एक कार्बनिक विलायक के इस्तेमाल के बिना Triclosan का प्रभाव: आरबीएल-2H3 मस्त सेल degranulation पर रासायनिक प्रभाव का आकलन करने के लिए एक microplate परख

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

मस्त सेल degranulation, एलर्जी मध्यस्थों की रिहाई, एलर्जी, अस्थमा, और परजीवी रक्षा में महत्वपूर्ण है. यहाँ हम degranulation पर दवाओं और विषैले पदार्थ के प्रभाव का आकलन करने के लिए तकनीक 1 का प्रदर्शन, कार्यप्रणाली हाल ही में जीवाणुरोधी एजेंट triclosan 2 के शक्तिशाली निरोधात्मक प्रभाव प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया.

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Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

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Abstract

मस्त कोशिकाओं एलर्जी रोग और परजीवी के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. एक बार (एक allergen द्वारा जैसे) सक्रिय है, वे degranulate, एक प्रक्रिया है कि एलर्जी मध्यस्थों के एक्सोसाइटोसिस में परिणाम है. दवाओं और विषैले पदार्थ से मस्तूल सेल degranulation की मॉड्यूलेशन मानव स्वास्थ्य पर सकारात्मक या प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है. मस्त सेल समारोह चूहे basophilic ल्यूकेमिया मस्तूल कोशिकाओं के उपयोग (आरबीएल-2H3), 3-5 मानव श्लैष्मिक मस्तूल कोशिकाओं की एक व्यापक रूप से स्वीकार मॉडल के साथ विस्तार से विच्छेदित कर दिया गया है. 6 मस्तूल कोशिकाओं से histamine के साथ मिलकर में रैखिक जारी की है जो मस्त सेल दाना घटक और एलर्जी मध्यस्थ β-hexosaminidase, आसानी से और मज़बूती से करने के लिए उत्तरदायी है कि एक microplate परख में औसत दर्जे का प्रतिदीप्ति तीव्रता उपज, एक fluorogenic सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया के माध्यम से मापा जा सकता है उच्च throughput पढ़ाई 1. मूलतः नाल एट अल. 1 द्वारा प्रकाशित, हम स्क्रीनिंग ओ के लिए इस degranulation परख ढाल लियाच दवाओं और विषैले पदार्थ और यहाँ इसके उपयोग के प्रदर्शन.

Triclosan कई उपभोक्ता उत्पादों में मौजूद है और इस आशय के लिए तंत्र अज्ञात है, हालांकि, मानव एलर्जी त्वचा रोग 7-11 में एक चिकित्सकीय सहायता होना पाया गया है कि एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक एजेंट है. यहाँ हम मस्तूल सेल degranulation पर triclosan के प्रभाव के लिए एक परख प्रदर्शित करता है. हमने हाल ही में triclosan जोरदार मस्तूल सेल समारोह 2 को प्रभावित करता है कि पता चला है. एक कार्बनिक विलायक के उपयोग से बचने के प्रयास में, triclosan गर्मी और सरगर्मी के साथ जलीय बफर में सीधे भंग कर रहा है, और उसके एवज में एकाग्रता 12280 = 4200 एल / एम / सेमी का उपयोग) यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करने की पुष्टि की है. इस प्रोटोकॉल, अधिक मोटे तौर पर उनके एलर्जी की संभावित मस्तूल सेल degranulation पर उनके प्रभाव का निर्धारण करने के लिए रसायनों की एक किस्म के साथ इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है, और.

Introduction

मस्त कोशिकाओं अत्यधिक अस्थमा में प्रमुख मध्यस्थों के रूप में सेवा है कि प्रतिरक्षा effector कोशिकाओं, एलर्जी, परजीवी रक्षा और carcinogenesis 13-16 दानेदार रहे हैं. Degranulate को सक्रिय जब तक वे सुरक्षित साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं में एलर्जी और सूजन मध्यस्थों की दुकान है, जहां वे लगभग हर vascularized ऊतक 15 में रहते हैं. Degranulation ऐसे हिस्टामाइन, tryptase, और leukotrienes 15 pharmacologically सक्रिय मध्यस्थों की रिहाई में जो परिणाम झिल्ली ही सीमित कणिकाओं की एक्सोसाइटोसिस है. प्रकार की दीक्षा में इस प्रक्रिया का परिणाम मैं परजीवी के खिलाफ रक्षा बढ़ते के साथ ही, एलर्जी दमा, और कासीनजन प्रतिक्रियाओं 15 की शुरुआत में महत्वपूर्ण हैं कि hypersensitivity प्रतिक्रियाओं.

मस्त कोशिकाओं और बेसोफिल FcεRI रिसेप्टर्स, immunoglobulin ई (IgE) 17 के लिए उच्च आत्मीयता रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं. एक allergen या प्रतिजन के संपर्क में कई आईजीई वाली FcεRI रिसेप्टर्स 17 के एकत्रीकरण का कारण बनता है, और यह इस s हैटाइरोसीन फास्फोरिलीकरण घटनाओं, आंतरिक दुकानों से phospholipase सी, कैल्शियम की तपका की सक्रियता, और सेल 18 में कैल्शियम की आमद के एक झरना: degranulation प्रक्रिया शुरू की है कि आईजीई वाली एफसी रिसेप्टर्स की "तिर्यक" ओ कहा जाता है. यह कैल्शियम बाढ़ degranulation के लिए आवश्यक है, और, आगे, दाना एक्सोसाइटोसिस 15 कारण पहले झिल्ली के साथ दाना संलयन का संकेत है. प्रयोगात्मक, एक कैल्शियम ionophore नदी के ऊपर जा रहा है या नीचे की ओर के रूप में एक विषैला द्वारा एक मार्ग लक्ष्य की पहचान के लिए अनुमति देता है, सीधे अनिवार्य रूप से सभी संकेत पारगमन कैल्शियम बाढ़ कदम 20 के लिए पहले कदम नजरअंदाज जो कोशिका झिल्ली 19 के पार, शटल कैल्शियम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कैल्शियम 20 संकेतन.

Degranulation हिस्टामाइन 6 साथ कणिकाओं से रैखिक जारी की है जो सेल तैरनेवाला, में β-hexosaminidase की रिहाई की निगरानी के द्वारा तेजी से और प्रभावी ढंग से मापा जा सकता, लेकिन मैंहै बहुत आसान परख फ्लोरोसेंट उत्पाद के लिए एक सरल एंजाइम सब्सट्रेट प्रतिक्रिया और एक microplate रीडर का उपयोग पता लगाने के लिए. के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत इस microplate परख,, द्वारा β-fluorogenic सब्सट्रेट की दरार 4 methylumbelliferyl-N-acetyl-β-डी glucosaminide quantifies जो मूल रूप से नाल एट अल द्वारा विकसित की है. एक मजबूत विधि 1, पर आधारित है hexosaminidase. Triclosan यहाँ पर प्रकाश डाला साथ हम दवाओं और विषैले पदार्थ का परीक्षण प्रभाव को परख संशोधित किया है. इस विधि मज़बूती degranulation quantifies, उदाहरण के लिए, प्रवाह cytometric आधारित तरीकों का पता लगाने 21, के लिए एक सस्ता विकल्प है, और विरोधी एलर्जी दवाओं की एक विस्तृत विविधता के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए अच्छी तरह से खुद को उधार देने की क्षमता है, साथ ही immunotoxic या एलर्जी रसायनों. यह पिछले अंक 21 वीं सदी में 2007 राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद की रिपोर्ट "विषाक्तता परीक्षण के प्रकाश में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है: एक दृष्टि और एक प्रारंभegy "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 चूहों जैसे पारंपरिक प्रयोगशाला पशुओं के महंगा उपयोग को कम करने के लिए सेल संस्कृति का उपयोग कि उच्च throughput विष विज्ञान परीक्षणों के विकास के लिए अधिवक्ताओं जो),. नाल एट अल. 1 द्वारा विकसित की है और हमें 2 से संशोधित degranulation प्रोटोकॉल, मुताबिक़ मानव श्लैष्मिक मस्तूल कोशिकाओं या बेसोफिल 3-5 करने के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार मॉडल है जो आरबीएल-2H3 सेल लाइन का इस्तेमाल करता है. (संवर्धन आरबीएल-2H3 कोशिकाओं के लिए तरीके हचिंसन एट अल में विस्तृत रहे हैं. 22). इस परख की संभावना किसी भी संलग्न मस्तूल सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Triclosan (टीसीएस) अस्पतालों, व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों, और उपभोक्ता वस्तुओं 23,24 में 30 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी है. टीसीएस के रोगाणुरोधी विशेषता के लिए कार्रवाई की विधा बाधा enoyl-एसाइल से अधिक संभावना है, फैटी एसिड biosynthesis के निषेध हैवाहक प्रोटीन रिडक्टेस 25,26. यह ऐसी जेल स्नान, हाथ लोशन, टूथपेस्ट, माउथवॉश, और 0.3% या 10 मिमी 24 से ऊपर सांद्रता में हाथ साबुन के रूप में उपभोक्ता उत्पादों की एक विस्तृत श्रृंखला में दुनिया भर में पाया जाता है. टीसीएस के व्यापक उपयोग मनुष्यों 27-29 में और नदियों और धाराओं 30 में detectable स्तर में हुई है. Allmyr एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन. 27 टीसीएस और इसके चयापचयों प्लाज्मा और नर्सिंग माताओं से दूध दोनों में मौजूद हैं कि प्रदर्शन किया. महत्वपूर्ण बात है, टीसीएस आसानी से त्वचा 31-37 में लीन है. Queckenberg एट अल. 37 मस्तूल कोशिकाओं रहते हैं जहां त्वचा में महत्वपूर्ण एकाग्रता, जिसके परिणामस्वरूप 12 घंटे के भीतर मानव त्वचा में एक ~ 70 मिमी टीसीएस क्रीम की ~ 10% अवशोषण पाया.

टीसीएस के मानव एलर्जी त्वचा रोग 7-11 प्रबंधन करने के लिए चिकित्सकीय दिखाया गया है, लेकिन टीसीएस एलर्जी त्वचा रोगों को दूर व्यवस्था है जिसके द्वारा 38 अज्ञात दिया गया है. फ्लोरोसेंट microplate परख detaile का प्रयोगघ इस वीडियो में, हम हाल ही में 2 माइक्रोन के रूप में कम सांद्रता में टीसीएस, काफी इन क्लिनिकल डेटा 2 के लिए एक संभावित व्याख्या उपलब्ध कराने, मस्तूल सेल समारोह और degranulation dampens कि प्रदर्शन किया. इन क्लिनिकल डेटा के लिए एक विवरण प्रदान करने के अलावा, पामर एट अल में हमारे निष्कर्ष बताते हैं. 2 टीसीएस कैल्शियम बाढ़ के बहाव संकेतन अणुओं है कि लक्ष्य का सुझाव है. कई प्रतिरक्षाविज्ञानी और अन्य जैविक प्रक्रियाओं में संकेत कैल्शियम के महत्व के कारण, टीसीएस संभावित आवश्यक जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता पर प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है. वास्तव में, Udoji एट अल. 39 टीसीएस एक और महत्वपूर्ण सहज प्रतिरक्षा समारोह, मानव प्राकृतिक हत्यारा सेल अपघट्य गतिविधि को दबा पता चला है कि.

