumina de soro bovino [BSA]) à temperatura ambiente durante 2-4 horas, e armazenar a 4 ° C durante a noite. Remover da incubadora na manhã umad permitir embriões atingir a temperatura ambiente.
      7. A hibridação Adicionar 100-200 ng de sonda para os embriões pré-hibridizados e incubar durante a noite a 70 ° C em banho-maria.
    2. DIA 2
      1. SSC (Citrato de Saline de sódio) Lavagens
        1. Colocar tubos de 50 ml da mistura de hibridização (HM), 2x SSC e 0,2 x SSC, num copo com água num banho de 70 ° C e a água aquecida previamente durante pelo menos 20 min. Remover a mistura da reacção de hibridação contendo a sonda, adicionar 1 ml de mistura de hibridação pré-aquecido para os tubos e incubar durante 15 min a 70 ° C. Encha as placas de seis poços, com várias diluições de HM pré-aquecido em 2x SSC, substituindo o HM 100% através de 50% a 25% de HM para remover o excesso de reagentes.
        2. Enquanto espera, encher placas de seis poços com 2x SSC durante as lavagens e mantê-los a 70 ° C.
        3. Após 15 min lugar os embriões a partir do tubo para as cestas mantido na placa seis bem cheio com a diluiçãos de HM com 2x SSC e lavar os embriões hibridadas movendo o carrinho de um poço para o outro (15 min cada em um banho de água a 70 ° C). Lavar embriões 2x, 15 min / lavagem, em 100% de 2x SSC a 70 ° C.
        4. Conjunto outro banho-maria a 65 ° C. Encha as placas de seis poços com 0,2 x SSC durante elevado rigor lavagens para evitar a hibridação inespecífica de transcrição com a sonda.
        5. Depois, os embriões são lavados duas vezes com 2x SSC a 70 ° C, segui mais duas lavagens de 30 min em 0,2 x SSC a 65 ° C.
      2. Lavagens PBST Prepara placas de seis poços, com diluições sucessivas de 0,2 x SSC em PBST, como segue: 75% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0.2x SSC, e os restantes dois poços com 100% PBST. Lavar os embriões hibridadas movendo o carrinho de um poço para o outro (5 minutos para cada etapa, à temperatura ambiente, utilizando um balancim).
      3. A pré-incubação de embriões pré-incubar durante 3-4 horas à temperatura ambiente em blotampão cking (1x PBST, 2% de soro de vitela [vol / vol], 2 mg / ml de BSA).
      4. A incubação com anticorpo anti-DIG embriões Incubar com uma solução de anticorpo anti-DIG-AP (1:5000) em tampão durante a noite a 4 ° C com agitação suave bloqueio.
    3. DIA 3
      1. Lavagens PBST Preparar as placas de seis poços com 4 ml / poço PBST. Lavar incubados embriões movendo os cestos na placa de seis poços contendo PBST 6x, por períodos de 15 min. Os embriões podem ser armazenadas a 4 ° C e o protocolo é reiniciada no dia seguinte.
      2. Prestaining Prestain os embriões por lavagem 2x durante 15 min com prestaining tampão à temperatura ambiente com agitação suave, antes da incubação na presença de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) e NBT (nitroazul de tetrazólio). BCIP e NBT são os substratos utilizados para o desenvolvimento da cor da actividade da fosfatase alcalina. Uma vez que as sondas são presos com fosfatase alcalina ªe desenvolvimento de cor púrpura indica a expressão do gene alvo. Os embriões podem ser armazenadas a 4 ° C e o protocolo é reiniciada no dia seguinte.
      3. Coloração
        1. Incubar embriões à temperatura ambiente, no escuro, com BCIP e NBT durante 30 min.
        2. Monitorar a reação de coloração a cada 30 minutos usando um microscópio estereoscópico. Os tempos de reacção variam de 15 min-16 h, dependendo do nível de expressão do gene. Os tempos de resposta mais curtos para genes altamente expressos e mais tempo para genes fracamente expressas. Sentido de sondas irá detectar o sinal, se o gene de interesse expressa anti-sentido complementar (AS) transcrições.
      4. Parar a reacção depois de a intensidade da coloração desejada é alcançada, parar a reacção por transferência de cestos contendo embriões a poços contendo a solução de paragem (1x PBS, pH 5,5, EDTA 1 mM, 0,1% de Tween). Isso irá evitar o desenvolvimento da cor. Enxágüe os embriões para 10 min 2x em um roqueiro com suave agacreditação à temperatura ambiente.
      5. Postfixation
        1. Incubar os embriões em paraformaldeído a 4% (p / vol) em PBS durante 20 min.
        2. Lavar os embriões (5 minutos / lavagem), três vezes com PBST de forma a remover paraformaldeído residual. Armazenar os embriões fixados em solução de parada no escuro a 4 ° C.
      6. Montagem, observação e aquisição de imagens
        1. Transferir os embriões numa placa de seis poços, contendo 100% de glicerol usando o volume mínimo possível de PBS. Colocar a placa de seis poços em um balancim e agitar suavemente durante a noite à temperatura ambiente no escuro.
        2. Coloque embriões em 100% de glicerol e, em seguida, observar o sinal sob um microscópio estereoscópico.
        3. Aquisição de Imagens e salvar como formato de arquivo TIFF ou qualquer outro tipo que permite a produção de imagens de alta qualidade através da utilização de software de imagem como o Photoshop (Figuras 3-6).

