Hohe Auflösung Ganze Berge
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden durch

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

Dieser Artikel konzentriert sich auf whole-mount in situ Hybridisierung (WISH) von Zebrafisch Embryonen. Der Wunsch-Technologie erleichtert die Beurteilung der Genexpression sowohl in Bezug auf Verteilung im Gewebe und Entwicklungsstadium. Protokolle sind für die Nutzung der Wunsch Zebrafischembryonen Verwendung von Antisense-RNA-Sonden mit Digoxigenin beschrieben. Die Sonden werden durch den Einbau von Digoxigenin-linked Nukleotide durch in vitro-Transkription von Gen-Vorlagen, die geklont wurden und linearisiert generiert. Die Chorions von Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien geerntet werden, bevor die Inkubation mit spezifischen Sonden entfernt. Nach einem Waschvorgang, überschüssige Sonde zu entfernen, werden Embryonen mit anti-Digoxigenin-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase inkubiert. Durch die Verwendung eines chromogenen Substrat für alkalische Phosphatase kann Genexpression zu beurteilen. Abhängig von der Höhe der Genexpression das gesamte Verfahren kann innerhalb 2-3 Tagen abgeschlossen sein.

Introduction

Der Zebrafisch (Danio rerio) als leistungsfähige Tiermodell für die Untersuchung der Entwicklung von Wirbeltieren, Krankheiten, Verhalten entstanden, und in-Wirkstoff-Screening 1-3. Zebrafisch-Embryonen können in großer Zahl aus einer einzigen Kreuzung erreicht werden. Befruchtung und Entwicklung tritt ex utero und die optisch klar Embryonen schnell zu entwickeln. Critical Entwicklungsstörungen Ereignissen während der ersten 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf). Dazu gehören das Auftreten von Organprimordien und die Einleitung cytodifferentiation. Knockdown oder Überexpression von Proteinen durch die Mikroinjektion von Embryonen mit Antisense-Morpholino (MO) Oligonukleotiden oder mRNA, die jeweils an der einen oder zwei Zell-Stadium (0,75 HPF).

Der Wunsch Zebrafischembryonen erleichtert die Untersuchung der räumlich-zeitliche Expression spezifischer Gene von Interesse. Anwendung des Wunsches Technik nach Mikroinjektion von Embryonen mit mRNA oder MO über-express oder Knockdown spezifische Protein-Ebene zeigt differentielle Regulation anderer Gene.

Veränderungen in der Genexpression Muster können mit phänotypische Veränderungen korreliert werden und zeigen die Funktion der Zielgene während der frühen Organogenese. Seit Sonden hergestellt und gelagert werden im Voraus, können die ISH-Technik angewendet, um die Genexpression Muster für mindestens 20 Gene zeigen in einer Zeit mit Sechs-Well-Platten und maßgefertigt Körbe werden.

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Protocol

1. Whole-mount in situ Hybridisierung von Zebrafisch-Embryonen

1.1 Herstellung von Embryonen

  1. Sammeln Embryonen bei den erforderlichen Entwicklungsstadien. Bitte sehen Kimmel et al. 5 für embryonalen Stadium Beschreibung.
  2. Entfernen Chorions manuell mit einer Pinzette (Dumont Uhrmacher Pinzetten keine. 5).
  3. Fix Embryonen in einem 4% igen Paraformaldehyd (PFA) in PBS hergestellt (Phosphate Buffered Saline) über Nacht bei 4 ° C.
  4. Waschen mit PBS Embryonen mindestens 3x für jeweils 5 min bei Raumtemperatur gerührt.
  5. Shop Embryonen in 100% Methanol (MeOH) bei -20 ° C bis für die künftige Anwendung von Techniken, einschließlich whole-mount in situ Hybridisierung verwendet.
  6. Einfrieren inszeniert Embryonen in flüssigem Stickstoff zur RNA-Extraktion und bei -80 ° C
  7. Auszug aus RNA inszeniert Embryonen und synthetisieren cDNA für die PCR-Amplifikation und anschließende Klonierung.
  8. 1.2 Synthese von Digoxygenin-markierten RNA-Sonden

    1. PCR-Amplifikation und Klonierung von Genen für Sonde Vorlage. Setup-PCR-Reaktion mit einem Gesamtvolumen von 50 ul, wie in Tabelle 1 gezeigt. Verwenden Sie mehr genomische DNA oder weniger cDNA in der PCR-Reaktion als Matrize. Fügen Sie 10 min Verlängerung Zeit bei 72 ° C nach dem letzten Zyklus, um sicherzustellen, dass die PCR-Reaktionsprodukte in voller Länge und 3 'in Ordnung zu adenylierte TOPO-Klonierung zu erleichtern.
    Reagenz Volume
    Template DNA 100 ng
    PCR-Puffer (10x) 5 ul
    dNTPs (10 mM) 2 ul
    Primer (10 mM) 1 uM jeweils
    Wasser hinzu, bis ein Endvolumen von 49,7 ul
    Taq-Polymerase (5 Einheiten / & #956; l) 0,3 ul
    Reaction Volume 50 ul

    Tabelle 1. PCR-Amplifikation Reaktion.