एलर्जी त्वचा रोग (या, इसके विपरीत, एक immunotoxicant) के रूप में एक चिकित्सकीय सहायता के रूप में अपनी क्षमता से परे, टीसीएस भी disruptor 40-49 एक ​​endocrine हो सकता है. इस प्रकार, समाधान में इस रसायन तैयार करने के बारे में एक स्पष्ट प्रक्रिया मैंtoxicologists के लिए ब्याज की है. टीसीएस के एक छोटे हाइड्रोफोबिक अणु है, क्योंकि जैविक वाहनों अक्सर पानी में अधिक घुलनशील बनाने के लिए उपयोग किया जाता है. टीसीएस का परीक्षण किया गया है, जहां सबसे विषाक्तता अध्ययन में, तैयारी जैसे इथेनॉल, एसीटोन, या तेल 2,50,51 के रूप में एक कार्बनिक विलायक की सहायता से पानी में विघटन शामिल किया गया है. हालांकि, कई बार इन सॉल्वैंट्स बार इस तरह का परीक्षण रासायनिक डेटा 51 की व्याख्या उलझी, खुद को जैविक रूप से सक्रिय हैं. वास्तव में, Rufli एट अल के अनुसार. 52 और दूसरों को 53, यह जलीय विषाक्तता प्रयोगों के लिए परीक्षण समाधान विषाक्तता कलाकृतियों को बनाने के लिए रासायनिक विलायकों की क्षमता के कारण, रासायनिक तरीकों पर भौतिक तरीकों का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं की सिफारिश की है. हम पहले टीसीएस 0.24% इथेनॉल / पानी (/ खंड खंड) में भंग कर दिया और 30 मिनट dampens आरबीएल मस्तूल सेल degranulation 2 के लिए sonicated दिखाया है. 0.24% की तुलना में अधिक मात्रा में इथेनॉल मस्तूल सेल DEGRA को तर करने के लिए दिखाया गया हैnulation 54,55-उदाहरण विषाक्तता अध्ययन पर कार्बनिक विलायकों की संभावित confounding प्रभाव की.

इतना ही नहीं यह जीव या अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं पर विलायकों के प्रभाव पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी परीक्षण रासायनिक पर ही एक विलायक के प्रभाव पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, Skaare एट अल. 51 तेलों में विघटन समारोह का एक पूरा नुकसान का कारण बना है, जबकि पॉलीथीन ग्लाइकोल में टीसीएस (सामान्यतः टूथपेस्ट और माउथवॉश में पाया जाता है) भंग स्वस्थ महिला महिलाओं में एंटी बैक्टीरियल और विरोधी पट्टिका प्रभाव कमजोर हो पाया. इसलिए, विभिन्न विलायकों की क्षमता टीसीएस सहित, विषैला और दवा मिलाना, प्रभाव परख डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए. तेल या स्वाद additives के उपयोग के विभिन्न उत्पादों 50,51 में टीसीएस के प्रभाव के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.

कार्बनिक विलायकों का उपयोग करने की आवश्यकता को समाप्त करने के प्रयास में, हम एक कार्बनिक प के उपयोग को नष्ट करने से टीसीएस 2 भंग करने के लिए हमारे विधि पर सुधारउतारना. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम गर्मी (≤ 50 डिग्री सेल्सियस) के साथ जलीय बफर में सीधे टीसीएस कणिकाओं भंग, और तब यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा इस टीसीएस के शेयर की एकाग्रता को सत्यापित. टीसीएस 40 माइक्रोन (अप करने के लिए पानी में घुलनशील है क्योंकि ये सुधार संभव हैं http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) और 50 डिग्री सेल्सियस (पर गरम जब गिरावट का विरोध करने के लिए दिखाया गया है http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. टीसीएस भी दृढ़ता से 4200 एल / मोल सेमी / 12 के एक दाढ़ विलुप्त होने गुणांक के साथ 280 एनएम 58 को अवशोषित करने के लिए जाना जाता है के रूप में हम भी, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का जोड़ा लाभ है.

इस प्रोटोकॉल कम लागत और तेजी से सत्यापन सहित, एक कार्बनिक विलायक की सहायता के बिना एक बफर में टीसीएस कणिकाओं भंग करने के लिए एक सरल, अभी तक प्रभावी तरीका प्रदान करता हैएकाग्रता की, और मस्तूल सेल degranulation पर रासायनिक प्रभाव की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली फ्लोरोसेंट microplate परख का वर्णन करता है.

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Protocol

सभी बफर व्यंजनों प्रोटोकॉल पाठ के अंत में एक तालिका में शामिल हैं जो ध्यान दें.

दिन 1:

1. कक्ष की तैयारी

  1. बढ़त के प्रभाव से बचने के लिए लेआउट पर परीक्षण के नमूने एकत्रित करना, 96 अच्छी तरह से थाली सेटअप योजना बाहर योजना. आवंटित तीन प्रत्येक टीसीएस एकाग्रता परीक्षण (प्रतिजन या ionophore की ± degranulation उत्तेजक), और साथ ही triplicates सहज रिहाई के लिए (कोई degranulation उत्तेजक), अधिकतम रिलीज (0.2% ट्राइटन X-100 [टेक्सास] डिटर्जेंट सेल), साथ ही साथ के लिए replicates कुओं पृष्ठभूमि नमूने (कोई कोशिकाओं में शामिल होंगे जो) के लिए आरक्षित. प्रत्येक दोहराने प्रयोगात्मक दिन के लिए, टीसीएस नमूना सांद्रता की एक नई यादृच्छिक लेआउट चुनें.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म आरबीएल मीडिया (नुस्खा तालिका में प्रदान की) और trypsin.
  3. अच्छा चंगा के सामान्य लक्षण के लिए T-25 फ्लास्क में आरबीएल कोशिकाओं (2-4 पिछले पारित होने के बाद से दिन और वे thawed गया के बाद 3-4 महीने से भी कम) की जाँच करेंध: उचित मीडिया के रंग ने संकेत दिया पीएच, और बादल छाए हुए हैं की कमी है. कुप्पी संदूषण से मुक्त है और कोशिकाओं, ठीक से मिला हुआ स्वस्थ दिखाई देते हैं, और ज्यादातर जुड़ी पुष्टि करते हैं कि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कुप्पी रखें. कोशिकाओं mycoplasma संदूषण लगभग हर छह सप्ताह 22 के लिए जाँच की जानी चाहिए कि ध्यान दें.
उपचार Triplicates
उत्तेजित, 0 माइक्रोन टीसीएस उ 7, बी 7, सी 7, F4, जी -4, एच 4
उत्तेजित, 0.001 माइक्रोन टीसीएस F6, G6, H6
उत्तेजित, 0.1 माइक्रोन टीसीएस ए 4, बी 4, सी 4
उत्तेजित, 1 माइक्रोन टीसीएस ए 6, बी -6, सी 6
उत्तेजित, 5 माइक्रोन टीसीएस करें F5, g5, H5
उत्तेजित, 10 माइक्रोन टीसीएस ए 3, बी 3, सी 3
उत्तेजित, 15 माइक्रोन टीसीएस उ 5, बी 5, सी 5
उत्तेजित, 20 माइक्रोन टीसीएस G7 F7, H7
उत्तेजित, प्लस उच्चतम [टीसीएस] F3, जी 3, H3
सहज, कोई टीसीएस (mocks भी शामिल है) A10, A11, A12, B10, B11, बी 12 ए 1, ए 2, ए 8, बी 1, बी 2, बी 8, सी 1, सी 2, सी 8, F1, F2, F8, G1, G2, जी -8, H1, H2 H8
टेक्सास -100, कोई टीसीएस D10, D11, E10 डी 12, E11, E12
कोई सेल, पृष्ठभूमि, प्लस उच्चतम [टीसीएस] G10, G11, G12, H10, H11, H12

चित्रा 1
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  1. बाँझ टिशू कल्चर (टीसी) हुड में आरबीएल सेल कुप्पी लो. कोशिकाओं बॉट से जुड़े होते हैंकुप्पी की टॉम. टीसी हुड के तहत कार्य और मानक बाँझ तकनीक का उपयोग, बाँझ विंदुक के साथ कुप्पी से सभी मीडिया को हटाने, कोशिकाओं कुप्पी के नीचे से जुड़े रहते हैं. अगला, 2 मिलीलीटर trypsin के साथ फ्लास्क कुल्ला, तो इस धोने त्यागें.
  2. कुप्पी के नीचे कवर करने के लिए वास्तव में 2 मिलीलीटर trypsin जोड़ें. 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर कोशिकाओं कुप्पी के नीचे से अलग करने के लिए अनुमति देने के लिए 37 में डाल दिया.
  3. 5 मिनट के बाद, कोशिकाओं को ढीला करने के लिए एक खुली हथेली के साथ कुप्पी की ओर मारा. इसके तत्काल बाद, फ्लास्क बंद कोशिकाओं को धोने के लिए 18 मिलीलीटर आरबीएल मीडिया जोड़ने और trypsin बुझाने के लिए. तुरंत कुप्पी से बाहर सेल मीडिया trypsin मिश्रण लेने के लिए और एक नया, बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब (इस ट्यूब में कुल मात्रा अब 20 मिलीलीटर है) करने के लिए स्थानांतरण.
  4. धीरे लेकिन पूरी तरह मिश्रण के बाद, इस ट्यूब से सेल निलंबन के 50 μl हटाने, और गिनती करने के लिए एक नमूना है जो एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ microcentrifuge ट्यूब, के लिए स्थानांतरण. इस नमूने ले लो, साथ ही 50 मिलीलीटर0; benchtop को टीसी हुड की सेल मीडिया trypsin मिश्रण बाहर युक्त ट्यूब.
  5. 500 XG पर 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में 50 मिलीलीटर ट्यूब (उचित संतुलन के साथ) स्पिन, इस बल छर्रों कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से.
  6. स्पिन के समय के दौरान, कताई से पहले अलग थे कि नमूने में कोशिकाओं की गिनती. ऐसा करने के लिए, पहले 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं के 50 μl के लिए trypan नीले डाई के 50 μl जोड़ने, और धीरे लेकिन मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए नीचे 5x विंदुक ऊपर और. इसके तत्काल बाद, कांच hematocytometer के लिए इस मिश्रण की 10 μl हस्तांतरण, और निर्माता के निर्देशों का पालन ग्रिड क्षेत्र में कोशिकाओं की गिनती. उचित सांख्यिकीय परिणामों के लिए कम से कम 100 कोशिकाओं की गणना.
  7. पीछे टीसी हुड में, नीचे काता गया कि कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  8. सेल ट्यूब टोपी, और कोशिकाओं को ढीला करने के लिए ट्यूब के नीचे गोली झटका.
  9. कोशिकाओं की संख्या के आधार पर 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व उपज को trypsinized कोशिकाओं को मीडिया जोड़ें. चढ़ाना प्रक्रिया के दौरान निलंबित कोशिकाओं को रखने के लिए अच्छी तरह से लेकिन धीरे मिलाएं. एक Pipetman का प्रयोग, थाली टेम्पलेट चादर के बाद एक 96 अच्छी तरह से थाली (फ्लैट, काला नीचे) में अच्छी तरह / 100 μl कोशिकाओं डाला. कोशिकाओं के तीन कुओं में से प्रत्येक सेट के बाद व्यवस्थित त्रुटि, और मिश्रण से बचने के लिए कुएं में जोड़ा जाता है कैसे randomize जोड़ा जाता है. पृष्ठभूमि के नमूने लिए लेबल कुओं में कोशिकाओं डालने के लिए नहीं भूलें.
  10. एक बार सभी कोशिकाओं को हस्तांतरित किया गया है, थाली पर थाली ढक्कन जगह है, और रात भर (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2) इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण. मानक बाँझ तकनीक का पालन साफ.