    eu n Hibridização In Situ

    1. Para conseguir a dupla marcação com o método descrito acima a partir de 1,1 - 1.3.1.7 é usado, mas inclui a incubação simultânea de ambos digoxigenina e fluoresceína sondas marcadas durante a hibridação.
    2. Siga o mesmo procedimento para o pós hibridização lava nomeadamente SSC e PBST lavagens (etapas 1.3.2.1 e 1.3.2.2) e incubações de bloqueio (etapa 1.3.2.3). Realizar as reacções de anticorpos e coloração sequencialmente, tal como descrito abaixo.
    3. Incubar com anticorpo de embriões AP-coupled-anti-digoxigenina (1:5000) a 4 ° C com agitação suave.
    4. Lave e incubar com BCIP-NBT (etapas 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
    5. Após detecção, lavar duas vezes com PBST embriões à temperatura ambiente durante 20 min.
    6. Incubar os embriões a 65 ° C em PBST com EDTA 1 mM, durante 30 min para inactivar o anticorpo anti-digoxigenina.
    7. Incubar embriões em 100% de metanol, seguido por re-hidratação de 75%, 50%, e 25% de metanol with PBST e volta para PBST por 1 hora.
    8. Incubar durante a noite com embriões AP-coupled fluoresceina (1:2000) em tampão de bloqueio, a 4 ° C com agitação suave.
    9. Lavar embriões com PBST (passo 1.3.3.1) e os embriões pré-mancha 2 vezes durante 15 minutos com tampão de pré-coloração (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) à temperatura ambiente com agitação suave, antes da incubação na presença de vermelho rápido . O protocolo pode ser interrompido e os embriões podem ser armazenados a 4 ° C com agitação suave e retomada no dia seguinte.
    10. Dissolver um comprimido vermelho rápido em 2 ml de tampão de coloração imediatamente antes da utilização.
    11. Comece a reacção de coloração, colocando os embriões no tampão de coloração com reagente vermelho rápido.
    12. Parar a reacção de coloração, quando a intensidade da coloração desejada seja atingida. Pode levar de algumas horas à temperatura ambiente para um ou dois dias durante a noite, quando a coloração a 4 ° C. Parar a reacção imediatamente se a intensidade de coloração não se desenvolve mais ou começa a mostrar não específicadade em relação ao sentido de controlo.
    13. Siga os procedimentos descritos acima para as etapas restantes, ou seja, fixação pós montagem, de observação e de aquisição de imagem (steps1.3.3.5 e 1.3.3.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando o protocolo com 50 embriões por cesto (por gene de / por condição experimental), o padrão de expressão do gene, que podem ser obtidos numa experiência. Quase todos os embriões mostram padrões de expressão semelhantes para um determinado gene. Os exemplos representativos da coloração em hibridação in situ são mostrados nas Figuras 3-6.