    1. Überprüfen Sie die Größe des PCR-Produkts mit Agarosegelelektrophorese. Die geschätzte Größe des PCR-Produkts für Sonde Synthese ist in der Nähe von 1 kb.
    2. Achten Sie besonders darauf Nuklease Kontamination durch Durchführung des Versuchs unter sterilen Bedingungen und mit Nuklease freiem Wasser zu vermeiden. In dem Fall, dass mehrere Produkte beobachtet werden, Gel-Reinigung des entsprechend dimensionierten PCR-Produkt, bevor mit Klonen unter Verwendung des TOPO TA Cloning Kit. Optimieren Sie die PCR-Reaktion, um das Aussehen von Verschmieren und mehrere Bänder zu beseitigen.
    3. Führen des TOPO Cloning Reaktion wie in Tabelle 2 angegeben. Kombinieren TOPO Vektor und PCR-Produkt und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
    Reagenz Chemisch kompetente Zellen Electro Kompetente Zellen Frisches PCR Reaktionsprodukt 1-4 ul 1-4 ul Salzlösung 1 ul Das verwässerte Salzlösung 1 ul Wasser Bis zu Gesamtvolumen von 5 ul Bis zu Gesamtvolumen von 5 ul TOPO-Vektor 1 ul 1 ul Endgültiges Volumen 6 ul 6 ul

    Tabelle 2. TOPO Cloning Reaktion.

    1. Integrieren / Einführung der TOPO-Klonierung Produkt in einem Schuss kompetenten Zellen. Tseinen Prozess wird als Transformation bezeichnet.
    2. Inkubieren der transformierten Zellen bei 37 ° C für mindestens 1 h bei 260 rpm, um die Expression der Antibiotika-Resistenzgene gewährleisten. Platte der Transformation Mix (50-100 ul) auf vorgewärmten Luria Bertani (LB)-Agarplatten mit 50 ug / ml Ampicillin und X-gal Bei 37 ° C über Nacht.
    3. Bestimmen Sie die Anwesenheit des Inserts am Auftreten von weißen oder hellblauen Kolonien bezogen. Die TOPO Vektor enthält lacZ-Gen, die β-Galactosidase kodiert. In Gegenwart von X-gal bildet Herstellung von β-Galactosidase-blaue Farbe. DNA in das Plasmid stört die Bildung von funktionellen β-Galactosidase und weiße Kolonien ligiert hergestellt werden. Weiße Kolonien oder hellblaue Kolonien bestätigen das Vorhandensein des Einsatzes.
    4. Wählen Sie die weiße Kolonien von der Agarplatte mit sterilen Pipettenspitzen und legen Sie sie in das sterile 10 ml Röhrchen mit 4 ml LB Medien und Kultur bei 37 ° C im Inkubator geschüttelttor über Nacht bei 200 Umdrehungen pro Minute.
    5. Entschlacken Plasmid-DNA unter Verwendung von Plasmid DNA Kit nach Anweisungen des Herstellers.
    6. Linearisieren cDNA folgenden Plasmidreinigung durch Verdauen 5 ug cDNA für jede Sonde mit dem geeigneten Restriktionsenzym, das eine einzigartige, angeordnet 3 '(für Sense-Sonden) oder 5' (für Antisense-Sonden) zum Einsatz hat.
    7. Reinigen Sie die linearisierte DNA mit der Phenol / Chloroform-Extraktion-Methode. In gleichen Volumen Phenol / Chloroform Scheitelpunkt kräftig für 30 sec, Spin für 3 min bei 13.000 rpm bei 4 ° C. Die obere wässrige Phase in ein sauberes Gefäß und fügen gleichen Volumen Chloroform. Spin für 3 min bei 13.000 rpm bei 4 ° C. Die obere wässrige Phase in sauberes Röhrchen. In 10% Natriumacetat (3 M) und 2,5-fache Volumen 100% Ethanol ausgefällt DNA und bei -20 ° C über Nacht. Spin für 15 min bei 13.000 rpm bei 4 ° C. Ethanol entfernen und waschen das Pellet mit 75% Ethanol. Das Protokoll kann gestoppt werden und DNA kann st werdenverodert bei -20 ° C und wieder am nächsten Tag. Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und trocknen Sie das Pellet für 2 min bei Raumtemperatur. Das Pellet in 10 ul DEPC behandeltem Wasser und Inkubation bei 55 ° C für 20 min. Quantifizierung DNA-Konzentration mit Hilfe der UV-Spektralphotometer.
    8. Bewerten Sie die Reinheit durch Agarosegelelektrophorese mit 1 ul DNA auf einem 1% Agarosegel und läuft für ca. 30 min.
    9. Einrichten RNA Kennzeichnung Reaktion. Mit einem RNase freien Reaktionsphiole, fügen Sie 1-5 ug gereinigte DNA-Vorlage, um sterile, RNase-frei, DEPC-behandelten, doppelt destilliertem Wasser auf ein Volumen von 13 ul. Kühlen Sie das Reaktionsgefäß auf Eis und fügen Sie die folgenden Reagenzien (siehe Tabelle 3):
    Reagenz Volume
    NTP Markierungsmischung (10x) 2 ul
    Transkription BuffER (10x) 2 ul
    Schutz RNase-Inhibitor 1 ul
    RNA-Polymerase SP6 oder
    RNA Polymerase T7 2 ul
    Endgültiges Volumen 20 ul

    Tabelle 3. RNA Kennzeichnung Reaktion.

    1. Mischen des Reagenz leicht sammeln dann nach unten durch kurze Zentrifugation bei 2000 Upm für 30 sec bei Raumtemperatur und Inkubation des Reaktionsgemisches für 2 Stunden bei 37 ° C.
    2. Entfernen Sie die Template-DNA durch Zugabe von 2 ul RNase-freie DNase I. Inkubation für 30 min bei 37 ° C und stoppe die Reaktion durch Zugabe von 2 ul 0,2 M EDTA (pH 8,0).
    3. Fällung der Reaktionsprodukte durch Zugabe von 2,5 ul 4 M LiCl und 75 ul 100% Ethanol. Mischen Sie die Lösung und halten bei -20 ° C für 45 min or bei -20 ° C über Nacht und das Protokoll wieder am nächsten Tag.
    4. Zentrifugieren Sie die Suspension für 30 min bei 13.000 rpm bei 4 ° C, dann waschen Sie die Pellets mit 500 ul 70% Ethanol bei -20 ° C, Zentrifuge für weitere 10 min, trocken für 2 min gespeichert und Resuspension in 50 ul und Inkubation 30 min bei 37 ° C.
    5. Überprüfen Sie die Sonde Qualität und Integrität, indem Sie 1-2 ml auf 1% Agarosegel für ca. 30 min. Dies wird durch die Anwesenheit von einzelnen Produkt läuft auf der erwarteten Größe auf dem Gel bestätigt.
    6. Quantifizierung der Konzentration der Sonde durch Messung der Menge von RNA unter Verwendung Spektralphotometer. Die Ausbeute bei dieser Reaktion ist etwa 10 ug RNA (100-200 ng / ul).

    1.3 Whole-mount in situ Hybridisierung

    1. TAG 1
      1. Rehydrierung
        1. Bereiten Körben mit Nylon-Mesh-(weniger als 1 mm Porengröße) und Eppendorf-Röhrchen. Konstruieren Sie die Körbe nach cutting Eppendorf Röhrchen (1,5 ml) zu entfernen, die konischen Enden. Zur Identifizierung einzelner Körbe verwenden verschiedene farbige Rohre und entfernen Sie die obere Felgen von Hälfte von ihnen.
        2. Schneiden Sie kleine Stücke von Nylon-Mesh, um die abgeschnittenen Enden der Eppendorf-Röhrchen zu decken. Haften der geschnittenen Enden der Rohre mit dem feinmaschiges durch Erhitzen auf einer elektrischen Heizplatte (Set zwischen mittlerem bis hohem) in einem Abzug. Nach dem Abkühlen entfernen Sie das überschüssige feinmaschiges aus den Körben und speichern sie in 100% Methanol bei Raumtemperatur.
        3. Aus dieser Lösung werden Verdünnungen von Methanol in PBS (75% [Vol / Vol [Methanol, 50% [v / v] Methanol und 25% [v / v] methanol) mit den ersten drei Vertiefungen der Platten mit sechs Vertiefungen gefolgt von 100% PBST (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20) in den nächsten drei Brunnen.
        4. Betreff Embryonen in situ Hybridisierung die Prozedur mit den maßgeschneiderten Körbe wie in 1a und b Figurea gezeigt. Verwenden RNase-freie Lösungen bis zur Hybridisierungschritt in 6-Well-Platten (4 ml / Vertiefung). Um dies zu erreichen, stellen bis zu 6 Körbe in der ersten Wanne. Platz Korb mit Felge zuerst von Körben ohne Felgen in verschiedenen Farben nacheinander angeordneten gefolgt. Unter Verwendung dieser Anordnung bis zu 6 Genexpressionsmuster gleichzeitig bestimmt werden.
        5. Zeigen dehydriert Embryonen der gleichen Entwicklungsstufe zu den gleichen Korb (siehe Abbildung 1).
        6. Rehydrieren Embryonen indem Körbe aus man gut in den Sechs-Well-Platte auf die nächste (5 min für jeden Schritt). Mit sechs Bohrungen mit geeigneten Puffer gefüllt. Die Embryonen werden auf jeder Verdünnung unterzogen einmal. Auf diese Weise Embryonen 6x, 5 min / Wäsche gewaschen. Rehydratisierung der dehydrierten Embryos durch Ersetzen Methanol mit PBS gewaschen und dann durch Waschen mit 100% PBST 3x erreicht.
      2. Permeabilisierungs Digest die rehydriert Embryonen mit Proteinase K (10 ug / ml) bei Raumtemperatur, um sie durchlässig zu machen, wie in Tabelle 4 dargestellt Embryonale Stadium (Stunden nach der Befruchtung) Verdauung Zeitraum (Proteinase K) Bis zu 6 15 sec 6-12 30 sec 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min

        Tabelle 4. Permeabilisierungs Reaktion.

      3. Nachfixierung und PBST Washes
        1. Fix Embryonen durch Inkubation in 4% Paraformaldehyd (wt / vol) in 1x PBS für 20 min.
        2. Rückstände von Paraformaldehyd durch Waschen Embryonen 3x, 5 min / waschen, in 1x PBST.
        </ Li>
      4. Acetylierung vorbereiten Acetylierungsgemisch (125 ul Triethanolamin und 27 ul Essigsäureanhydrid in 10 ml ddH 2 O) und Inkubation Embryonen zweimal für jeweils 10 Minuten. Um endogene Phosphatase-Aktivität zu minimieren, bereiten die Acetylierungsgemisch frisch, wenn erforderlich. Um überschüssiges Reagenz zu entfernen, waschen Embryonen zweimal in PBST (10 min / Waschgang)
      5. Prähybridisierung Prehybridize Embryonen durch die Übertragung von Embryonen aus Körben bis 1,5 ml sterile Eppendorf-Röhrchen und Inkubation mit 200 ul Hybridisierung Mischung für 2-4 Stunden in einem 70 ° C Wasserbad.
      6. Voradsorption der Antikörper entfernen etwa 50 Embryonen aus den Körben und übertragen Sie sie auf einem 1,5 ml sterile Eppendorf-Röhrchen. Inkubieren mit Anti-DIG-AP (1:500) Antikörper mit Blocking-Puffer (1x PBST, 2% Kälberserum [vol / vol], 2 mg / ml Rinderserumalbumin [BSA]) bei Raumtemperatur für 2-4 Stunden, und dann bei 4 ° C über Nacht speichern. Entfernen Sie aus dem Inkubator in der Früh eind ermöglichen Embryonen auf Raumtemperatur zu erreichen.
      7. Hybridisierung 100-200 ng Sonde an die vorhybridisierten Embryonen und Inkubation über Nacht bei 70 ° C im Wasserbad.
    2. TAG 2
      1. SSC (Saline-Natrium-Citrat) Wäscht
        1. Platz 50 ml Röhren der Hybridisierungsmischung (HM), 2x SSC und 0,2 × SSC in ein Becherglas mit Wasser in einem 70 ° C Wasserbad und Vorwärmen sie für mindestens 20 min. Entfernen Sie die Hybridisierung Reaktionsgemisch, das die Sonde, 1 ml vorgewärmten Hybridisierungsgemisch zu den Rohren und Inkubation für 15 min bei 70 ° C. Füllen Sechs-Well-Platten mit verschiedenen Verdünnungen von vorgewärmtem HM in 2x SSC indem HM 100% bis 50% bis 25% HM um überschüssige Reagenzien zu entfernen.
        2. Während des Wartens, füllen sechs-Well-Platten mit 2x SSC für Waschungen und halten sie bei 70 ° C
        3. Nach 15 min erfolgt die Embryonen aus der Tube auf die Körbe gehalten in den sechs Well-Platte mit der Verdünnung gefüllts von HM mit 2x SSC und waschen Sie die hybridisierten Embryonen, indem Sie den Korb aus man gut auf die nächste (je 15 min in einem 70 ° C Wasserbad). Waschen Embryonen 2x, 15 min / waschen, in 100% 2x SSC bei 70 ° C.
        4. Stellen Sie noch Wasserbad bei 65 ° C Füllen Sechs-Well-Platten mit 0,2 x SSC mit hoher Stringenz wäscht unspezifische Hybridisierung Transkript mit der Sonde zu vermeiden.
        5. Nachdem die Embryonen zweimal mit 2x SSC bei 70 ° C gewaschen, folgen zwei weitere 30 min in 0,2 x SSC Wäschen bei 65 ° C.
      2. PBST Wash Vorbereiten sechs-Well-Platten mit aufeinanderfolgende Verdünnungen von 0,2 × SSC in PBST wie folgt: 75% (vol / vol) 0,2 × SSC, 50% (vol / vol) 0,2 × SSC, 25% (vol / vol) 0.2x SSC, und die restlichen zwei Vertiefungen mit 100% PBST. Waschen der hybridisierten Embryonen, indem Sie den Korb aus man gut auf die nächste (5 min für jeden Schritt bei Raumtemperatur mit einer Wippe).
      3. Vorinkubation vorinkubieren Embryos für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur in blocking-Puffer (1x PBST, 2% Kälberserum [vol / vol], 2 mg / ml BSA).
      4. Inkubation mit Anti-DIG-Antikörper inkubieren Embryonen mit einer Lösung von Anti-DIG-AP-Antikörper (1:5000) in Blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
    3. TAG 3
      1. PBST Washes Bereiten Sie die Sechs-Well-Platten mit 4 ml / well PBST. Waschen bebrüteten Embryonen, indem die Körbe in der Sechs-Well-Platte mit PBST 6x für die Dauer von 15 min. Embryonen können bei 4 ° C gelagert werden und das Protokoll wieder am nächsten Tag.
      2. Prestaining Prestain die Embryonen durch Waschen 2x 15 min mit prestaining Puffer bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln vor der Inkubation in Gegenwart von BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat) und NBT (Nitroblautetrazolium). BCIP und NBT sind die Substrate für die Farbentwicklung der alkalischen Phosphatase-Aktivität verwendet. Seit Sonden werden mit alkalischer Phosphatase th befestigte Entwicklung der purpurroten Farbe zeigt die Expression des Ziel-Gens. Embryonen können bei 4 ° C gelagert werden und das Protokoll wieder am nächsten Tag.
      3. Färbung
        1. Inkubieren Embryonen bei Raumtemperatur im Dunkeln mit BCIP und NBT für 30 min.
        2. Überwachen Sie die Farbreaktion alle 30 min mit einem Stereomikroskop. Die Reaktionszeiten hängen von 15 min-16 h in Abhängigkeit von der Höhe der Genexpression. Die Reaktionszeiten sind kürzer für stark exprimierte Gene und mehr für schwach exprimierter Gene. Sense-Sonden erkennt Signale, wenn das Gen von Interesse bekundet komplementären Antisense (AS)-Transkripte.
      4. Stoppreaktion Nach der gewünschten Intensität der Färbung erreicht wird, stoppen Sie die Reaktion durch die Übertragung von Körben, die die Embryonen in die Vertiefungen mit dem Stop-Lösung (1x PBS, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Dadurch wird vermieden, Weiterentwicklung der Farbe. Spülen Embryonen für 10 min 2x auf einer Wippe mit sanften agitation bei Raumtemperatur.
      5. Nachfixierung
        1. Inkubieren Sie die Embryonen in 4% Paraformaldehyd (wt / vol) in PBS für 20 min.
        2. Waschen Sie die Embryonen (5 min / Waschgang) dreimal mit PBST, um restliche Paraformaldehyd zu entfernen. Bewahren Sie die fixierte Embryonen in Stop-Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
      6. Montage, Beobachtung und Bildaufnahme
        1. Übertragen Sie die Embryonen auf ein Sechs-Well-Platte mit 100% Glycerin mit der minimal möglichen Volumen von PBS. Legen Sie die Sechs-Well-Platte auf einer Wippe und sanft über Nacht rühren bei Raumtemperatur in der Dunkelheit.
        2. Zeigen Embryonen in 100% Glycerin und dann beobachten, das Signal unter einem Stereomikroskop.
        3. Bilder erfassen und speichern als Tiff-Datei-Format oder jede andere Art, die die Produktion von qualitativ hochwertigen Bildern ermöglicht durch den Einsatz von Image-Software wie Photoshop (Abbildungen 3-6).

    I n-Situ-Hybridisierung

    1. Um dies zu erreichen doppelten Kennzeichnung der oben beschriebenen Methode aus 1.1 beschrieben - 1.3.1.7 verwendet wird, enthält aber gleichzeitige Inkubation sowohl Digoxygenin und Fluorescein markierten Sonden während der Hybridisierung.
    2. Folgen Sie dem gleichen Verfahren für die Post-Hybridisierung wäscht nämlich SSC und PBST Wäschen (Schritte 1.3.2.1 und 1.3.2.2) und die Blockierung Inkubationen (Schritt 1.3.2.3). Führen Antikörper und Verfärbung nacheinander wie unten beschrieben.
    3. Inkubieren Embryonen mit AP-gekoppelten-Anti-Digoxigenin-Antikörper (1:5000) bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
    4. Waschen und Inkubation mit BCIP-NBT (Schritte 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
    5. Nach Erkennung, waschen Embryonen zweimal mit PBST bei Raumtemperatur für 20 min.
    6. Inkubieren Embryonen bei 65 ° C in PBST mit 1 mM EDTA für 30 min, um die anti-Digoxigenin-Antikörper zu inaktivieren.
    7. Inkubieren Embryonen in 100% Methanol durch Rehydratation in 75%, 50% und 25% Methanol, gefolgt with PBST und zurück für 1 Stunde PBST.
    8. Inkubieren Embryonen über Nacht mit AP-gekoppelten Fluorescein (1:2000) in Blocking-Puffer bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
    9. Waschen Embryonen mit PBST (Schritt 1.3.3.1) und Pre-Fleck Embryonen 2 mal für 15 min mit Pre-Färbung (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln vor der Inkubation in Gegenwart von Fast Red . Protokoll kann gestoppt werden und Embryonen können gespeichert werden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln und wieder am nächsten Tag.
    10. Lösen Sie eine Fast Red Tablette in 2 ml Färbepuffer unmittelbar vor dem Gebrauch.
    11. Starten Sie den Färbereaktion indem Embryonen im Färbepuffer mit Fast Red Reagenz.
    12. Stoppen Sie die Farbreaktion, wenn die gewünschte Farbintensität erreicht ist. Es kann von einigen Stunden bei Raumtemperatur auf ein oder zwei Tage dauern, wenn über Nacht Färbung bei 4 ° C. Stoppen der Reaktion sofort, wenn die Intensität der Färbung nicht weiter entwickeln oder beginnt zu zeigen unspezifischekeit, wenn der Sinn Kontrolle verglichen.
    13. Folgen Sie den Anweisungen oben für die verbleibenden Schritte nämlich Fixierung Beitrag skizziert, Montage-, Beobachtungs-und Bildaufnahme (steps1.3.3.5 und 1.3.3.6).

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Representative Results

Verwendung des Protokolls mit 50 Embryos pro Korb (pro Gen / pro experimentellen Bedingungen) die Expression dieses Gens in einem Experiment erreicht werden kann. Fast alle Embryonen zeigen ähnliche Expressionsmuster für ein bestimmtes Gen. Repräsentative Beispiele für die in-situ-Hybridisierung Färbung sind in den Figuren 3-6 gezeigt.

Sowohl der Sinn und anti-sense Ribosonden wurden aus den entsprechenden cDNAs PC5.1, PC5.2 6, 7 SCL/tal-1, GATA-1 8,9, FLK / kdrl 10, sch 11, 12 DLX2, fkd7 synthetisiert / FOXA1 13 wurden 14,15 Insulin, Trypsin und 16 durch Amplifikation eines Segments des Volllängen-mRNA unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase konstruiert und kloniert in pCRII-TOPO (Invitrogen). Die Authentizität der einzelnen Amplikons wurde durch Sequenzierung bestätigt. Nach Überprüfung des Klons Orientierung wurden entsprechende Antisense Ribosonden synthetisiertmit Hilfe der Protokolle 17 mit Modifikationen 18,19 wie hier beschrieben entweder mit dem SP6 oder T7-RNA-Polymerasen. Die Schritte in whole-mount in situ Hybridisierung beteiligt sind kurz in Abbildung 2 dargestellt. Lila-Färbung nach Hybridisierung mit Ribosonde von Interesse beobachtet stellt sowohl die Fülle und die Websites der Expression von bestimmten Gens. Zum Beispiel zeigt sehr diskret PC5.1 Ausdruck im vorderen und hinteren Teil des otic Vesikel und seitliche Linie Primordium bei 24hpf und ist stark in den vorderen und hinteren seitlichen Linie Neuromasten von 72 hpf (Abbildung 3) lokalisiert. Im Gegensatz PC5.2 Shows ubiquitäre Expression im ZNS mit ausgeprägten Regionalisierung innerhalb der Somiten, otic Vesikel und pronephric Kanal und ist hoch in der Leber und im Darm bei 96 hpf (Abbildung 4) ausgedrückt. Abwesenheit der Genexpression in einem der jeweiligen Sinn-Ribosonden dient als negative Kontrolle. ( 4b). Expression Analysen von Blut Marker zeigte Färbung SCL/tal-1 innerhalb der bilateralen kranialen Zellen und in der Zwischen-Zellmasse (ICM). Obwohl die Färbung für GATA-1 ist auch in der ICM gesehen das Expressionsmuster ist anders. Die Expression von FLK / kdrl wurde im hindbrain, Haupt-und intersegmentalen Schiffen und im ICM (Abbildung 5) beobachtet. Die Färbung für SHH in der Chorda beobachtet wurde (Abbildung 5). Die Expression von DLX2 bei 34 hpf in die lokalisiert ist telencephalon, Zwischenhirn, dem Hypothalamus und Schädelbasis ektomesenchymale Bögen und die fkd7/foxa1 Expression bei 24 hpf ist vor allem in der Bodenplatte und hypochord gesehen. Expression Muster der Bauchspeicheldrüse Insulin Marker zeigte Färbung im endokrinen Pankreas und Trypsin im exokrinen Pankreas (Abbildung 6). Diese Ergebnisse zeigen, Expression mit einer hohen Auflösung stellt den Erfolg der beschriebenen Protokollfür den Nachweis der Expression von hohen und niedrigen reichlich Gene. Für weitere Klarheit Bilder können aufgenommen mit der konfokalen Mikroskopie nach der Montage die Embryonen auf einem Objektträger 20 werden. Einige der Beispiele der erzielten Ergebnisse, wenn das Experiment wurde unter suboptimalen Bedingungen während der Optimierung des Protokolls vorgenommen werden in Abbildung 7 dargestellt. Hohe Hintergrund Signal mit schlechter Shh Expression unter unzureichenden Permeabilisierung und Hybridisierung zwischen 55-60 ° C wurde festgestellt,

Abbildung 1
Abbildung 1. Herstellung und Verwendung von Eppendorf-Nylon-Mesh-Körbe zu halten inszeniert Embryonen. Ein gut halten kann sechs Eppendorf-Nylon-Mesh-Körbe. Das Bild zeigt die 6-well Platten mit sechs sterile Eppendorf-Nylon-Mesh-Körbeverwendet für aufeinanderfolgende Verdünnungen von Methanol in PBS.

Abbildung 2
Abbildung 2. Das Diagramm zeigt die Schritte in der whole-mount in situ Hybridisierung Technik beteiligt. Nach dem Fixieren inszeniert Embryonen in Methanol bei -20 ° C gelagert werden, bis verwendet. Probes können im Voraus synthetisiert werden und bei -80 ° C Speichern von Sonden in kleinen Portionen ist es ratsam, wenn sie über einen längeren Zeitraum verwendet werden. Im Allgemeinen whole-mount in situ Hybridisierungen in 3 oder 4 Tagen abgeschlossen. Die Farbreaktion für schwach exprimierter Gene dauert bis zu 16 Stunden bei Raumtemperatur oder länger, wenn die Farbreaktion wird bei 4 ° C durchgeführt Klicken Sie hier, um größere f ansehenBBILDUNG.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die Expression von PC5.1 von whole-mount in situ Hybridisierung Analysen wurde mit 24 hpf und 72 hpf inszeniert Embryonen durchgeführt. (A) Seitenansicht von 24 hpf Embryonen zeigen eine sehr diskrete Ausdruck PC5.1 im vorderen und hinteren Teil des otic Vesikel und seitliche Linie Primordium mit PC5.1 Antisense Ribosonde. Bei 72 hpf spezifische Färbung wurde in den vorderen und hinteren seitlichen Linie Neuromasten beobachtet. (B) Abwesenheit der Genexpression mit PC5.1 Sinn Ribosonde als negative Kontrolle dient. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

gether.within-page = "always"> Fig. 4
4. Bei 24 und 96 HPF HPF whole-mount in situ Hybridisierung Analysen PC5.2 wurde unter Verwendung PC5.2 Antisense-und Sense-Ribosonden durchgeführt. (A) Seitenansicht von 24 hpf Embryonen ubiquitäre Expression zeigen innerhalb des ZNS, Somiten otic Vesikel und pronephric Kanal. Die spezifische Markierung in der Leber und Darm bei 96 hpf mit PC5.2 Antisense Ribosonde gesehen. (B) Abwesenheit der Genexpression mit PC5.2 Sinn Ribosonde dient als negative Kontrolle. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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. Abbildung 5 Whole-mount in situ Hybridisierung Analysen bei 24 hpf mit SCL/tal-1 Ribosonde zeigte Färbung innerhalb der bilateralen kranialen Zellen und in der Zwischen-Zellmasse (ICM); gata-1 Ribosonde Färbung ist im ICM gesehen, die FLK / kdrl Ausdruck im hindbrain, Haupt-und intersegmentalen Schiffen und im ICM. Die Färbung für SHH wurde in der Chorda beobachtet.

Abbildung 6
. Abbildung 6 Whole-mount in situ Hybridisierung Analysen bei 34 hpf mit DLX2 Ribosonde ergab Ausdruck DLX2 im Telencephalon, Zwischenhirn, dem Hypothalamus und Schädelbasis ektomesenchymale Bögen, die fkd7/foxa1 Expression bei 24 hpf wird hauptsächlich in den Boden p gesehenspät und hypochord; Insulin Färbung im endokrinen Pankreas und Trypsin Ausdruck im exokrinen Pankreas beobachtet.

Abbildung 7
Abbildung 7. Angemessene Permeabilisierung und geeignete Hybridisierungstemperatur sind entscheidend für klare Signale in-situ-Hybridisierung. Whole-mount in situ Hybridisierung Analysen bei 24 hpf und 48 hpf mit einem sch Ribosonde ergab Ausdruck innerhalb der Chorda und Bodenplatte ohne Hintergrund-Signal, wenn Embryonen durch permeabilisert Proteinase K Verdauung für 12-15 min und hybridisiert bei 70 ° C. Unvollständige Expressionsmuster und hohe Hintergrund-Signale wurden beobachtet, wenn die Embryonen unzureichender Verdauung (5 min Proteinase-K-Behandlung) oder Hybridisierung bei niedriger Temperatur ausgesetzt waren (60 ° C). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Wir haben Methoden entwickelt, um eine verbesserte RNA mit hoher Auflösung sichtbar zu machen. Die in-situ-Hybridisierung Verfahren werden mit einfachen maßgeschneiderte Körbe mit porösen Böden (Abbildung 1). Die Embryonen werden unter Verwendung RNase-freien Lösungen in 6-Well-Platten bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen.

Zu trennen Embryonen Körbe sind aus verschiedenen farbigen Eppendorf-Röhrchen gemacht. Körbe mit oder ohne Rand sind für eine einfache Orientierung verwendet und die Embryonen in den Korb als die einer bestimmten Sonde zu identifizieren.

Prähybridisierung bei 65 ° C und Hybridisierung bei 70 ° C mit 50% deionisiertem Formamid wurde als besonders wichtig, um eine hohe Auflösung Signale zu erhalten. Zusätzlich Inkubieren Embryonen zweimal mit alkalischer Tris-Puffer für 15 min nach PBST wäscht nach Inkubation mit Anti-DIG-Antikörper und vor der Inkubation in Gegenwart von BCIP undNBT erleichtert das Aussehen von hochwertigen klare Signale. In unseren Händen haben wir erlebt, dass die Permeabilisierung und Fixierung der Embryonen für die optimale Zeit und Hybridisierung bei 70 ° C sehr kritisch bei der Beschaffung klare Signale waren. Unzureichende Permeabilisierung produziert hohe Hintergrund-Signale. Erweiterte Permeabilisierung oder unzureichende Befestigung in Folge des Abbaus von Embryonen während längere Fixierung gehemmt Signalerfassung. Hybridisierung zwischen 55-60 ° C produzierte auch hohe Hintergrund-Signale (Abbildung 7).

Die Sense-Sonde erkennt ein Signal für die AS-Transkript, wenn das Gen von Interesse kodiert Antisense-(AS)-Transkripte. Nachdem die Farbreaktion geben keine Embryonen in Methanol für 30 min oder länger das Signal in einem echten violette Farbe, und entfernt nicht-spezifischen Färbung. Feste Embryonen können in der Dunkelheit in Stop-Lösung bei 4 ° C werden für mehrere Monate gelagert.

Die Vorteile und disadvantages von WISH

Wunsch ist eine effiziente Technik, um sowohl die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen während der Embryogenese und Larvenstadien zu charakterisieren. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Visualisierung von RNA-Expression von zwei Genen oder die Co-Lokalisierung von RNA und Protein-Expression gleichzeitig mit geeigneten Modifikationen in Abhängigkeit von den experimentellen Ziele. Diese hohe Auflösung Protokoll kann verwendet werden, um RNA-Expression in vielen Geweben und Zelltypen zu erkennen. Es kann für die Detektion von sehr geringen reiche RNA-Spezies mit minimaler Hintergrund-Signale verwendet werden. Um jedoch genau die Expression von Genen in Innenräumen von Geweben visualisieren erfordert in situ Hybridisierung unter Verwendung von Gewebeschnitten.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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