दिन 2:

2. Triclosan की तैयारी

  1. लेबल एक 500 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में एक स्नातक सिलेंडर, उपाय 250 मिलीलीटर Tyrodes बफर (नुस्खा तालिका में प्रदान की) का प्रयोग "टीसीएस बफर." बार हलचल जोड़ें. टीसीएस के साथ प्रयोग के लिए ही नामित बार, थर्मामीटर हलचल, कांच के बने पदार्थ का प्रयोग करें.
  2. इसके अलावा इस समय, उपाय 250एक अलग 500 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में मिलीलीटर Tyrodes, लेबल "नियंत्रण बफर." का प्रयोग करें कांच के बने पदार्थ, बार, टीसीएस के लिए नामित नहीं कर रहे हैं कि थर्मामीटर हलचल. बार हलचल जोड़ें.
  3. टीसीएस कणिकाओं की 0.0022 ग्राम वजन और "टीसीएस-बफर" कुप्पी (250 मिलीलीटर Tyrodes बफर शामिल है) के लिए स्थानांतरण. कुशलतापूर्वक Erlenmeyer फ्लास्क को कणिकाओं का स्थानांतरण करने के लिए, सभी टीसीएस का तबादला कर दिया गया है, यकीन है कि नाव तौलना से धो मापा 250 मिलीलीटर Tyrodes से 10 मिलीलीटर का उपयोग करें.
  4. प्लेस 'टीसीएस-बफर "एक संयोजन hotplate / चुंबकीय हलचल थाली पर फ्लास्क, और यह एक manageably उच्च गति से हलचल करने के लिए सेट. एक बार अच्छी तरह से मिला, इस टीसीएस के शेयर नाममात्र 30 माइक्रोन (वास्तविक एकाग्रता हीटिंग के बाद की गणना की जाएगी) हो जाएगा. (एक रासायनिक धूआं हुड में सभी मिश्रण करते हैं.)
    1. इसके अलावा इस समय, एक दूसरे संयोजन hotplate / चुंबकीय हलचल थाली पर "नियंत्रण बफर" कुप्पी (कोई टीसीएस युक्त) जगह है, और एक समान गति से हलचल करने के लिए यह निर्धारित किया है.
  5. बाद में उपयोग के लिए दीपक को गर्म करने के लिए यूवी / विज़ लैंप पर बारी.
  6. लगातार उद्दीपक, जबकि 50 डिग्री सेल्सियस के लिए "टीसीएस-बफर" समाधान हीट. एक बार 90 मिनट के लिए तापमान, समय के लिए. 90 मिनट के दौरान, अक्सर 50 डिग्री सेल्सियस तापमान और उपयुक्त सरगर्मी गति की निगरानी जारी है.
    1. इसके साथ ही, डिग्री सेल्सियस निरंतर सरगर्मी के साथ 50 के लिए "नियंत्रण बफर" समाधान (सादा Tyrodes बफर के सिर्फ 250 मिलीलीटर है) गर्मी. 50 पर पहुंचने पर समय तापमान (50 डिग्री सेल्सियस पर रखने) और सरगर्मी निगरानी कर रहे हैं, जो दोनों के दौरान डिग्री सेल्सियस, 90 मिनट के लिए समय,.
  7. 90 मिनट के अंत में, गर्म प्लेटें और benchtop को हस्तांतरण बंद Erlenmeyer बोतल दोनों ले.
  8. रिक्त मशीन गरम "टीसीएस-बफर" समाधान के 1 मिलीलीटर स्कैनिंग से पहले गर्म "नियंत्रण बफर" समाधान के 1 मिलीलीटर पर, एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर तरंगदैर्ध्य स्कैन समारोह का उपयोग करना. एक, स्पेक्ट्रम के आकार की जाँच करें280 एनएम पर घ रिकॉर्ड Absorbance मूल्य. एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, बीयर-Lambert के समीकरण का उपयोग (ए 280 = ε 280 ℓ ग) एक ε का उपयोग कर 4200 के 280 एल / मोल सेमी / 12 और 1 सेमी की ℓ.
  9. टीसीएस एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद, जोड़ने 0.249 ग्राम गोजातीय (बीएसए) "टीसीएस-बफर" समाधान की शेष 249 मिलीलीटर के लिए, और अच्छी तरह से मिश्रण सीरम albumin.
    1. इसके साथ ही, "नियंत्रण बफर" समाधान की शेष 249 मिलीलीटर के लिए 0.249 ग्राम बीएसए जोड़ने, और अच्छी तरह मिलाएं.

दिन 2:

3. आरबीएल-2H3 कोशिकाओं का उपयोग एंटीजन उत्तेजित degranulation परख

  1. शुरू करने से पहले प्रयोग किया जा रहा सब buffers की पीएच की जाँच, और वे बादल स्पष्ट नहीं है और यह सुनिश्चित करें कि: इस Tyrodes बफर, सोडियम एसीटेट बफर, और ग्लाइसिन कार्बोनेट बफर (व्यंजनों तालिका में प्रदान की) शामिल हैं.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म आरबीएल मीडिया और trypsin.
  3. बीटी (1 मिलीग्राम / एमएल करें0; Tyrodes बफर में बीएसए): 0.05 ग्राम बीएसए + 50 मिलीलीटर Tyrodes बफर (x2). 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डाल दिया.
  4. बनाओ 0.2% ट्राइटन X-100: बीटी की 3.136 मिलीग्राम + के 64 μl 10% ट्राइटन X-100 (ट्राइटन X-100 0.2% है की अंतिम एकाग्रता). उलटा द्वारा अच्छी तरह मिक्स, लेकिन भंवर नहीं करते. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डाल दिया.
  5. . टीसीएस और गर्म Tyrodes बफर (चरण 2 "," ऊपर) नोट की तैयारी शुरू करें: "टीसीएस-बफर" और "नियंत्रण बफर" समाधान 50 डिग्री सेल्सियस और के लिए हलचल जब तक अगले कदम (आईजीई जोखिम) शुरू मत करो 90 मिनट गर्मी / सरगर्मी समय के पहले 70 मिनट.
  6. दोनों के समाधान 70 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हड़कंप मच गया है एक बार, (अच्छी तरह से 100 μl /) अवगत होने के लिए नमूना कुओं के लिए आरबीएल मीडिया में 0.1 ग्राम / एमएल विरोधी DNP माउस आईजीई (सिग्मा) बनाते हैं. 4 में संग्रहीत जब आईजीई स्टॉक 30 दिन से अधिक पुराना नहीं होना चाहिए डिग्री सेल्सियस, स्टॉक है कि कैसे पुराने रिकॉर्ड. मिश्रण करने के लिए झटका है, लेकिन भंवर नहीं आईजीई करते हैं.
  7. एक टीसी हुड के तहत,एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 6 मिलीग्राम आरबीएल मीडिया को 0.6 μl आईजीई शेयर (शेयर 1 मिलीग्राम / एमएल है) में जोड़ें. एक दूसरे 50 मिलीलीटर ट्यूब में, केवल सादे आरबीएल मीडिया (nonsensitized नमूने के लिए करना है जो) के 6 मिलीलीटर जोड़ें.
  8. सिंक में 96 अच्छी तरह से थाली (1 दिवस पर तैयार किया गया था कि) से सभी मीडिया डाल दो, और टीसी हुड के नीचे थाली ले आओ.
  9. बेतरतीब ढंग से 100 μl मीडिया / (48 कुओं सम्पूर्ण) को प्रेरित किया जाना चाहिए कि कुओं को आईजीई मिश्रण जोड़ें. इस मिश्रण "टेक्सास," और "पृष्ठभूमि" नमूने, "सहज" के लिए इरादा नहीं है.
  10. बेतरतीब ढंग से ही सहज "टेक्सास," "," और "पृष्ठभूमि" कुओं को 100 μl सादे आरबीएल मीडिया जोड़ें.
  11. थाली पर थाली ढक्कन रखो, और उसके बाद 1 घंटे के लिए 2/37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ में थाली ले जाएँ.
  12. 3.24-1 घंटे ऊष्मायन के दौरान कदम 3.13 पालन करें.
  13. Benchtop पर, प्रतिजन dilutions तैयार. 1.6 मिलीग्राम / एमएल शेयर DNP-बीएसए + 850 μl & # के 0.53 μl जोड़ें160, बीटी 1 ग्राम / एमएल के एक प्रतिजन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए. भंवर और मिश्रण करने के लिए इस शेयर पलटना.
  14. एक बार "टीसीएस-बफर" और "नियंत्रण बफर" गर्म कर दिया गया है और उसके बाद 50 बजे 90 मिनट के लिए हड़कंप मच गया डिग्री सेल्सियस, (कदम 2.6 के लिए जाने - 2.8.1) टीसीएस प्रोटोकॉल के लिए तैयारी के आराम के साथ पर जारी है. बीएसए दोनों के समाधान में भंग हो जाने के बाद नीचे बने हुए हैं.
  15. ± एजी, ± टीसीएस के साथ, जोखिम बफ़र्स की तैयारी शुरू करो. सबसे पहले, "टीसीएस-बफर" समाधान (पहले 90 मिनट के लिए गर्म और हड़कंप मच गया है), एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 50 मिलीलीटर हस्तांतरण के 249 मिलीलीटर नमूने से. इस 50 मिलीलीटर विभाज्य के 20 μl निकालें और 0.0004 ग्राम / एमएल DNP-बीएसए के अंतिम प्रतिजन एकाग्रता के लिए पहले तैयार 1 ग्राम / एमएल प्रतिजन के 20 μl के साथ बदलें. भंवर और पलटना.
    1. लेबल इस "ट्यूब 1, उच्च टीसीएस + / / एजी + बीटी." यह dilutions और उच्चतम टीसीएस एकाग्रता प्रदर्शन के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. "नियंत्रण बफर" समाधान की 249 मिलीलीटर नमूने से, एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब से 50 मिलीलीटर हस्तांतरण. इस नए 50 मिलीलीटर विभाज्य के 20 μl निकालें और 0.0004 ग्राम / एमएल DNP-बीएसए के अंतिम प्रतिजन एकाग्रता के लिए पहले तैयार 1 ग्राम / एमएल प्रतिजन के 20 μl के साथ बदलें. भंवर और पलटना.
      1. लेबल इस "ट्यूब 2, कोई टीसीएस + / / एजी + बीटी". टीसीएस dilutions और 0 माइक्रोन टीसीएस एकाग्रता जोखिम के लिए इस्तेमाल किया.
    3. अब "टीसीएस-बफर" समाधान के 50 मिलीलीटर बाहर ले और एक और 50 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया. इस नए 50 मिलीलीटर विभाज्य से 20 μl निकालें और सादे बीटी के 20 μl के साथ बदलें. भंवर और पलटना. कोई प्रतिजन जोड़ा जाता है.
      1. इस "ट्यूब 3, उच्च टीसीएस / नहीं / एजी + बीटी." इस पृष्ठभूमि के लिए प्रयोग किया जाता है. लेबल
    4. एक और 50 मिलीलीटर ट्यूब "नियंत्रण बफर" समाधान के 50 मिलीलीटर स्थानांतरण. इस पूर्वोत्तर से 20 μl बाहर ले जाओ डब्ल्यू 50 मिलीलीटर विभाज्य और सादे बीटी के 20 μl के साथ बदलें. भंवर और पलटना. (कोई एजी जोड़ा जाता है.)
      1. इस "ट्यूब 4, कोई टीसीएस / नहीं / एजी + बीटी." यह पृष्ठभूमि और सहज नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है. लेबल
    बीएसए टीसीएस प्रतिजन
    ट्यूब 1 जांच निशान उच्च [] जांच निशान
    ट्यूब 2 जांच निशान नहीं जांच निशान
    ट्यूब 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "चौड़ाई =" "15px /> उच्च [] नहीं
    ट्यूब 4 जांच निशान नहीं नहीं
    1. गणना और "टीसीएस-बफर" स्टॉक की एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद dilutions के लिए संस्करणों रिकॉर्ड. प्रत्येक कमजोर पड़ने एकाग्रता के लिए कुल मात्रा 1 मिलीग्राम होना चाहिए और एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में तैयार किया जाना चाहिए. Calibrated P2 और P1000 Pipetman का प्रयोग करें.
    एकाग्रता उच्च Triclosan + Tyrodes + बीएसए 0.0004 ग्राम / एमएल एजी
    (ऊपर से ट्यूब 1)
    बीटी 0.0004 ग्राम / एमएल एजी गरम
    (ऊपर से ट्यूब 2)
    20 माइक्रोन
    10 माइक्रोन
    5 माइक्रोन
    1 माइक्रोन
    0.1 माइक्रोन
    0,001 माइक्रोन
    0 माइक्रोन (प्लेट के ऊपर) ----------------------- 500 μl प्लस एक और 500 μl
    0 माइक्रोन (प्लेट के नीचे) ----------------------- 500 μl प्लस एक और 500 μl
    1. 1 घंटा आईजीई ऊष्मायन के बाद, इनक्यूबेटर की थाली से बाहर ले जाओ और सिंक में सभी मीडिया टॉस. (नोट: परीक्षण रसायन उपभोक्ता उत्पाद टीसीएस की तुलना में अधिक विषाक्त होने के लिए जाना जाता है, खतरनाक अपशिष्ट निपटान के लिए आवश्यक हो सकता है.)
    2. एक Combitip का प्रयोग, बेतरतीब ढंग से बीएसए-Tyrodes बफर (200 के साथ 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को धोनेअच्छी तरह / μl). संलग्न कोशिकाओं को परेशान करने से बचने के क्रम में, बल्कि सीधे जुड़ी कोशिकाओं पर से, कुओं के पक्षों पर धो बफर रिलीज. प्रक्रिया एक दूसरी बार दोहराएँ.
    3. आवेदन, भंवर के लिए उपचार के लिए तैयार है और सही प्लेट के अलावा पहले dilutions के पलटना.
    4. थाली के शीर्ष अनुभाग के साथ शुरू: अनियमित इसी कुओं को 200 μl प्रतिजन समाधान के प्रत्येक (टीसीएस की सही मात्रा के साथ) के triplicates जोड़ें. प्लेट के नीचे करने के लिए आगे बढ़ें. थाली पर सभी "mocks" के लिए "नियंत्रण बफर" समाधान प्लस एजी (ऊपर "ट्यूब 2" से) जोड़ें.
    5. इसी कुओं के लिए उपयुक्त समाधान के 200 μl जोड़ें:
      1. 0.2% ट्राइटन X-100 "टेक्सास" के लिए नामित कुओं के 200 μl जोड़ें.
      2. अगला, "पृष्ठभूमि (BkgD) उच्चतम टीसीएस" थाली पर लेबल 3 कुओं ट्यूब 3 के 200 μl जोड़ें.
      3. अंत में, 200 μl जोड़नेट्यूब के 4 से 6 कुओं "स्वतःस्फूर्त." लेबल
    6. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं.
    7. 1 घंटा ऊष्मायन के दौरान: बर्फ की दो बाल्टी (इनक्यूबेटर में "" पुराने प्लेट के लिए एक और नई प्लेट के लिए) जाओ. पिघलना 4 methylumbelliferyl एन एसिटाइल बीटा डी glucosaminide कमरे के तापमान पर (4 यू) के लिए ऊपर यह प्रकाश के प्रति संवेदनशील है क्योंकि पन्नी में रखते हुए 40 मिनट के लिए.
      1. एक बार 4 म्यू शेयर thawed है, 4 मिलियन यूनिट काम कर समाधान श्रृंगार: 150 μl भंडार + ठंड एसीटेट बफर के 14.85 मिलीलीटर (टेबल में दिए गए नुस्खा), भंवर और पलटना. पन्नी में लिपटे 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब,, में और उपयोग करें जब तक बर्फ पर रखें.
      2. Combitip का प्रयोग, बेतरतीब ढंग से एक नई ग्रेनियर काला 96 अच्छी तरह से थाली (बर्फ बाल्टी # 2 पर) के प्रत्येक अच्छी तरह के बहुत नीचे में 100 μl ठंड 4 म्यू काम कर समाधान जोड़ें. बेतरतीब ढंग से ट्राइटन X-100 कुओं के भीतर, बेतरतीब ढंग से प्लेट के नीचे के भीतर, प्लेट के ऊपर भीतर बेतरतीब ढंग से काम कर समाधान जोड़कर पहले शुरू,और अंत में बेतरतीब ढंग से पृष्ठभूमि कुओं के भीतर.
      3. अगले कदम के लिए P200 सुझावों के नए बॉक्स से बाहर जाओ.
    8. 1 घंटा ऊष्मायन के अंत में, के लिए अच्छी तरह से चारों ओर जा रहा है, नीचे (धीरे, बुलबुले शुरू नहीं) 4-5x बर्फ बाल्टी # 1, पिपेट तैरनेवाला ऊपर और पर इनक्यूबेटर से सेल प्लेट डाल मिश्रण अच्छा है, लेकिन मिश्रण जबकि कोशिकाओं को छू नहीं . व्यवस्थित, सब्सट्रेट (नमूनों का एक ही आदेश, के रूप में मूल रूप से बाहर की योजना बनाई) के साथ नया थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से और जगह से 25 μl नमूना बाहर ले. जब नए कुएं में बुलबुले शुरू करने के बिना, अच्छी तरह से नमूना मिश्रण करने के लिए नीचे पिपेट और.
    9. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    10. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, बेतरतीब ढंग से 325 μl कुल करने के लिए कुओं को भरने के लिए अच्छी तरह से प्रति ठंड ग्लाइसिन कार्बोनेट बफर के 200 μl (Combitip का उपयोग) जोड़ें. (ट्राइटन X-100 spillover से बचने के लिए, ट्राइटन X-100 नमूनों को इस के अलावा पिछले बनाओ). (स्वच्छ P10 के pipet के साथ प्रहार पढ़ने थाली से पहले बुलबुले के लिए जाँच करेंते टिप) किसी भी बुलबुले पॉप.
    11. प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक (धारा 4 के लिए जाना) में थाली चलाएँ.

    दिन 2:

    4. फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर निर्देश और डेटा विश्लेषण

    1. Gen5 कार्यक्रम, और खुला प्रयोग अनुभाग खुला.
    2. प्लेट रीडर और डालने प्लेट (ऊपरी बाएं कोने ए 1 है) पर मुड़ें.
    3. प्रोटोकॉल तीर प्रक्रिया तीर कस्टम रीडिंग स्थापित करने के लिए पढ़ें. प्रत्येक अच्छी तरह से कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा एकत्र करने के क्रम में नमूने के बारे में कुछ भी replicates, आदि, न जोड़ें.
    4. शीर्ष 50%: के तहत, "सामान्य गति" "," ", प्रतिदीप्ति" "लाभ 40", "उत्तेजना 360/40," "उत्सर्जन 460/40," प्रकाशिकी स्थिति समापन बिंदु का चयन "पढ़ें". ऑप्टिकल शीर्ष ऑफसेट: 7mमी. कोई हिला, कोई देरी, कोई कैनेटीक्स, अच्छी तरह से नहीं की निगरानी, ​​तापमान: इनक्यूबेटर बंद.
    5. फ्लैट काले नीचे, (ग्रेनियर 96 अच्छी तरह से, फ्लैट नीचे) प्लेट 96 अच्छी तरह से चुनें.
    6. थाली लेआउट के साथ डील: प्रोटोकॉल तीर थाली लेआउट. दोहराता है, dilutions, आदि का संकेत बिना नमूने सेट करें
    7. थाली तीर पढ़ें.
    8. फ़ाइल सहेजें: Excel में डेटा फ़ाइल निर्यात करेगा जो "एक्सेल" बटन पर क्लिक करें. थाली लेआउट के लिए और मैट्रिक्स के लिए यह करो. कंप्यूटर पर और एक यूएसबी ड्राइव पर फ़ाइल सहेजें.
    9. Excel में, ट्राइटन X-100 कुओं सहित हर नमूने से औसत पृष्ठभूमि पढ़ना, घटाना.
    10. औसत ट्राइटन X-100 मूल्य से प्रत्येक मूल्य (पहले से ही पृष्ठभूमि घटाया था होने) विभाजित करके सापेक्ष% degranulation की गणना करें, और फिर इसे एक प्रतिशत करने के लिए 100 से गुणा करें.
    11. जवाब सभी triplicates, और मानक विचलन की गणना. के रूप में Excel में ग्राफ डेटा मान ± मानक विचलन मतलब. सांख्यिकीय परीक्षण के लिए, GraphPad द्वारा चश्मे सॉफ्टवेयर के लिए अब चलते हैं.

    दिन 2:

    5. आरबीएल-2H3 कोशिकाओं का उपयोग ionophore प्रेरित degranulation परख

    1. "कोशिकाओं की तैयारी" के लिए प्रोटोकॉल (धारा 1, दिन 1) और "triclosan की तैयारी" (धारा 2, 2 दिन) का पालन करें, के रूप में ऊपर के निर्देश दिए. ionophore उत्तेजना के लिए थाली लेआउट उदाहरण नीचे दिखाया गया है.
    उपचार Triplicates
    उत्तेजित, 0 माइक्रोन टीसीएस उ 7, बी 7, सी 7, F4, जी -4, एच 4
    उत्तेजित, 0.001 माइक्रोन टीसीएस F6, G6, H6
    उत्तेजित, 0.01 माइक्रोन टीसीएस F3, जी 3, H3
    उत्तेजित, 0.1 माइक्रोन टीसीएस ए 4, बी 4, सी 4
    उत्तेजित, 1 माइक्रोन टीसीएस ए 6, बी -6, सी 6
    उत्तेजित, 5 माइक्रोन [टीसीएस करें F5, g5, H5
    उत्तेजित, 10 माइक्रोन टीसीएस ए 3, बी 3, सी 3
    उत्तेजित, 15 माइक्रोन टीसीएस उ 5, बी 5, सी 5
    उत्तेजित, 20 माइक्रोन टीसीएस G7 F7, H7
    DMSO के, कोई टीसीएस के साथ सहज (mocks भी शामिल है) A10, A11, A12, B10, B11, बी 12 ए 1, ए 2, ए 8, बी 1, बी 2, बी 8, सी 1, सी 2, सी 8, F1, F2, F8, G1, G2, जी -8, H1, H2 H8
    TX-100 DMSO के साथ, कोई टीसीएस D10, D11, E10 डी 12, E11, E12
    कोई कोशिकाओं पृष्ठभूमि, DMSO के साथ, प्लस उच्चतम [टीसीएस] G10, G11, G12, H10, H11, H12

    चित्रा 1 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    1. शुरू करने से पहले प्रयोग किया जा रहा सब buffers की पीएच की जाँच, और वे स्पष्ट और साफ नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करते हैं. Tyrodes, सोडियम एसीटेट बफर, और ग्लाइसिन कार्बोनेट बफर (व्यंजनों तालिका में प्रदान).
    2. 50 मिलीलीटर tyrodes बफर को 0.05 ग्राम बीएसए जोड़कर और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए vortexing द्वारा बीटी से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं.
    3. 10% ट्राइटन X-100-4.704 मिलीग्राम बीटी के 96 μl जोड़कर 0.0032% DMSO के (अंतिम कैल्शियम ionophore वाहन एकाग्रता) के साथ 0.2% ट्राइटन X-100 बनाओ. अच्छी तरह से मिलाएं. इसके बाद, इस समाधान की 0.155 μl बाहर ले और त्यागें. अब 100% DMSO के 0.155 μl में वापस जोड़ने.
    4. Ionophore शीशी में ताजा 100% DMSO के 400 μl जोड़ने और मिश्रण करने के लिए vortexing द्वारा पाउडर से A23187 ionophore की एक 5 मिमी शेयर (2.5 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें. एक बार जब समाधान में,एक 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, रिकॉर्ड सामग्री और आज की तारीख और समाप्ति (तैयारी से 3 महीने -20 डिग्री सेल्सियस पर ठीक से जमा हो) के लिए स्थानांतरण.
      1. वैकल्पिक रूप से, बर्फ पर आज एक जमे हुए स्टॉक का उपयोग अगर, पिघलना, और 5 मिमी A23187 ionophore अच्छी तरह से मिश्रित है और स्पष्ट है कि जांच ले. भंवर, झटका, और उपयोग करने से पहले इस शेयर पलटना. # इस A23187 की तैयारी और लूत की रिकॉर्ड तिथि.
    5. एक बार "टीसीएस-बफर" और "नियंत्रण बफर" गरम किया और 90 मिनट के लिए हड़कंप मच गया है, टीसीएस प्रोटोकॉल (कदम 2.6-2.8.1 के लिए जाना) के लिए तैयारी के बाकी जारी है. बीएसए दोनों के समाधान में अच्छी तरह से मिश्रित होने के बाद, शेष प्रोटोकॉल कदम के साथ जारी है.
    6. "टीसीएस-बफर" समाधान की 249 मिलीलीटर नमूने से, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 50 मिलीलीटर हस्तांतरण. 50 मिलीलीटर विभाज्य के 1.8 μl निकालें और 5 मिमी ionophore स्टॉक के 1.8 μl जोड़ें. भंवर 8 सेकंड के लिए 3x और 3x पलटना. अंतिम ionophore एकाग्रता 180 एनएम. A23187 के इस एकाग्रता स्टॉक शक्ति के आधार पर होगा ध्यान दें कि, और एक A23187 ionophore खुराक प्रतिक्रिया आरबीएल-2H3 को एक noncytotoxic के रूप में पहचान की गई है, जो लगभग 20% अधिक से अधिक रिलीज के एक degranulation स्तर elicits कि A23187 की एकाग्रता की पहचान करने के लिए सिफारिश की है cytotoxicity परख द्वारा कोशिकाओं (2 देखें).
      1. लेबल इस "ट्यूब 1, उच्च टीसीएस + / ionophore + / बीटी." Dilutions और उच्चतम टीसीएस एकाग्रता प्रदर्शन के लिए प्रयुक्त.
    7. "नियंत्रण बफर" समाधान की 249 मिलीलीटर नमूने से, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 50 मिलीलीटर हस्तांतरण. 50 मिलीलीटर विभाज्य के 1.8 μl बाहर ले जाओ और 5 मिमी ionophore स्टॉक के 1.8 μl में वापस जोड़ने. भंवर 8 सेकंड के लिए 3x और 3x पलटना. अंतिम ionophore एकाग्रता 180 एनएम है.
      1. लेबल इस "ट्यूब 2, कोई टीसीएस + / ionophore + / बीटी." यह dilutions और 0 माइक्रोन टीसीएस सांद्रता के लिए प्रयोग किया जाता है.
    8. आर के 249 मिलीलीटर नमूने से 20, टीसीएस-बफर "समाधान, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 50 मिलीलीटर हस्तांतरण. नई 50 मिलीलीटर विभाज्य के 1.8 μl बाहर ले जाओ और 100% DMSO के 1.8 μl जोड़ें. भंवर 8 सेकंड के लिए 3x और 3x पलटना, कोई ionophore जोड़ा जाता है.
      1. लेबल इस "ट्यूब 3, उच्च टीसीएस / नहीं ionophore + / बीटी / + DMSO के"; पृष्ठभूमि के लिए इस्तेमाल किया.
    9. "नियंत्रण बफर" समाधान की 249 मिलीलीटर नमूने से, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 50 मिलीलीटर हस्तांतरण. नई 50 मिलीलीटर विभाज्य से 1.8 μl बाहर ले जाओ और 100% DMSO के 1.8 μl जोड़ें. भंवर 8 सेकंड के लिए 3x और 3x पलटना. कोई ionophore जोड़ा जाता है.
      1. लेबल इस "ट्यूब 4, टीसीएस / नहीं ionophore + / बीटी / + DMSO के नहीं"; सहज रिहाई के नमूने के लिए इस्तेमाल किया.
    बीएसए टीसीएस Ionophore जोड़े गए 100% DMSO
    ट्यूब 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "चौड़ाई =" 15px "/> उच्च [] जांच निशान नहीं
    ट्यूब 2 जांच निशान नहीं जांच निशान नहीं
    ट्यूब 3 जांच निशान उच्च [] नहीं जांच निशान
    ट्यूब 4 जांच निशान नहीं नहीं Eck निशान "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "चौड़ाई =" "15px /> में .1
    1. गणना और "टीसीएस-बफर" स्टॉक की एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद dilutions के लिए संस्करणों रिकॉर्ड. Calibrated P2 और P1000 Pipetman का प्रयोग करें. प्रत्येक कमजोर पड़ने एकाग्रता के लिए कुल मात्रा 1 मिलीग्राम होना चाहिए, और एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में तैयार किया जाना चाहिए:
    <p>
    एकाग्रता उच्च Triclosan + Tyrodes + बीएसए 180 एनएम A23187 (ऊपर से ट्यूब 1) बीटी 180 एनएम A23187 (ऊपर से ट्यूब 2) गरम
    20 माइक्रोन
    15 माइक्रोन
    10 माइक्रोन
    5 माइक्रोन
    1 माइक्रोन
    0.1 माइक्रोन
    0,001 माइक्रोन
    0 माइक्रोन (प्लेट के ऊपर) ---------------------------------- 500 μl प्लस एक और 500 μl
    0 माइक्रोन (प्लेट के नीचे) ---------------------------------- 500 μl प्लस एक और 500 μl
    1. इनक्यूबेटर की कल बाहर चढ़ाया कोशिकाओं, और सिंक में मीडिया को खाली रखना. एक Combitip का प्रयोग, बेतरतीब ढंग से बीटी (200 μl / अच्छी तरह से) के साथ 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को धो लो. धोने के लिए दूसरी बार दोहराएँ.
    2. आवेदन, भंवर के लिए उपचार के लिए तैयार है और सही प्लेट के अलावा पहले dilutions के पलटना. थाली के शीर्ष अनुभाग के साथ शुरू: अनियमित correspo को 200 μl के triplicates टीसीएस का सही एकाग्रता के प्रत्येक जोड़अच्छी तरह nding. प्लेट के नीचे करने के लिए आगे बढ़ें. थाली पर सभी "mocks" के लिए "नियंत्रण बफर" समाधान प्लस A23187 (ऊपर "ट्यूब 2" से) जोड़ें.
    3. इसी कुओं के लिए उपयुक्त समाधान के 200 μl जोड़ें:
      1. 0.2% ट्राइटन X-100 "टेक्सास" के लिए नामित कुओं के 200 μl जोड़ें.
      2. अगला, "पृष्ठभूमि (BkgD) उच्चतम टीसीएस" थाली पर लेबल 3 कुओं ट्यूब 3 के 200 μl जोड़ें.
      3. अंत में, लेबल ट्यूब 4 से छह कुओं की 200 μl जोड़ने "स्वतःस्फूर्त."
    4. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं.
    5. 1 घंटा ऊष्मायन के दौरान: बर्फ की दो बाल्टी (इनक्यूबेटर में "" पुराने प्लेट के लिए एक और नई प्लेट के लिए) जाओ. पिघलना 4 methylumbelliferyl एन एसिटाइल बीटा डी glucosaminide कमरे के तापमान पर (4 यू) के लिए ऊपर यह प्रकाश के प्रति संवेदनशील है क्योंकि पन्नी में रखते हुए 40 मिनट के लिए.
      1. एक बार 4 म्यू शेयर thawed है, 4 म्यू काम soluti श्रृंगारपर: 150 μl भंडार + ठंड एसीटेट बफर के 14.85 मिलीलीटर (टेबल में दिए गए नुस्खा), भंवर और पलटना. पन्नी में लिपटे 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब,, में और उपयोग करें जब तक बर्फ पर रखें.
      2. Combitip का प्रयोग, बेतरतीब ढंग से एक नई ग्रेनियर काला 96 अच्छी तरह से थाली (बर्फ बाल्टी # 2 पर) के प्रत्येक अच्छी तरह के बहुत नीचे में 100 μl ठंड 4 म्यू काम कर समाधान जोड़ें: के शीर्ष भीतर बेतरतीब ढंग से काम कर समाधान जोड़कर पहले शुरू बेतरतीब ढंग से बेतरतीब ढंग से ट्राइटन X-100 कुओं के भीतर प्लेट के नीचे,, भीतर और अंत में बेतरतीब ढंग से पृष्ठभूमि कुओं भीतर थाली,.
      3. अगले कदम के लिए P200 सुझावों के नए बॉक्स से बाहर जाओ.
    6. 1 घंटा ऊष्मायन के अंत में, मिश्रण अच्छा है, लेकिन कोशिकाओं को छू नहीं मिश्रण देर के लिए अच्छी तरह से चारों ओर जा रहा है, नीचे (धीरे, बुलबुले शुरू नहीं) 4-5x बर्फ बाल्टी # 1, पिपेट तैरनेवाला ऊपर और पर इनक्यूबेटर से सेल प्लेट डाल . व्यवस्थित, एक की सब्सट्रेट (एक ही आदेश के साथ नए थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से और जगह से 25 μl नमूना बाहर लेmples, के रूप में मूल रूप से) बाहर की योजना बनाई है. जब नए कुएं में बुलबुले शुरू करने के बिना, अच्छी तरह से नमूना मिश्रण करने के लिए नीचे पिपेट और.
    7. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    8. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, बेतरतीब ढंग से 325 μl कुल (ट्राइटन X-100 spillover से बचने के लिए, पिछले ट्राइटन X-100 नमूनों को इस सुविधा बनाने के लिए) के लिए कुओं को भरने के लिए अच्छी तरह से प्रति 200 μl ठंड ग्लाइसिन कार्बोनेट बफर (Combitip का उपयोग) जोड़ें. पढ़ने की थाली से पहले बुलबुले (किसी भी बुलबुले पॉप करने के लिए स्वच्छ P10 विंदुक टिप के साथ प्रहार) के लिए जाँच करें.
    9. (अनुभाग 4 में सभी चरणों का पालन करें) प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में थाली चलाएँ.

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Representative Results

50 को जब गरम डिग्री सेल्सियस 90 मिनट के लिए, टीसीएस के लिए यूवी विज़ absorbance के स्पेक्ट्रम के रूप में चित्र 1 में दिखाया 280 एनएम पर एक चोटी के साथ ~ 260 और 300 एनएम के बीच एक मजबूत, चिकनी वक्र, पैदा करता है. 280 एनएम पर प्रकाशित दाढ़ अवशोषण गुणांक 4200 एल / मोल सेमी / 12 के बाद से यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, इसलिए, एकाग्रता की गणना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक महत्वपूर्ण उपकरण है. हम टीसीएस 50 डिग्री सेल्सियस हीटिंग (नहीं दिखाया डेटा है) के बाद, पूरे degranulation प्रयोग की समय सीमा के दौरान समाधान के बाहर गिर नहीं करता है कि मिल गया है.

जलीय बफर में सीधे टीसीएस भंग करने के लिए इस हीटिंग विधि का उपयोग करने के बाद, हम नाल एट अल से अनुकूलित किया गया था कि एक प्रतिदीप्ति आधारित परख का उपयोग मस्तूल सेल degranulation पर टीसीएस के प्रभाव की जांच की. 1 यह परख मस्तूल से जारी β-hexosaminidase का स्तर रिकॉर्ड एक fluorogenic सब्सट्रेट उत्पाद का पता लगाने के द्वारा एक घंटे ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं. DNP बी एस द्वारा degranulate करने के लिए प्रेरित होंएक प्रतिजन (चित्रा 2) या कैल्शियम ionophore A23187 (चित्रा 3), एक स्पष्ट रूप से टीसीएस β-hexosaminidase की रिहाई का एक महत्वपूर्ण खुराक उत्तरदायी निषेध (यानी degranulation) का कारण बनता है कि देख सकते हैं.

चित्रा 2 1 "टीसीएस-बफर" में घंटा या "नियंत्रण बफर," के लिए incubated और 0.0004 ग्राम / एमएल के एक DNP-बीएसए प्रतिजन खुराक के संपर्क में थे जो आईजीई अवगत आरबीएल कोशिकाओं, के लिए प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधि है. DNP-बीएसए की यह एकाग्रता ± 0.1 (± मानक विचलन) टीसीएस के अभाव में 22.5% की एक औसत निरपेक्ष degranulation प्रतिक्रिया हासिल. Degranulation के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण निषेध degranulation स्तरों 0 माइक्रोन टीसीएस नियंत्रण के स्तर के ± 0.05 (± एसडी मतलब है) 0.79 गुना थे जहां 5 माइक्रोन, पर शुरू हुआ. टीसीएस एकाग्रता बढ़ जाती है, टीसीएस का एक बड़ा कमी लाने के लिए एक मजबूत खुराक प्रतिक्रिया संबंध दिखा रहा है. टीसीएस, 20 माइक्रोन से कम, almosटी पूरी तरह से सहज degranulation (कोई प्रतिजन मौजूद है) के बराबर के स्तर तक, degranulation प्रतिक्रिया abrogates. कुल मिलाकर, यह आंकड़ा कार्बनिक सॉल्वैंट्स के उपयोग के बिना एकाग्रता सत्यापित टीसीएस के कारण multivalent प्रतिजन उत्तेजित मस्तूल सेल degranulation के मजबूत निषेध, पता चलता है.

चित्रा 3 में, कैल्शियम ionophore A23187 टीसीएस प्रेरित आरबीएल मस्तूल कोशिकाओं में degranulation की dampening की व्यवस्था की जांच के लिए एक रास्ते के रूप में इस्तेमाल किया गया था. यह FcεRI तिर्यक और कैल्शियम बाढ़ के अपस्ट्रीम अन्य संकेत घटनाओं को नजरअंदाज, लेकिन अभी भी degranulation का कारण बनता है क्योंकि A23187 एक वैकल्पिक उत्तेजक के रूप में प्रयोग किया जाता है. आरबीएल मस्तूल कोशिकाओं 1 "टीसीएस-बफर" में घंटे या 180 एनएम के एक कैल्शियम ionophore खुराक युक्त "नियंत्रण बफर," के लिए incubated रहे थे. टीसीएस के अभाव में A23187 के इस एकाग्रता 25.1% की एक औसत निरपेक्ष degranulation प्रतिक्रिया हासिल ± 4.7 (± मानक विचलन). Degranulation का निषेध थाके रूप में छोटा रूप में 1 माइक्रोन के साथ पाया टीसीएस (0.63 ± 0.11 [मतलब ± एसडी]). टीसीएस एकाग्रता बढ़ जाती है, इसलिए निषेध की गंभीरता करता है: 5 माइक्रोन से कम, 0.21 गुना ± 0 माइक्रोन टीसीएस नियंत्रण के स्तर से 0.04, 10 माइक्रोन, 0.09 ± 0.05 पर, और कम 20 माइक्रोन, 15 माइक्रोन, 0.077 ± 0.006 पर , 0.09 ± 0.02 (मतलब ± एसडी). वास्तव में, 5 माइक्रोन और टीसीएस के उच्च सांद्रता से, A23187 प्रेरित degranulation के स्तर सहज नियंत्रण के स्तर पर (जहां कोई A23187 सब पर मौजूद है) के पास पाए गए. कुल मिलाकर, चित्रा 3, चित्रा 2 के साथ संयोजन में, टीसीएस द्वारा लक्षित आणविक घटनाओं कैल्शियम बाढ़ की संभावना को नीचे की ओर इंगित करता है कि.

चित्रा 1
चित्रा 1:. प्रतिनिधि टीसीएस यूवी विज़ absorbance के स्पेक्ट्रम टीसीएस एक मजबूत मटर हैआसान एक 280 का दृढ़ संकल्प है, साथ ही tyrodes बफर में भंग टीसीएस की वास्तविक एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए 4200 एल / मोल सेमी / 12 की दाढ़ विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करने की क्षमता affording की अनुमति 280 एनएम पर कश्मीर,. पीली लाइन 280 एनएम चोटी इंगित करता है. इस उदाहरण में, 280 एनएम पर absorbance मूल्य 28.28 माइक्रोन का टीसीएस एकाग्रता जो इंगित करता है, 0.11876 है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2:. 0.0004 ग्राम / एमएल DNP-बीएसए प्रतिजन और टीसीएस (0-20 सुक्ष्ममापी) के संपर्क में आईजीई अवगत आरबीएल मस्तूल कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि degranulation प्रतिक्रिया एक सहज रिहाई मूल्य (कोई प्रतिजन वर्तमान) संदर्भ के लिए दिखाया गया है. मान मतलब प्रतिनिधित्व7, तीन प्रतियों के नमूनों का मानक विचलन. प्रस्तुत के रूप में, डेटा नियंत्रण (0 माइक्रोन टीसीएस) के लिए सामान्यीकृत थे, और महत्वपूर्ण अंतर एक Tukey के पद अस्थायी परीक्षण (तुलना 0.001 माइक्रोन टीसीएस औसत प्रतिक्रिया करने के लिए बनाया) के बाद एक तरह से एनोवा साथ चश्मे सॉफ्टवेयर में निर्धारित किया गया है. महत्व का प्रतिनिधित्व करती है *** पी <0.001. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3:. टीसीएस (0-20 सुक्ष्ममापी) की उपस्थिति में 180 एनएम A23187 कैल्शियम ionophore साथ प्रेरित आरबीएल मस्तूल कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि degranulation प्रतिक्रिया एक सहज रिहाई नमूना (कोई ionophore वर्तमान) संदर्भ के लिए दिखाया गया है. मान तीन प्रतियों के नमूनों का मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. Presente रूपघ, डेटा नियंत्रण (0 माइक्रोन टीसीएस) को सामान्यीकृत कर रहे हैं, और महत्वपूर्ण अंतर एक Tukey के पद अस्थायी परीक्षण (तुलना 0.001 माइक्रोन टीसीएस औसत प्रतिक्रिया करने के लिए बनाया) के बाद एक तरह से एनोवा साथ चश्मे सॉफ्टवेयर में निर्धारित किया गया है. महत्व *** 0.001 <पी का प्रतिनिधित्व करती है, ** पी <0.01. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

2004 में, नाल एट अल. 1 degranulation के उच्च throughput के परीक्षण के लिए एक मस्तूल सेल biosensor है विकसित. यह हम अपने टीसीएस पढ़ाई के लिए अनुकूल है और इस वीडियो में विस्तृत है कि एक मजबूत परख है. पिछले नाल एट अल. 1 परख, मस्तूल सेल degranulation नियमित β-hexosaminidase 59-61 के द्वारा मूल्यांकन किया है, लेकिन इन जल्दी तरीकों का एक नमूना एक समय में पढ़ा था जिसमें fluorometers उपयोग किया गया था. महत्वपूर्ण बात है, नाल एट अल. उनके एक microplate रीडर का उपयोग अधिक उच्च throughput विधि और नमूने एक fluorometer में एक पर एक बार पढ़ा गया, जिसमें पहले की विधि के बीच स्थापित प्रत्यक्ष क़बूल. संक्षेप में, नाल एट अल. 1 बहुत है और साथ ही कार्यप्रवाह में कई बदलाव शामिल करके, एक उच्च throughput microplate मंच तक यह आदत डाल द्वारा गति, शक्ति, सादगी, और परख की विश्वसनीयता में सुधार. यहाँ, हम आगे विशेष रूप से, यहां, विभिन्न परीक्षण रसायन के एक अध्ययन के लिए इस परख ढाल लिया, सर्वव्यापी दवा टीसीएस. वीडियो विवरण यह बहुत उपयोगी परख के कदम. इसके अतिरिक्त, हम भी जलीय बफर में टीसीएस को लागू करने के एक कार्बनिक विलायक मुक्त विधि विकसित की है, और हम टीसीएस एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए एक सरल, कम लागत वाली प्रक्रिया दिखा. इन विधियों triclosan विष विज्ञान के जाहिरा तौर पर बढ़ रही है क्षेत्र के लिए उपयोगी होना चाहिए. साथ ही अन्य रसायनों का परीक्षण करने के लिए इस degranulation परख का उपयोग करने के लिए इस चर्चा में, हम विस्तार कई विचार.

टीसीएस कार्बनिक विलायकों की सहायता के बिना जलीय बफर में सीधे तैयार किया गया था, एकाग्रता यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (चित्रा 1) के द्वारा सत्यापित किया गया था, और उसके बाद टीसीएस (<30 माइक्रोन) का प्रभाव (आंकड़े 2 और 3) मस्तूल सेल degranulation पर जांच की गई थी , degranulation के लिए β-hexosaminidase, एक किराए मार्कर की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक प्रतिदीप्ति microplate परख का उपयोग कर. हम टीसीएस काफी β-hexosa की रिहाई को तर करने के लिए सक्षम है कि मिल गया हैसीधे जलीय बफर में यहाँ के रूप में दर्शाया गया है कि एक कम इथेनॉल की एकाग्रता (0.24% / खंड खंड) 2 या,, में भंग जब आरबीएल मस्तूल कोशिकाओं से minidase. कार्बनिक विलायक पूर्वगामी करके, हम वास्तव में टीसीएस 0.24% इथेनॉल में भंग कर दिया गया था, जिसमें हमारे अध्ययन (/ खंड खंड) मुकाबले प्रतिजन प्रेरित degranulation में dampening अधिक स्पष्ट देखते हैं. उदाहरण के लिए, यहाँ हम टीसीएस 0.24% इथेनॉल में भंग 10 माइक्रोन के लिए सूचना दी ~ 25% की कमी (0.76 गुना से अधिक है जो प्रतिजन प्रेरित degranulation में एक> 50% की कमी (0.46 गुना ± 0.07), का प्रदर्शन किया ± 0.02) 2. उसी नस में, हम 5 माइक्रोन से, टीसीएस सहज रिहाई के स्तर को degranulation रोकता है, A23187 उत्तेजित कोशिकाओं के लिए निर्धारित है, यह प्रभाव हमारे पहले, इथेनॉल के उपयोग, अध्ययन 2 में 10 माइक्रोन टीसीएस तक का प्रदर्शन नहीं किया गया था. इस विसंगति के लिए दो संभावित कारण हैं: या तो एक 0.24% इथेनॉल वाहन 2 सक्रिय मस्तूल सेल को बाधित करने के लिए टीसीएस की क्षमता attenuatesहम इस्तेमाल कर रहे थे एल degranulation, या टीसीएस (सांद्रता पिछले अध्ययन 2 में यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा सत्यापित नहीं किया गया) के बाद से प्रत्याशित की तुलना में कम केंद्रित था. मस्तूल सेल degranulation की टीसीएस के निषेध के लिए आणविक लक्ष्य के बारे में, यह संभावना कैल्शियम बाढ़ 2 के संकेत पारगमन झरना बहाव में कहीं न कहीं हो रहा है. हम जल्दी संकेत घटनाओं बायपास करने के लिए एक degranulation उत्तेजक के रूप में ionophore A23187 कैल्शियम का इस्तेमाल किया, और टीसीएस के निरोधात्मक प्रभाव degranulation मार्ग में टीसीएस निषेध के लिए लक्ष्य की संभावना कैल्शियम बाढ़ के अपस्ट्रीम में स्थित नहीं है यह दर्शाता है कि बनाए. हम पहले से इन कोशिकाओं की झिल्ली ruffling भी एक आम मार्ग लक्ष्य 2 की संभावना का सुझाव दे, टीसीएस उपचार की वजह से दबा दिया जाता है कि पता चला है.

पिछले अध्ययनों टीसीएस 280 एनएम पर एक अधिकतम शिखर होने और एक दाढ़ अवशोषण गुणांक इस wavelen पर 4200 एल / मोल / सेमी होना मूल्यांकन किया गया था के absorbance स्पेक्ट्रम मिल गया हैgth 12 (PK एक नीचे पीएच मान कम). यह टीसीएस हीटिंग थर्मल गिरावट 57 के लिए नेतृत्व नहीं करता है कि दिखाया गया है, और डिग्री सेल्सियस एक कार्बनिक विलायक 56 की सहायता के बिना 50 को गर्म किया जा रहा है, जबकि एक अन्य अध्ययन में पानी में टीसीएस भंग में सफलता दिखाया गया है. किसी भी नए परीक्षण रसायन का इस्तेमाल किया जाता है, जलीय बफर में इसकी विलेयता, ज़ाहिर है, ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. हम भी टीसीएस जब हीटिंग, वर्णक्रमीय readout का आकार यह 40-90 मिनट (नहीं दिखाया डेटा) के लिए गरम किया जाता है कि क्या अप्रभावित है, जो मिल गया है: एक लंबी अवधि के लिए जब गरम इस टीसीएस की गिरावट की कमी का पता चलता है समय. ध्यान दें, तथापि, कि टीसीएस विघटन 40 मिनट से 90 मिनट में अधिक से अधिक है. हम भी टीसीएस degranulation प्रयोग (नहीं दिखाया डेटा) की अवधि के लिए समाधान के बाहर गिर नहीं करता है कि पुष्टि की है.

इस अध्ययन में इस्तेमाल DNP-बीएसए प्रतिजन और कैल्शियम ionophore सांद्रता एक, प्रतिजन और ionophore खुराक प्रतिक्रिया assays के आधार पर चुने गएघ प्रतिनिधि आंकड़े 2 और 3 के लिए मध्यम degranulation स्तर को प्रकाश में लाना करने के लिए चयन किया गया था. एक प्रतिजन खुराक प्रतिक्रिया परख का एक उदाहरण हमारे पिछले काम 2 की चित्रा 1 ए में देखा जा सकता है. अपने प्रयोग में इस्तेमाल किया जा प्रतिजन या ionophore एकाग्रता का निर्धारण करते हैं, यह आरबीएल-2H3 कोशिकाओं कभी कभी अस्थायित्व से कार्य के बाद उत्तेजक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों, कम से कम हर दो महीने में आम तौर पर, समय समय पर किया जाना चाहिए कि जानकारी होना जरूरी है. वांछित degranulation प्रतिशत पैदावार कि एकाग्रता कोशिकाओं की उम्र पर और प्रतिजन / ionophore तैयारी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. हम अकार्बनिक आर्सेनाइट 22 के साथ देखा है इसके अलावा, पूर्ण degranulation प्रतिशत (प्रयुक्त प्रतिजन के स्तर) खुराक प्रतिक्रियाओं कई अलग प्रतिजन / ionophore मात्रा में किया जाना चाहिए ताकि विषैला, आरबीएल degranulation पर विषैला प्रभाव के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं. यह अंतिम conce पर विचार करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैDMSO के वाहन की ntration degranulation DMSO के 62 से प्रभावित है, क्योंकि ionophore साथ degranulation उत्तेजक है. हम इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल DMSO के सांद्रता degranulation, पृष्ठभूमि रीडिंग, या 0.2% ट्राइटन X-100 2 मूल्यों को प्रभावित नहीं कर पाया है.

Multivalent प्रतिजन DNP-बीएसए और कैल्शियम ionophore A23187 के अलावा, आरबीएल-2H3 उत्तेजना के कई अन्य तरीके भी मौजूद हैं. इन तरीकों में से एक quercetin, 63 के साथ 48/80 मिश्रित करने के लिए जोखिम के माध्यम से उत्तेजना है. हम पहले से टीसीएस जोखिम 2 के साथ परीक्षण के रूप में एक और, एक विरोधी IgE आईजीजी साथ आईजीई वाली रिसेप्टर्स की तिर्यक है. कई अन्य उत्तेजना तरीकों मौजूद हैं, और इन तरीकों में से प्रत्येक मस्तूल सेल degranulation की एक अलग यंत्रवत पहलू पते. यह प्लेट पाठक परख आगे इसकी उपयोगिता का विस्तार, इन वैकल्पिक stimulators से कई के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

इस degranulation प्रोटोकॉल चे की एक विस्तृत विविधता के साथ इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता हैmicals. इस परख का उपयोग कर किसी भी परीक्षण रसायन के एक अध्ययन में, नियंत्रण निम्न लिए चला जाना चाहिए: पृष्ठभूमि पर परीक्षण रसायन (कोई सेल) रीडिंग (1) के प्रभाव, सहज degranulation पर रासायनिक (2) के प्रभाव (कोई IgE के साथ कोशिकाओं , कोई प्रतिजन, कोई ionophore); lysed कोशिकाओं की ट्राइटन-X-100 मूल्यों (कोई प्रतिजन, कोई ionophore) पर रासायनिक का (3) प्रभाव. इन परीक्षणों में आसानी से प्लेट लेआउट में काम किया जा सकता है. इससे पहले, हम टीसीएस इन तीन मानकों 2 में से कोई भी प्रभावित करता पाया. इसके अतिरिक्त, परीक्षण परीक्षण रासायनिक रूप परिशिष्ट पामर एट अल का एक अनुपूरक डेटा अनुभाग के चित्र S1 में वर्णित एक सेल मुक्त तैयारी में β-hexosaminidase / एंजाइम सब्सट्रेट प्रतिक्रिया ही है, साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि निर्धारित करने के लिए चलाई जानी चाहिए. 2 हम टीसीएस फोड़ना करने β-hexosaminidase की क्षमता fluorogenic सब्सट्रेट 4 यू 2 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है पाया. किसी भी इस्तेमाल किया विलायकों का प्रभाव भी विचार किया जाना चाहिएइन सभी नियंत्रण प्रयोगों में. उदाहरण के लिए, हम DMSO, ionophore के लिए विलायक, ट्राइटन-X-100 नमूना प्रतिदीप्ति स्तर (नहीं दिखाया डेटा है) पर कोई प्रभाव नहीं है कि पुष्टि की. हम भी हम अंत: स्रावी disruptor bisphenol युक्त नहीं करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी प्लास्टिक चयनित ध्यान दें कि एक, दुर्भाग्य से, हालांकि, वर्तमान में बाजार पर सभी प्लास्टिक शायद संभावित डेटा 64 उलझाना सकता है जो गतिविधि में खलल न डालें कुछ एंडोक्राइन, शामिल है.

समस्या निवारण आवश्यक है कि घटना में, इस प्रोटोकॉल के कई संभावित पहलुओं की समीक्षा की जानी चाहिए. (2) या तो उत्तेजक और / या परीक्षण रसायन के साथ एक खुराक प्रतिक्रिया नहीं मनाया जाता है, उदाहरण के लिए, यह (1) सहज रिहाई स्तर (सेल मूल्यों की ~ 7% से अधिक) बहुत अधिक हैं कि हो सकता है, या (3) समाधान में टीसीएस एकाग्रता (कम से कम 20 माइक्रोन) बहुत कम है. पहले मामले में, एक उच्च सहज स्तर बहुत लंबा या Mycoplasma के साथ दूषित किया जा रहा संस्कृति में किया जा रहा है कोशिकाओं का एक संकेत हो सकता है, इसलिए, 2-20 सप्ताह के बीच संस्कृति में किया गया है कि आरबीएल-2H3 कोशिकाओं के साथ इन प्रयोगों की कोशिश, और नियमित रूप से Mycoplasma के लिए परीक्षण. एक उत्तेजक खुराक प्रतिक्रिया नहीं मनाया जाता है, तो भंग उत्तेजक एकाग्रता भी कम हो सकता है, और शेयरों पुनर्निर्माण किया जाना चाहिए. एक उदाहरण के रूप में, कैल्शियम ionophore आम तौर पर सावधान ध्यान और ज्यादा vortexing की आवश्यकता होती है, DMSO के साथ पुनर्गठन किया जाना एक पतली फिल्म, के रूप में प्रदान की जाती है. इसके अतिरिक्त, एक अलग बहुत संख्या के साथ एक नई ionophore शेयर बहुत से बहुत भिन्नता बस की वजह से एक अलग शक्ति हो सकता था, इसलिए एक degranulation खुराक प्रतिक्रिया प्रत्येक नए खरीदे ionophore स्टॉक के साथ की सिफारिश की है. यह एक दिया परीक्षण रसायन के साथ प्रभाव का एक स्पष्ट कमी इस रासायनिक एक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए एक लंबी ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता हो सकती है कि एक संकेत हो सकता है कि यह भी ध्यान देने योग्य है. आप समाधान में एक उच्च टीसीएस उपज प्राप्त नहीं कर रहे हैं, तो तापमान रह गया है कि जाँच निरंतर (50 डिग्री सेल्सियस ± 5) कणिकाओं बफर में भंग कर रहे हैं. टीवह थर्मामीटर कुप्पी के नीचे, समाधान के तापमान के एक अत्यधिक नतीजा होगा कि एक स्थिति स्पर्श नहीं करना चाहिए. इसके अलावा, तापमान पहली बार 50 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है जब तक वहाँ लगातार जोरदार सरगर्मी है और 90 मिनट की उलटी गिनती शुरू नहीं किया है कि यह सुनिश्चित कर लें

समस्या निवारण के लिए टेबल.

समस्या

संभावित कारण

समाधान

टीसीएस के शेयर <20 माइक्रोन होना निर्धारित है

समाधान की असमान हीटिंग

थर्मामीटर यह समाधान में निलंबित कर दिया है और कुप्पी के नीचे छू नहीं है कि इतनी तैनात है कि सुनिश्चित करें.

सरगर्मी पर्याप्त जोरदार नहीं है

समाधान कुप्पी से बाहर कूद करने के कारण के बिना जोरदार है कि क्रियाशीलता के स्तर को प्राप्त करने के लिए हलचल थाली पर चुंबकीय सरगर्मी बढ़ाएँ. एक उचित आकार चुंबकीय हलचल बार प्रयोग किया जाता है कि यह सुनिश्चित करें.

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कोई समस्या

यूवी दीपक की उचित warmup के (आमतौर पर 10 मिनट) के लिए अनुमति दें, या बल्ब यदि आवश्यक हो तो बदल दें.

सहज degranulation स्तर (> ~ 7%) बहुत अधिक हैं

कोशिकाओं संस्कृति में बहुत अधिक समय की वजह से असामान्य आनुवंशिक परिवर्तन का अधिग्रहण किया

एक नया सेल पिघलना के साथ प्रयोग करते हैं.

कोशिकाओं क्योंकि यांत्रिक कर्तन से मर रहे हैं

बफर या उपचार पक्षपाती कोशिकाओं को जोड़ने, microwells के पक्षों को ध्यान से इन संस्करणों जोड़कर, कोशिकाओं को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. Combitip का उपयोग करने का अभ्यास करें.

आईजीई / DNP-बीएसए सहज रिहाई के स्तर पर बीटा hexosaminidase की रिहाई का कारण नहीं है

आईजीई 30 दिन से अधिक पुराना है या पिघलना फ्रीज के अधीन कर दिया गया है

आईजीई का एक नया, ठीक से जमा विभाज्य का प्रयोग करें.

DNP-बीएसए ठीक से मिलाया नहीं किया गया है

ध्यान से शंक्वाकार ट्यूब और टी DNP-बीएसए की छोटी मात्रा में जोड़ने के लिए सुनिश्चित करेंअच्छी तरह ओ भंवर.

A23187 ionophore सहज रिहाई के स्तर पर बीटा hexosaminidase की रिहाई का कारण नहीं है

A23187 शेयर ठीक से पुनर्गठन नहीं किया गया है

उत्पाद ", पतली फिल्म" एक के रूप में आता है और देखभाल और ज्यादा vortexing के साथ पुनर्गठन किया जाना चाहिए. स्थानांतरण भंडारण के लिए एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब शेयर पुनर्गठन.

A23187 शेयर ठीक से जमा नहीं किया गया है

स्टॉक प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं. एक बार पुनर्गठन, Parafilm के ऊपर, और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी में लपेटा एक शेयर के भंडारण के बारे में एक सवाल है, तो त्यागने और एक नए स्टॉक के साथ परीक्षण शुरू करते हैं.

A23187 ionophore के 180 एनएम प्रकाश में लाना नहीं करताएक पहले परख में पाया कि जैसे रिश्तेदार degranulation प्रतिक्रिया का एक ही स्तर,

A23187 ionophore की लूत को बहुत भिन्नता

Ionophore के प्रत्येक नए बहुत कुछ के लिए एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग करें. यह भी एक ही बहुत से शेयरों की वजह से पुनर्गठन की प्रक्रिया में संभावित परिवर्तनशीलता के लिए, परीक्षण किया जा सिफारिश की है.

किसी भी विष विज्ञान / औषध विज्ञान प्रयोग के रूप में, परीक्षण रासायनिक परीक्षण सांद्रता में खुलकर विषैले नहीं होना चाहिए. हम तरीकों का उपयोग करने की सलाह देते हैं कि apoptosis और परिगलन, या तो व्यक्तिगत या संयुक्त (जैसे clonogenic assays के साथ के रूप में), और साथ ही प्लाज्मा झिल्ली (जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिसाव के रूप में) के लिए सामान्य क्षति के लिए परीक्षण के लिए दोनों परीक्षण. टीसीएस, इस अध्ययन में दिखाया सांद्रता में, आरबीएल-2H3 कोशिकाओं 2 से साइटोटोक्सिक नहीं है. Ionophore पढ़ाई के साथ चिंता का एक विशेष ध्यान दें कि ionophore प्लस ionophore वाहन है(संभावना DMSO), प्लस परीक्षण रासायनिक, के साथ साथ किसी भी इस्तेमाल किया कार्बनिक विलायकों, पामर एट अल में किया के रूप में ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए जो एक संभावित साइटोटोक्सिक काढ़ा, हो सकता है. 2

एक कार्बनिक विलायक के उपयोग के बिना टीसीएस समाधान की तैयारी के लिए हमारे प्रोटोकॉल विलायक कलाकृतियों, जलीय विष विज्ञान में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विचार के हस्तक्षेप के बिना, इस देशव्यापी रसायन के आगे विषाक्तता परीक्षण के लिए उपयोगी हो जाएगा. इन तरीकों में भी टीसीएस की एकाग्रता के सत्यापन की अनुमति ऐसे टीसीएस के रूप में रसायन,, मस्तूल सेल degranulation पर है कि प्रभाव के समाधान और मात्रा का. इस प्रोटोकॉल ऐसे रसायनों 55 खलल न डालें संदिग्ध एंडोक्राइन रूप मस्तूल सेल degranulation पर रसायनों की एक विस्तृत विविधता के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संभवतः उच्च throughput प्रदर्शन के लिए बढ़ाया जा सकता है. इसके अलावा, अन्य मस्तूल सेल प्रकार भविष्य के काम में इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

LMW और RHK बायोमेडिकल साइंस और इंजीनियरिंग (GSBSE) की UMaine के ग्रेजुएट स्कूल द्वारा समर्थन कर रहे हैं; RHK भी मेन कृषि एवं वन प्रयोग स्टेशन द्वारा समर्थित किया गया था. अतिरिक्त धन जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच P20-GM103423), मेन कृषि एवं वन प्रयोग स्टेशन (अनुदान संख्या ME08004 -10, जे ए जी), ज्वार केंद्र (NSF अनुदान # 1008498) राइजिंग मेन अग्रिम विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया , और PhRMA नींव (जे ए जी) से औषध / टॉक्सिकोलॉजी में एक रिसर्च स्टार्टर अनुदान. हम डीआरएस धन्यवाद. प्रतिजन और कोशिकाओं के लिए डेविड Holowka और बारबरा बेयर्ड. हम हिना हाशमी, ऐलेजैंड्रो Velez, और उपकरणों और आदेश के साथ मदद के लिए एंड्रयू Abovian के लिए आभारी हैं. इस मेन कृषि एवं वन प्रयोग स्टेशन प्रकाशन संख्या 3311 है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

RBL-2H3 Cells

ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spectrophotometer

Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

BioTek

Module S

Hematocytometer

Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

VWR

97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

Range: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Acetate Buffer, pH 4.4

Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle

Plastic material used:

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

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References

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Comments

1 Comment

  1. May I have the video clip for my research project, since I am doing experiments on human basophilic leukemia cells

    Reply
    Posted by: Liu W.
    December 10, 2013 - 4:37 AM

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