Tanto o sentido e anti-sentido riboprobes foram sintetizados a partir dos cDNAs correspondentes a PC5.1, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1, 8,9 flk / kdrl 10, shh 11, Dlx2 12, fkd7 / foxa1 13, insulina 14,15, 16 e tripsina foram construídos por amplificação de um segmento do ARNm de comprimento completo usando Taq DNA polimerase, e clonado em pCRII-TOPO (Invitrogen). A autenticidade de amplicões individuais foi confirmada por sequenciação. Após verificação da orientação do clone, correspondentes ribossondas anti-sentido foram sintetizadosutilizando os protocolos 17 com modificações 18,19, tal como descrito aqui utilizando quer de SP6 ou T7 RNA polimerase. Passos envolvidos em todo o monte de hibridação in situ são ilustrados brevemente na Figura 2. Coloração roxa observada após hibridação com ribossonda de interesse representa tanto a abundância e os locais de expressão de gene em particular. Por exemplo PC5.1 mostra a expressão muito discretos na parte anterior e posterior da vesícula ótica e primórdio da linha lateral em 24hpf e está fortemente localizada dentro dos neuromasts linha lateral anterior e posterior em 72 hpf (Figura 3). Ao contrário PC5.2 mostra expressão ubíqua no SNC com a regionalização distintas dentro da vesícula ótica, somitos e do duto pronephric e é altamente expresso no fígado e no intestino em 96 HPF (Figura 4). A ausência da expressão do gene, quando utilizando ribossondas respectivos sentidos serve como um controlo negativo. ( 4b). Análise da expressão de marcadores de sangue mostraram coloração de SCL/tal-1 dentro das células cranianas bilaterais e na massa celular intermediária (ICM). Embora a coloração para GATA-1 também é considerada dentro da ICM é o padrão de expressão diferente. A expressão do Flk / kdrl foi observado dentro da parte posterior do cérebro, os vasos principais e intersegmental e na ICM (Figura 5). A coloração para shh foi observada no notocórdio (Figura 5). A expressão de Dlx2 a 34 hpf é localizada no telencéfalo, diencéfalo, hipotálamo e arcos ectomesenquimais cranianos ea expressão fkd7/foxa1 em 24 hpf é visto principalmente na placa de piso e hypochord. Estudos de expressão dos marcadores pancreáticas mostraram coloração de insulina no pâncreas endócrino e tripsina no pâncreas exócrino (Figura 6). Estes resultados demonstram um padrão de expressão, com alta resolução representa o sucesso do protocolo delineadopara a detecção da expressão de ambos os genes abundantes altas e baixas. Para mais clareza as imagens pode ser feita utilizando microscopia confocal após a montagem dos embriões em uma lâmina de microscópio 20. Alguns dos exemplos dos resultados obtidos quando a experiência foi realizada em condições sub-óptimas durante a optimização do protocolo são mostrados na Figura 7. Sinal de fundo elevado com baixa expressão de shh foi notada sob permeabilização inadequada e hibridação entre 55-60 ° C.

Figura 1
Figura 1. Preparação e uso de Eppendorf-nylon cestas de malha para segurar encenado embriões. Um bem pode prender seis cestas de malha de nylon-Eppendorf. A imagem mostra as placas de 6 poços estéreis, contendo seis cestas de malha de nylon-Eppendorfutilizado para diluições sucessivas de metanol em PBS.

Figura 2
Figura 2. Diagrama que mostra os passos envolvidos no conjunto de montagem na técnica de hibridação in situ. Após a fixação encenado embriões pode ser armazenado em metanol a -20 ° C até serem usadas. As sondas podem ser sintetizados antecipadamente e guardado a -80 ° C. Armazenando sondas em pequenas alíquotas é aconselhável se forem usadas durante longos períodos. Em geral, todo o monte em experimentos de hibridização in situ pode ser concluído em 3 ou 4 dias. A reação de coloração para genes fracamente expressas vai demorar até 16 horas em temperatura ambiente ou mais, quando a reação de coloração é realizada a 4 ° C Clique aqui para ampliar fIGURA.

Figura 3
Figura 3. PC5.1 A expressão de pelo conjunto de montagem em análises de hibridação in situ foi realizada utilizando 24 e 72 hpf hpf embriões encenadas. (A) vista lateral de 24 embriões hpf mostram expressão muito discreta de PC5.1 dentro do anterior e parte posterior da vesícula ótica e primórdio da linha lateral usando PC5.1 antisense riboprobe. Aos 72 coloração específica hpf foi observada dentro das neuromasts linha lateral anterior e posterior. (B) Ausência de expressão gênica usando PC5.1 sentido riboprobe serve como controle negativo. Clique aqui para ver a figura maior .

gether.within-page = "always"> Figura 4
Figura 4. Aos 24 hpf e 96 hpf todo o monte em análises de hibridização in situ de PC5.2 foi realizada utilizando PC5.2 anti-senso e riboprobes sentidos. (A) Vista lateral de 24 embriões hpf mostrar expressão onipresente dentro do SNC, somitos vesícula ótica e duto pronephric. A coloração específica no fígado e no intestino é visto em 96 hpf usando PC5.2 antisense riboprobe. (B) Ausência de expressão gênica usando PC5.2 sentido riboprobe serve como controle negativo. Clique aqui para ver a figura maior .

oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. Figura 5 Whole-montagem em análises de hibridização in situ de 24 hpf usando ribossonda SCL/tal-1 apresentaram coloração nas células craniais bilaterais e na massa celular intermediária (ICM); GATA-1 coloração ribossonda é visto na ICM, o flk expressão / kdrl dentro do cérebro posterior, o principal, e os vasos intersegmentares e no ICM. A coloração para shh foi observada no notocórdio.

