Alta Risoluzione intero monte
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere determinata

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

Questo articolo si concentra su tutto il montaggio di ibridazione in situ (WISH) di embrioni di zebrafish. La tecnologia WISH facilita la valutazione dell'espressione genica sia in termini di distribuzione tissutale e stadio di sviluppo. Protocolli sono descritti per l'uso di DESIDERIO di embrioni di zebrafish utilizzando RNA antisenso sonde marcate con digossigenina. Le sonde sono generati da incorporare nucleotidi digoxigenin-linked attraverso la trascrizione in vitro su modelli genetici che sono stati clonati e linearizzato. Le chorions di embrioni raccolte a stadi di sviluppo definiti vengono rimossi prima dell'incubazione con sonde specifiche. A seguito di una procedura di lavaggio per rimuovere la sonda in eccesso, gli embrioni vengono incubate con anticorpo anti-digossigenina coniugata con fosfatasi alcalina. Impiegando un substrato cromogenico della fosfatasi alcalina, specifica espressione genica può essere valutata. A seconda del livello di espressione genica l'intera procedura può essere completata entro 2-3 giorni.

Introduction

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello animale potente per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, la malattia, il comportamento, e in-droga screening di 1-3. Zebrafish embrioni possono essere ottenuti in gran numero da un singolo incrocio. Fecondazione e sviluppo si verifica ex utero e gli embrioni otticamente chiare sviluppano rapidamente. Eventi critici evolutivi si verificano durante le prime 48 ore dopo la fecondazione (HPF). Ciò include la comparsa di organo primordi e l'avvio di citodifferenziazione. Knockdown o sovra-espressione di proteine ​​può essere raggiunto attraverso la microiniezione di embrioni con antisenso morfolino (MO) oligonucleotidi o mRNA rispettivamente nella fase uno o due celle (0,75 HPF).

Il desiderio di embrioni di zebrafish facilita lo studio della espressione spazio-temporale di specifici geni di interesse. Applicazione della tecnica WISH dopo microiniezione di embrioni con mRNA o MO a un eccesso di express o livelli di proteine ​​specifiche atterramento rivela regolazione differenziale di altri geni.

Cambiamenti nei modelli di espressione genica possono essere correlati con i cambiamenti fenotipici e rivelano la funzione di geni bersaglio durante la prima organogenesi. Poiché sonde possono essere preparate e conservate in anticipo, la tecnica ISH può essere applicata a rivelare modelli di espressione genica per almeno 20 geni per volta utilizzando piastre a sei pozzetti e cestini misura.

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Protocol

1. Tutto il montaggio ibridazione in situ su embrioni di zebrafish

1.1 Preparazione di embrioni

  1. Raccogliere gli embrioni in fase di sviluppo necessari. Si prega di consultare Kimmel et al. 5 per la descrizione embrionale.
  2. Rimuovere chorions manualmente usando pinze (Dumont Orologiai forcipe no. 5).
  3. Fissare embrioni in una soluzione al 4% di paraformaldeide (PFA) costituito in PBS (Phosphate Buffered Saline) notte a 4 ° C.
  4. Lavare con PBS embrioni almeno 3x per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
  5. Conservare embrioni in 100% di metanolo (MeOH) a -20 ° C fino al momento per la futura applicazione di tecniche tra cui tutto il montaggio di ibridazione in situ.
  6. Fermo in scena embrioni in azoto liquido per l'estrazione di RNA e conservare a -80 ° C.
  7. Estrarre RNA da embrioni in scena e sintetizzare cDNA per l'amplificazione PCR e successiva clonazione.
  8. 1.2 Sintesi di sonde di RNA digossigenina-etichettati

    1. Amplificazione PCR e clonaggio del gene per modello sonda. Dell'impostazione della reazione di PCR con un volume totale di 50 microlitri come mostrato nella Tabella 1. Utilizzare più DNA genomico o cDNA meno nella reazione PCR come modello. Includere 10 min Tempo di estensione a 72 ° C dopo l'ultimo ciclo di assicurarsi che i prodotti di reazione PCR sono integrali e 3 'adenylated per facilitare la clonazione TOPO.
    Reattivo Volume
    DNA stampo 100 ng
    PCR Buffer (10x) 5 microlitri
    dNTP (10 mM) 2 microlitri
    Primer (10 mm) 1 pM ciascuno
    Aggiungere acqua ad un volume finale di 49,7 ml
    Taq polimerasi (5 unità / & #956; l) 0,3 microlitri
    Volume di reazione 50 microlitri

    Tabella 1. Reazione di amplificazione PCR.

    1. Verificare la dimensione del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. La dimensione stimata del prodotto di PCR per la sintesi della sonda è vicino a 1 kb.
    2. Prestare particolare attenzione per evitare la contaminazione nucleasi effettuando l'esperimento in condizioni sterili e utilizzando acqua priva di nucleasi. Nel caso in cui si osservano più prodotti, gel-purificare il prodotto di PCR opportunamente dimensionato prima di procedere con la clonazione utilizzando il TOPO TA Cloning Kit. Ottimizzare la reazione PCR per eliminare la comparsa di macchie e bande multiple.
    3. Eseguire la reazione clonazione TOPO come indicato nella Tabella 2. Combina TOPO Vector e PCR prodotto e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    Reattivo Le cellule chimicamente competenti Electro Cellule competenti Prodotto fresco reazione PCR 1-4 microlitri 1-4 microlitri Salt Solution 1 microlitri Soluzione salina diluita 1 microlitri Acqua Fino al volume di 5 ml totale Fino al volume di 5 ml totale TOPO vettore 1 microlitri 1 microlitri Volume finale 6 pl 6 pl

    Tabella 2. Reazione clonazione TOPO.

    1. Incorporare / introdurre il prodotto clonazione TOPO in uno cellule competenti colpo. Tsuo processo è chiamato trasformazione.
    2. Incubare le cellule trasformate a 37 ° C per almeno 1 ora a 260 rpm per garantire l'espressione dei geni di resistenza agli antibiotici. Piastra del mix di trasformazione (50-100 ml) di preriscaldata Luria Bertani (LB) piastre di agar contenenti 50 mg / ml di ampicillina e X-gal Incubare a 37 ° C per una notte.
    3. Determinare la presenza dell'inserto base di aspetto di bianco o chiaro colonie blu. Il vettore TOPO contiene lacZ gene che codifica la β-galattosidasi. In presenza di X-gal, produzione di β-galattosidasi forma colore blu. DNA ligato nel plasmide disturba la formazione di β-galattosidasi e nero colonie sono prodotti funzionali. Colonie bianche o colonie azzurre confermano la presenza dell'inserto.
    4. Scegli le colonie bianche dalla piastra di agar con puntali sterili e metterli nella sterile 10 tubo ml contenente 4 ml di media e cultura LB a 37 ° C in agitazione incubazionetor notte a 200 giri al minuto.
    5. Purificare il DNA plasmidico utilizzando kit DNA plasmidico secondo l'istruzione fabbricanti.
    6. Linearizzare cDNA seguente purificazione plasmide da digestione di 5 pg di cDNA per ogni sonda con l'enzima di restrizione appropriato che ha un sito unico situato 3 '(per sonde di senso) o 5' (per sonde antisenso) per l'inserto.
    7. Purificare il DNA linearizzato utilizzando il metodo di estrazione fenolo / cloroformio. Aggiungere uguale volume di fenolo centrifuga / cloroformio, vertice vigorosamente per 30 secondi, per 3 min a 13.000 rpm a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa superiore in provetta pulita e aggiungere uguale volume di cloroformio. Spin per 3 min a 13.000 rpm a 4 ° C. Trasferire fase superiore acquosa in provetta pulita. Aggiungere 10% di acetato di sodio (3 M) e il volume di 2,5 x 100% di etanolo al DNA precipitato e conservare a -20 ° C per una notte. Spin per 15 min a 13.000 rpm a 4 ° C. Eliminare l'etanolo e lavare il pellet con etanolo al 75%. Il protocollo può essere fermato e il DNA può essere stORed a -20 ° C e riprende il giorno successivo. Spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e asciugare il pellet per 2 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 10 ml di acqua trattata DEPC e incubare a 55 ° C per 20 min. Quantificare concentrazione di DNA utilizzando lo spettrofotometro UV.
    8. Valutare la purezza mediante elettroforesi in gel di agarosio utilizzando 1 ml di DNA su gel di agarosio 1% e funzionante per circa 30 min.
    9. Impostare reazione di marcatura dell'RNA. L'utilizzo di un flaconcino di reazione libero RNase, aggiungere 1-5 microgrammi di DNA purificato modello da sterile, priva di RNasi, DEPC trattati, acqua bidistillata per un volume di 13 microlitri. Raffreddare il flaconcino di reazione su ghiaccio e aggiungere i seguenti reagenti (vedi tabella 3):
    Reattivo Volume
    NTP etichettatura miscela (10x) 2 microlitri
    Trascrizione appassionatoer (10x) 2 microlitri
    Protector RNase Inhibitor 1 microlitri
    RNA polimerasi SP6 o
    RNA polimerasi T7 2 microlitri
    Volume finale 20 microlitri

    Tabella 3. Reazione di marcatura dell'RNA.

    1. Miscelare il reagente delicatamente raccogliere quindi inferiormente da breve centrifugazione a 2000 rpm per 30 secondi a temperatura ambiente e incubare la miscela di reazione per 2 ore a 37 ° C.
    2. Rimuovere il DNA modello aggiungendo 2 microlitri RNasi-free DNasi I. Incubare per 30 min a 37 ° C e interrompere la reazione aggiungendo 2 microlitri 0,2 M EDTA (pH 8,0).
    3. Precipitare i prodotti di reazione con l'aggiunta di 2,5 microlitri 4 M LiCl e 75 microlitri di etanolo al 100%. Miscelare la soluzione e conservare a -20 ° C per 45 min or conservato a -20 ° C durante la notte e il protocollo di ripresa il giorno successivo.
    4. Centrifugare la sospensione per 30 min a 13.000 rpm a 4 ° C, quindi lavare il pellet con 500 microlitri 70% di etanolo conservato a -20 ° C, centrifugare per altri 10 min, secco per 2 min, e risospendere in 50 microlitri e incubare a 30 min a 37 ° C.
    5. Verificare la qualità e l'integrità della sonda eseguendo 1-2 ml a 1% gel per circa 30 min. Ciò è confermato dalla presenza del singolo prodotto funziona alla dimensione prevista sul gel.
    6. Quantificare la concentrazione della sonda misurando la quantità di RNA mediante spettrofotometro. La resa di questa reazione è di circa 10 mg di RNA (100-200 ng / ml).

    1.3 Whole-mount ibridazione in situ

    1. GIORNO 1
      1. Reidratazione
        1. Preparare cestini con rete di nylon (inferiore a 1 mm dimensione dei pori) e provette Eppendorf. Costruire le ceste da Cutting provette Eppendorf (1,5 ml) per rimuovere le estremità coniche. Per identificare singoli cestelli utilizzano diversi tubi colorati e rimuovere la parte superiore cerchioni da metà di loro.
        2. Tagliare piccoli pezzi di maglia di nylon per coprire le estremità tagliate delle provette Eppendorf. Attaccare le estremità tagliate dei tubi per la rete di nylon riscaldando loro su una piastra calda elettrica (impostato tra medio alta) in una cappa aspirante. Una volta raffreddata rimuovere la rete di nylon eccesso dai cestelli e memorizzarli in 100% di metanolo a temperatura ambiente.
        3. Preparare diluizioni successive di metanolo in PBS (75% [vol / vol [metanolo, 50% [vol / vol] metanolo e il 25% [vol / vol] metanolo) utilizzando i primi tre pozzetti delle piastre a sei pozzetti seguiti da 100% PBST (tampone fosfato salino contenente 0,1% di Tween-20) nei prossimi tre pozzi.
        4. Embrioni soggetti a in situ la procedura di ibridazione con i cesti su misura come indicato in Figurea 1a e b. Utilizzare soluzioni RNase-free fino al ibridazionezione passo in piastre da 6 pozzetti (4 ml / pozzetto). Per ottenere questo, collocare fino a 6 cestelli nel primo pozzetto. Luogo cesto con orlo primo seguito da canestri senza bordi in diversi colori disposti consecutivamente. Usando questa disposizione fino a 6 modelli di espressione genica può essere determinato simultaneamente.
        5. Collocare embrioni disidratati dello stesso stadio di sviluppo allo stesso cestello (vedi Figura 1).
        6. Reidratare embrioni spostando cesti da un pozzetto nella piastra a sei ben al successivo (5 min per ogni passaggio). Utilizzare sei pozzi pieni di tampone appropriato. Embrioni sono sottoposti a ciascuna diluizione volta. In questo modo gli embrioni vengono lavate 6x, 5 min / lavaggio. Reidratazione degli embrioni disidratati viene ottenuto sostituendo metanolo con PBS e poi lavando 3x con il 100% PBST.
      2. Permeabilizzazione Digest gli embrioni reidratato con proteinasi K (10 pg / ml) a temperatura ambiente per renderli permeabili come mostrato in Tabella 4 Stadio embrionale (ore dopo la fecondazione) Periodo Digestione (proteinasi K) Fino a 6 15 sec 6-12 30 sec 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min

        Tabella 4. Reazione Permeabilizzazione.

      3. Postfixation e PBST lavaggi
        1. Fix embrioni incubando in paraformaldeide al 4% (peso / vol) in 1x PBS per 20 min.
        2. Rimuovere paraformaldeide residua lavando embrioni 3x, 5 min / lavaggio, in PBST 1x.
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      4. Acetilazione Preparare la miscela di acetilazione (125 trietanolammina ml e 27 ml di anidride acetica in 10 ml di DDH 2 O) e gli embrioni incubare due volte per 10 minuti ciascuno. Per ridurre al minimo l'attività della fosfatasi endogena, preparare la miscela di acetilazione fresco quando richiesto. Per rimuovere i reagenti in eccesso, lavare gli embrioni due volte in PBST (10 min / lavaggio)
      5. Prehybridization Prehybridize embrioni con il trasferimento di embrioni da cesti di 1,5 ml provette Eppendorf sterili e incubare con 200 microlitri miscela di ibridazione per 2-4 ore in un bagno d'acqua ° C 70.
      6. Preadsorption di anticorpo Rimuovere circa 50 embrioni dai canestri e trasferirli su un ml provette Eppendorf sterili 1.5. Incubare con anti-DIG-AP (1:500) anticorpo usando tampone di bloccaggio (1x PBST, 2% siero di vitello [vol / vol], 2 mg / ml di BSA [BSA]) a temperatura ambiente per 2-4 ore, e poi conservare a 4 ° C durante la notte. Togliere dal termostato del mattino und consentono embrioni a temperatura ambiente.
      7. Ibridazione Aggiungere 100-200 ng di sonda agli embrioni prehybridized e incubare una notte a 70 ° C in bagno d'acqua.
    2. GIORNO 2
      1. SSC (Citrato Saline-sodio) lavaggi
        1. Trasferire 50 ml tubi dei miscela di ibridazione (HM), 2x SSC e 0.2x SSC in un becher con acqua in un bagno d'acqua ° C 70 e li preriscaldare per almeno 20 min. Rimuovere la miscela di reazione di ibridazione contenente la sonda, aggiungere 1 ml di miscela di ibridazione preriscaldato ad le provette e incubare per 15 min a 70 ° C. Riempire piastre a sei pozzetti con varie diluizioni di preriscaldata HM in 2x SSC sostituendo 100% HM attraverso 50% al 25% HM per rimuovere i reagenti in eccesso.
        2. Durante l'attesa, riempire piastre a sei pozzetti con 2x SSC per lavaggi e tenerli a 70 ° C.
        3. Dopo 15 min luogo gli embrioni dal tubo verso le ceste conservati nella piastra ben sei riempito con la diluiziones di HM con 2x SSC e lavare gli embrioni ibridizzati spostando il cestello da un pozzetto all'altro (15 min ciascuno in un bagno d'acqua ° C 70). Lavare gli embrioni 2x, 15 min / ciclo di lavaggio, in 100% 2x SSC a 70 ° C.
        4. Impostare un altro bagno di acqua a 65 ° C. Riempire piastre a sei pozzetti con 0.2x SSC per alta stringenza lava per evitare ibridazione aspecifica di trascrizione con la sonda.
        5. Dopo che gli embrioni vengono lavati due volte con 2x SSC a 70 ° C, seguite due ulteriori lavaggi in 30 min 0.2x SSC a 65 ° C.
      2. PBST lavaggi Preparare piatti a sei pozzetti con diluizioni successive di 0.2x SSC in PBST come segue: 75% (vol / vol) 0.2x SSC, 50% (vol / vol) 0.2x SSC, 25% (vol / vol) 0.2x SSC, e il restante due pozzi con il 100% PBST. Lavare gli embrioni ibridizzati spostando il cestello da un pozzetto all'altro (5 min per ogni passaggio a temperatura ambiente utilizzando un bilanciere).
      3. Preincubazione embrioni Preincubare per 3-4 ore a temperatura ambiente in blocking tampone (1x PBST, 2% siero di vitello [vol / vol], 2 mg / ml BSA).
      4. Incubazione con anticorpo anti-DIG embrioni Incubare con una soluzione di anti-DIG-AP anticorpo (1:5.000) in tampone di bloccaggio notte a 4 ° C con agitazione.
    3. GIORNO 3
      1. PBST lavaggi Preparare i piatti a sei pozzetti con 4 ml / pozzetto PBST. Lavare embrioni incubate spostando i cestelli nella piastra di sei pozzetti contenenti PBST 6x per periodi di 15 min. Gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C e il protocollo di ripresa il giorno successivo.
      2. Prestaining Prestain gli embrioni di 2x lavaggio per 15 min con prestaining tampone a temperatura ambiente agitando leggermente prima dell'incubazione in presenza di BCIP (fosfato 5-bromo-4-cloro-3-indolil) e NBT (tetrazolio). BCIP e NBT sono i substrati utilizzati per lo sviluppo del colore della fosfatasi alcalina. Dal momento che le sonde sono attaccati con fosfatasi alcalina the sviluppo di colore viola indica l'espressione del gene bersaglio. Gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C e il protocollo di ripresa il giorno successivo.
      3. Colorazione
        1. Incubare gli embrioni a temperatura ambiente al buio con BCIP e NBT per 30 min.
        2. Monitorare la reazione di colorazione ogni 30 minuti utilizzando uno stereomicroscopio. Tempi di reazione variano da 15 min-16 ore a seconda del livello di espressione genica. I tempi di reazione sono più brevi per i geni altamente espressi e più a lungo per i geni espressi debolmente. Sonde sense rileveranno segnali se il gene di interesse esprime antisenso complementare (AS) trascritti.
      4. Viene raggiunto interrompere reazione dopo l'intensità di colorazione desiderata, arrestare la reazione trasferendo ceste contenenti gli embrioni pozzetti contenenti la soluzione di stop (1x PBS, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Questo eviterà ulteriore sviluppo del colore. Sciacquare embrioni per 10 min 2x su un bilanciere con delicata agitation a temperatura ambiente.
      5. Postfixation
        1. Incubare gli embrioni in paraformaldeide al 4% (peso / vol) in PBS per 20 min.
        2. Lavare gli embrioni (5 min / lavaggio) tre volte con PBST per rimuovere paraformaldeide residuo. Conservare gli embrioni fissi in soluzione di arresto al buio a 4 ° C.
      6. Di montaggio, di osservazione e acquisizione di immagini
        1. Trasferire gli embrioni ad una piastra di sei pozzetti contenenti glicerolo 100% utilizzando l'eventuale volume minimo di PBS. Posizionare la piastra di sei bene su una sedia a dondolo e agitare delicatamente la notte a temperatura ambiente al buio.
        2. Mettere gli embrioni in 100% glicerolo e poi osservare il segnale allo stereomicroscopio.
        3. Acquisire immagini e salvare come formato TIFF o qualsiasi altro tipo che permette la produzione di immagini di alta qualità attraverso l'uso di software di immagini come Photoshop (figure 3-6).

    I n ibridazione in situ

    1. Per ottenere un doppio etichettare il metodo sopra descritto dal 1.1 - 1.3.1.7 è usato ma include incubazione simultanea sia digossigenina e fluoresceina sonde marcate durante l'ibridazione.
    2. Seguire la stessa procedura per la post ibridazione lava cioè SSC e PBST lavaggi (passi 1.3.2.1 e 1.3.2.2) e le incubazioni bloccanti (passo 1.3.2.3). Eseguire reazioni anticorpali e colorazione in sequenza, come descritto di seguito.
    3. Incubare gli embrioni con anticorpo AP-coupled-anti-digossigenina (1:5.000) a 4 ° C con agitazione.
    4. Lavare e incubare con BCIP-NBT (gradini 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
    5. Seguendo rilevamento, lavare due volte con PBST embrioni a temperatura ambiente per 20 min.
    6. Incubare embrioni a 65 ° C in PBST con 1 mM EDTA per 30 minuti per inattivare l'anticorpo anti-digossigenina.
    7. Incubare embrioni in metanolo 100% seguito da reidratazione nel 75%, 50% e 25% metanolo ingegnoh PBST e di nuovo a PBST per 1 ora.
    8. Incubare gli embrioni durante la notte con la AP-coupled fluoresceina (1:2.000) in tampone di bloccaggio a 4 ° C con agitazione.
    9. Lavare embrioni con PBST (passo 1.3.3.1) e pre-embrioni macchia due volte per 15 min con tampone di pre-colorazione (0.1 M Tris-HCl, pH 8,2) a temperatura ambiente agitando leggermente prima dell'incubazione in presenza di rosso veloce . Protocollo può essere fermato e gli embrioni possono essere conservati a 4 ° C con agitazione e riprende il giorno successivo.
    10. Sciogliere una compressa Red veloce in 2 ml di colorazione tampone immediatamente prima dell'uso.
    11. Avviare la reazione di colorazione mettendo embrioni nel buffer di colorazione con Fast reagente rosso.
    12. Arrestare la reazione di colorazione quando si raggiunge l'intensità di colorazione desiderata. Si può richiedere da poche ore a temperatura ambiente per uno o due giorni durante la notte, quando la colorazione a 4 ° C. Fermare la reazione immediata se l'intensità di colorazione non si sviluppa ulteriormente o inizia a mostrare non specificolità rispetto al senso di controllo.
    13. Seguire le procedure descritte in precedenza per i passaggi rimanenti e cioè la fissazione postale, di montaggio, di osservazione e di acquisizione delle immagini (steps1.3.3.5 e 1.3.3.6).

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Representative Results

Utilizzando il protocollo con 50 embrioni per cesto (per gene / per condizione sperimentale) il pattern di espressione di tale gene può essere ottenuto in un esperimento. Quasi tutti gli embrioni presentano profili di espressione simili per un gene particolare. Esempi rappresentativi di ibridazione in situ colorazione sono mostrati nelle Figure 3-6.

Sia il senso e anti-senso ribosonde stati sintetizzati dai cDNA corrispondenti a PC5.1 PC5.2, 6, 7, SCL/tal-1 gata-1 8,9, FLK / kdrl 10, shh 11, dlx2 12, fkd7 / FOXA1 13, 14,15 insulina, tripsina e 16 sono stati costruiti amplificando un segmento del mRNA full-length usando Taq DNA polimerasi, e clonato in pCRII-TOPO (Invitrogen). L'autenticità dei singoli ampliconi è stata confermata mediante sequenziamento. Dopo la verifica dell'orientamento clone, corrispondenti ribosonde antisenso sono stati sintetizzatiutilizzando i protocolli 17 con modifiche 18,19 come qui descritte utilizzando sia la Sp6 o T7 RNA polimerasi. Fasi coinvolte in tutto il montaggio ibridazione in situ vengono brevemente illustrate in Figura 2. Viola colorazione osservata dopo ibridazione con riboprobe di interesse rappresenta sia l'abbondanza e siti di espressione del gene particolare. Per esempio PC5.1 mostra un'espressione molto discreta all'interno della parte anteriore e posteriore della vescicola otica e linea primordio laterale al 24hpf ed è fortemente localizzati entro i neuromasti linea laterale anteriore e posteriore da 72 HPF (Figura 3). Contrariamente PC5.2 spettacoli espressione ubiquitaria nel SNC con regionalizzazione distinto all'interno somiti, vescicola otica e condotto pronephric ed è altamente espresso nel fegato e nell'intestino a 96 HPF (Figura 4). Assenza di espressione genica utilizzando rispettivi riboprobes senso serve da controllo negativo. ( 4b). Analisi di espressione di marcatori del sangue hanno mostrato colorazione SCL/tal-1 all'interno delle cellule cranici bilaterali e nella massa cellulare intermedia (ICM). Anche se la colorazione per gata-1 è anche visto nel ICM il pattern di espressione è diverso. L'espressione di FLK / kdrl stata osservata entro hindbrain, principali e intersegmentale vasi e nella ICM (Figura 5). La colorazione per shh è stato osservato nel notocorda (Figura 5). L'espressione di dlx2 a 34 hpf è localizzato nella telencefalo, diencefalo, l'ipotalamo e cranici archi ectomesenchymal e l'espressione fkd7/foxa1 a 24 HPF è visto soprattutto nel piatto piano e hypochord. Pattern di espressione dei marcatori pancreatici mostravano colorazione insulina nel pancreas endocrino e tripsina nel pancreas esocrino (Figura 6). Questi risultati mostrano pattern di espressione con alta risoluzione rappresenta il successo del protocollo descrittoper la rilevazione dell'espressione di entrambi i geni abbondanti alta e bassa. Per ulteriori immagini chiarezza può essere preso usando la microscopia confocale dopo il montaggio degli embrioni su un vetrino da microscopio 20. Alcuni degli esempi dei risultati ottenuti durante la sperimentazione è stata effettuata, in condizioni sub-ottimali durante l'ottimizzazione del protocollo sono mostrati in figura 7. Segnale di alta sfondo con scarsa espressione di Shh è stato notato sotto permeabilizzazione inadeguata e ibridazione tra 55-60 ° C.

Figura 1
Figura 1. Preparazione e utilizzo di Eppendorf-nylon cestelli a rete per tenere in scena embrioni. Un bene può contenere sei Eppendorf-nylon cestelli a rete. L'immagine mostra le piastre sterili 6 pozzetti contenenti sei Eppendorf-nylon cestelli a reteutilizzato per diluizioni successive di metanolo in PBS.

Figura 2
Figura 2. Diagramma che mostra i passaggi necessari per il tutto il montaggio in tecnica di ibridazione in situ. Dopo fissazione in scena embrioni possono essere conservati in metanolo a -20 ° C fino all'uso. Le sonde possono essere sintetizzati in anticipo e conservati a -80 ° C. Memorizzazione di sonde in piccole aliquote è consigliabile, se si vuole utilizzare per lunghi periodi. In generale tutto il montaggio in esperimenti di ibridazione in situ può essere completato in 3 o 4 giorni. La reazione di colorazione per i geni espressi debolmente ci vorranno fino a 16 ore a temperatura ambiente o più a lungo quando la reazione di colorazione è effettuata a 4 ° C Clicca qui per ingrandire fIGURA.

Figura 3
Figura 3. L'espressione di PC5.1 da tutto il montaggio nelle analisi di ibridazione in situ è stato effettuato con 24 HPF e 72 HPF in scena embrioni. (A) Vista laterale di 24 HPF embrioni mostrano un'espressione molto discreta PC5.1 all'interno anteriore e parte posteriore della vescicola otica e linea primordio laterale che utilizza PC5.1 antisenso riboprobe. Al 72 HPF colorazione specifica è stata osservata nei neuromasti linea laterale anteriore e posteriore. (B) Assenza di espressione genica utilizzando PC5.1 senso riboprobe serve come controllo negativo. Clicca qui per ingrandire la figura .

gether.within-page = "always"> Figura 4
Figura 4. Alle 24 HPF e 96 HPF tutto il montaggio nelle analisi di ibridazione in situ di PC5.2 è stata effettuata utilizzando PC5.2 anti-senso e ribosonde senso. (A) Vista laterale di 24 HPF embrioni mostrano espressione ubiquitaria all'interno del sistema nervoso centrale, somiti vescicola otica e condotto pronephric. Colorazione specifica nel fegato e intestino è visto a 96 HPF utilizzando PC5.2 antisenso riboprobe. (B) Assenza di espressione genica utilizzando PC5.2 senso riboprobe serve come controllo negativo. Clicca qui per ingrandire la figura .

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. Figura 5 Whole-mount in analisi di ibridazione in situ a 24 HPF utilizzando SCL/tal-1 riboprobe mostrava colorazione all'interno delle cellule cranici bilaterali e nella massa cellulare intermedia (ICM), Gata-1 riboprobe colorazione è visto nel ICM; la flk espressione / kdrl all'interno del cervello posteriore, principale, e vasi intersegmentale e l'ICM. La colorazione per shh è stato osservato nel notocorda.

Figura 6
. Figura 6 Whole-mount in analisi di ibridazione in situ a 34 HPF utilizzando dlx2 riboprobe rivelato espressione dlx2 nel telencefalo, diencefalo, l'ipotalamo, e cranici archi ectomesenchymal; l'espressione fkd7/foxa1 a 24 HPF è visto soprattutto nel piano ptardi e hypochord; colorazione insulina è osservata nel pancreas endocrino ed espressione tripsina nel pancreas esocrino.

Figura 7
Figura 7. Permeabilizzazione adeguata e appropriata temperatura di ibridazione sono fondamentali per una chiara in segnali di ibridazione in situ. Tutto il montaggio nelle analisi di ibridazione in situ a 24 HPF e 48 HPF utilizzando un riboprobe shh rivelato espressione all'interno della notocorda e fondello senza segnale di fondo, quando gli embrioni sono permeabilizzate da digestione con proteinasi K per 12-15 min e ibridato a 70 ° C. Pattern di espressione incompleti e segnali di fondo alti sono stati osservati quando gli embrioni sono stati sottoposti a digestione insufficiente (5 min trattamento con proteinasi K) o ibridato a bassa temperatura (60 ° C). Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Abbiamo sviluppato metodi migliori per visualizzare l'RNA con alta risoluzione. Il nelle procedure di ibridazione in situ sono effettuate utilizzando semplici cesti su misura con fondi porosi (Figura 1). Gli embrioni sono trattati con soluzioni RNase-free in piastre da 6 pozzetti a temperatura ambiente in condizioni sterili.

Per segregare gli embrioni cestini sono realizzati in diversi tubi colorati Eppendorf. Cestini con o senza cerchio vengono utilizzati per una facile orientamento e di identificare gli embrioni all'interno del cestello come corrispondente ad una particolare sonda.

Prehybridization a 65 ° C e ibridazione a 70 ° C con 50% formammide deionizzata è risultato essere particolarmente importante per ottenere segnali ad alta risoluzione. Inoltre incubando embrioni due volte con tampone Tris alcalina per 15 min alberino PBST lava dopo incubazione con anticorpo anti-DIG e prima dell'incubazione in presenza di BCIP eNBT facilita la comparsa di segnali chiari di alta qualità. Nelle nostre mani abbiamo sperimentato che la permeabilizzazione e fissaggio di embrioni per il tempo ottimale e ibridazione a 70 ° C erano molto critico per ottenere segnali chiari. Permeabilizzazione inadeguata produce segnali ad alta sfondo. Permeabilizzazione estesa o di fissaggio inadeguato provocato il degrado di embrioni mentre fissaggio estesa inibito il rilevamento del segnale. Ibridazione tra 55-60 ° C producono anche segnali di fondo alti (Figura 7).

La sonda senso rileverà un segnale per la trascrizione AS se il gene di interesse codifica antisenso (AS) trascritti. Dopo la reazione di colorazione viene arrestata ponendo embrioni in metanolo per 30 minuti o più converte il segnale ad un vero colore viola, e rimuove la colorazione non specifica. Embrioni fisse possono essere conservati al buio in soluzione di stop a 4 ° C per diversi mesi.

I vantaggi e disadvantages di DESIDERIO

Desiderio è una tecnica efficace per caratterizzare sia l'espressione temporale e spaziale dei geni target durante l'embriogenesi e stadi larvali. Questo protocollo permette anche la visualizzazione di espressione dell'RNA dei due geni o co-localizzazione di RNA e proteina espressione al tempo stesso utilizzando opportune modifiche a seconda degli obiettivi sperimentali. Questo protocollo alta risoluzione può essere usato per rilevare l'espressione di RNA in molti tessuti e tipi di cellule. Può essere usato per la rivelazione di specie molto basse di RNA abbondanti con minime segnali di sfondo. Tuttavia, per visualizzare l'espressione precisa di geni all'interno di scomparti interni di tessuti richiede l'ibridazione in situ utilizzando sezioni di tessuto.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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