Figura 6
. Figura 6 Whole-montagem em análises de hibridização in situ de 34 hpf usando ribossonda Dlx2 revelou expressão de Dlx2 no telencéfalo, diencéfalo, no hipotálamo e arcos ectomesenquimais cranianos; expressão fkd7/foxa1 a 24 hpf é visto principalmente no chão ptarde e hypochord; coloração insulina é observada no pâncreas endócrino e expressão da tripsina no pâncreas exócrino.

Figura 7
Figura 7. Permeabilização adequada e temperatura de hibridização adequado são fundamentais para a claro em sinais de hibridização in situ. Todo-mount em análises de hibridização in situ em 24 hpf e 48 hpf usando um riboprobe shh revelou expressão dentro da notocorda e floorplate sem sinal de fundo quando os embriões são permeabilizadas por digestão com proteinase K durante 12-15 minutos e depois hibridizou a 70 ° C. Padrões de expressão incompleta e sinais de fundo elevados foram observados quando os embriões foram submetidos a uma digestão inadequada (5 min de tratamento de proteinase K) ou hibridado a baixa temperatura (60 ° C). Clique aqui para ver a figura maior .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nós desenvolvemos métodos melhorados para visualizar o RNA com alta resolução. A nos procedimentos de hibridização in situ são realizados através de simples cestos feitos sob medida com fundo poroso (Figura 1). Os embriões são processadas usando soluções sem RNase em placas de 6 cavidades, à temperatura ambiente e sob condições estéreis.

Segregar embriões cestas são feitas de diferentes tubos coloridos Eppendorf. Cestas com ou sem um aro são utilizados para orientação e fácil para identificar os embriões dentro do cesto como correspondente a uma sonda específica.

A pré-hibridação a 65 ° C e hibridação a 70 ° C com 50% de formamida desionizada foi considerada particularmente importante para obter sinais de alta resolução. Além disso, a incubação de embriões duas vezes com tampão Tris alcalina durante 15 min após lavagens com PBST, após a incubação com o anticorpo anti-DIG e antes da incubação na presença de BCIP eNBT facilita o aparecimento de sinais claros de alta qualidade. Nas nossas mãos, o que experimentado permeabilização e fixação de embriões para o tempo óptimo e hibridação a 70 ° C eram muito crítico na obtenção de sinais claros. Permeabilização inadequada produziu sinais de alta fundo. Permeabilização prolongado ou fixação inadequada resultou na degradação enquanto que os embriões de fixação prolongado inibiu a detecção do sinal. A hibridação entre 55-60 ° C também produziu sinais de fundo elevados (Figura 7).

A sonda de sentido vai detectar um sinal para o AS transcrição se o gene de interesse codifica anti-sentido (AS) transcrições. Após a reacção de coloração é parada colocando os embriões em metanol durante 30 minutos ou mais, converte o sinal para uma cor púrpura verdadeiro, e remove a coloração não específica. Embriões fixos podem ser armazenadas no escuro em solução de paragem a 4 ° C durante vários meses.

As vantagens e disadvantages de DESEJO

DESEJO é uma técnica eficiente para caracterizar a expressão temporal e espacial de genes-alvo durante a embriogênese e estágios larvais. Este protocolo também permite a visualização de expressão do RNA de dois genes ou co-localização de ARN e a expressão de proteína ao mesmo tempo que utilizam as modificações apropriadas, dependendo dos objectivos experimentais. Este protocolo de alta resolução pode ser usado para detectar a expressão de RNA, em muitos tecidos e tipos de células. Ele pode ser usado para a detecção de espécies de RNA abundantes muito baixos com sinais de fundo mínimas. No entanto, para visualizar a expressão de genes dentro precisas compartimentos interiores dos tecidos requer a hibridação in situ usando secções de tecido.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
  3. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
  4. Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
  5. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  6. Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
  7. Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
  8. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
  9. Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
  10. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124-381 (1997).
  11. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  12. Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
  13. Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
  14. Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
  15. Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
  16. Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
  17. Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
  18. Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
  19. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
  20. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats