Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

Bioengineering

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Summary

Apresentamos um novo hidrogel de poliacrilamida, chamada hidroxi-PAAm, que permite uma ligação direta das proteínas da MEC com custo ou experiência mínima. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact facilita o controlo independente das muitas pistas de o microambiente celular natural para estudar mechanostransduction celular.

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Grevesse, T., Versaevel, M., Gabriele, S. Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues. J. Vis. Exp. (90), e51010, doi:10.3791/51010 (2014).

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Abstract

Está agora bem estabelecido que muitas funções celulares são reguladas por interacções de células com pistas físico-químicas e mecânicas do seu ambiente de matriz extracelular (ECM). As células eucarióticas sentir constantemente seu microambiente local através mechanosensors de superfície para a transdução de mudanças físicas de ECM em sinais bioquímicos, e integrar esses sinais para alcançar mudanças específicas na expressão gênica. Curiosamente, os parâmetros físico-químicas e mecânicas do casal ECM lata uns com os outros para regular o destino celular. Portanto, a chave para a compreensão Mecanotransdução é dissociar a contribuição relativa dos sinais de ECM sobre as funções celulares.

Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para gerar rapidamente e facilmente hidrogéis biologicamente relevantes para a afinação independente de pistas Mecanotransdução in vitro. Nós, os hidrogéis de poliacrilamida quimicamente modificados (Paam) para ultrapassarem as suas intrinsecamente não-Adhesive propriedades, incorporando monómeros de acrilamida funcionalizado com hidroxilo, durante a polimerização. Obtivemos um romance PAAm hidrogel, chamado hidroxi-PAAm, que permite a imobilização de qualquer natureza desejada das proteínas da MEC. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact permite controlar de forma independente a morfologia das células individuais, a rigidez da matriz, a natureza e a densidade das proteínas da MEC. Nós fornecemos um método simples e rápido que pode ser configurado em cada laboratório de biologia para estudar em processos Mecanotransdução células in vitro. Nós validar este romance plataforma bidimensional através da realização de experimentos em células endoteliais que demonstram uma ligação mecânica entre rigidez ECM eo núcleo.

Introduction

Muitos aspectos do microambiente celular local (por exemplo, rigidez, tamanho de poro, a natureza das proteínas, ou a densidade de célula-ligando) fornecer um conjunto de coordenadas de sinais de regulação que controlam os processos celulares tais como a motilidade, a proliferação celular, diferenciação, e a expressão do gene. As modificações das propriedades físico-químicas do ambiente extracelular pode ser percebida por células e provocar consequências fisiológicas diferentes, incluindo deformação da polarização celular, migração, e diferenciação. Ainda não está claro, no entanto, como as células traduzir modificações ECM em sinais bioquímicos celulares. Por isso, é de grande importância para engenheiro controlado em microambientes in vitro que podem reproduzir as interações entre células e seu microambiente para estudar vias Mecanotransdução. Para resolver este problema, que recentemente introduziu um novo método 1, chamado de hidrogéis-PAAm hidroxi, para gerar facilmente de dois centavomatrizes nsional suaves que permitem controlar de forma independente pistas Mecanotransdução importantes: a rigidez da matriz, geometria celular e confinamento, da natureza da proteína e densidade de células-ligante.

MEC orienta processos celulares através de gradientes em morphogens (quimiotaxia), proteínas adesivas (haptotaxia) e rigidez (durotaxis). Ao longo das últimas décadas, avançado em plataformas in vitro têm sido desenvolvidos para isolar esses sinais extracelulares, a fim de trazer à tona como as células são capazes de traduzir características bioquímicas e biofísicas em processos fisiológicos 2-5. Foram desenvolvidos por feixe de elétrons 6, 7 fotolitografia, imobilização fotoquímica de 8, ou técnicas assistidos por plasma 9 para dirigir o crescimento de células vivas nos substratos micropatterned. Embora essas técnicas tiveram resultados importantes, a maioria deles não permitem a discriminação entre a influência individual de diferentes pistas sobre o comportamento das célulase requerem instalações técnicas que alguns laboratórios podem pagar. Entre estas técnicas, a impressão microcontact (μCP), tem surgido como um método robusto e acessível para a criação de células-adesiva micro-ilhas 10. Mais recentemente, os esforços extensos 11-14 foram feitos para desenvolver hidrogéis com μCP em rigidez ajustáveis, a fim de reproduzir a vasta gama de rigidez observados em tecidos vivos. Entre essas obras, poliacrilamida (PAAm) tornou-se popular 15 e já é uma das matrizes à base de polímeros mais utilizados para estudos biomecânicos celulares ensaios.

PAAm superfícies são geralmente funcionalizada com o agente de reticulação heterobifuncional proteínas-sulfossuccinimidil-6-N [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) e de ECM são ligados à superfície através da activação de UV do nitrofenil sulfo-SANPAH grupos azida 16. Uma outra técnica consiste no acoplamento de hidrazina para proteínas que têm sido severamente oxidadocom periodato 17. Hynd e colaboradores introduzida uma técnica para padronizar as superfícies de hidrogel biomiméticos com proteínas e peptídeos que requer a fotopolimerização na presença de um monómero acroyl-estreptavidina 18. Mais recentemente, Tseng et al. Relataram um novo método micropatterning 19 com base na exposição à radiação UV profunda de PAAm através de uma máscara de quartzo óptico que requer a incubar geles PA activado com 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e soluções aquosas de N-hidroxissuccinimida (NHS) antes de adicionar a proteína. Apesar da capacidade destas técnicas para criar proteínas homogéneas e reprodutíveis micropadrões, a maior parte deles sofrem grandes limitações: os processos de síntese de longo (por exemplo, a diálise, liofilização, etc), compostos químicos caros (por exemplo, ácido hialurónico, sulfo-SANPAH) ou UV profundo irradiação. Além disso, estas técnicas não permitem a modulação independente de rigidez do substrato, micropatterngeometria, ECM natureza proteica, e a densidade celular-ligando.

Tendo em conta estas limitações, temos desenvolvido uma abordagem base de acrilamida e novos simples que permite a imobilização de uma variedade de proteínas e biomoléculas em hidrogéis macios e permite sintonia independente de sinais Mecanotransdução a fim de decifrar o seu papel em funções celulares. Em vez de tratar hidrogéis PAAm com compostos químicos agressivos, introduzimos um monômero acrilamida comercial com grupos hidroxila durante a polimerização PAAm. Esta operação simples supera a propriedade anti-aderente intrínseca de hidrogéis PAAm sem quaisquer outros requisitos técnicos.

A presença de grupos hidroxilo conduz a uma elevada afinidade de hidrogéis PAAm-hidroxi para proteínas e biomoléculas que formam interacções hidrogénio por entrelaçamento. Em combinação com μCP, hidrogéis-hidroxi PAAm permitir a rápida geração de plataforma cultura bidimensional com um controlo independentesobre a rigidez da matriz, o tipo de proteínas de ECM, a densidade celular ligando-confinado e adesividade, que está previsto para ser uma plataforma poderosa para o estudo Mecanotransdução.

O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a tomada facilmente hidrogéis-PAAm hidroxi sem qualquer experiência em ciências de materiais. O objetivo final é fornecer um meio para que os pesquisadores fazem perguntas fisiologicamente relevantes nos níveis celulares e teciduais que podem levar a uma melhor compreensão das vias Mecanotransdução envolvidas em mecanismos fisiopatológicos.

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Protocol

1. Ativando a superfície de lamelas de vidro

  1. Lugar de vidro lamelas circulares (25 mm de diâmetro) em uma placa de Petri e smear solução de NaOH 0,1 M nele por 5 min (Cobertura de vapores químicos recomendado).
  2. Remover a solução de NaOH e mergulhar totalmente lamelas com DDH 2 O estéril por 20 min enquanto balançando suavemente sobre uma placa de balanço em uma capa de cultura estéril.
  3. Escorra estéril DDH 2 O e repita o passo 1.2.
  4. Retirar as lamelas com pinças estéreis e colocá-los em uma nova placa de Petri com a face para cima ativado.
  5. Lamelas secas sob um fluxo constante de elevada pureza do gás de azoto.
  6. Num capuz de cultura estéril, esfregaço de uma fina camada de acrilato de 3 (trimetoxissilil) propilo (92%) do lado da lamela activado durante 1 h.
  7. Extensivamente lavar lamelas de vidro com 3 lavagens de DDH 2 O estéril e mergulha-as na DDH 2 O estéril em uma nova placa de Petri.
  8. Toque na placa de Petricom Parafilm e colocá-lo em uma placa oscilante sob agitação suave durante 10 min.
  9. Retirar as lamelas DDH 2 O, com uma pinça estéreis com pontas finas e coloque-os em uma nova placa de Petri com a face para cima ativado.
  10. Armazenar à temperatura ambiente, em local seco com papel alumínio para evitar que a poeira grude as lamelas.

2 Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis

  1. Prepara-se uma massa de 65 mg de acrilamida de N-hidroxietil (HEA) num tubo Eppendorf de 1,5 ml. É importante para preparar uma solução de HEA fresco.
  2. Adicionar 1 ml de tampão HEPES 50 mM de HEA e misture utilizando um agitador até à dissolução completa do HEA.
  3. Adicionar 400 ul de 40% w / w em solução de HEPES acrilamida e o volume necessário de 2% w / w em solução de HEPES bis-acrilamida (ver Tabela 1) para atingir a rigidez do hidrogel desejada. Ajustar com HEPES 50 mM a um volume final de 5 ml.
  4. Misture a solução com um agitador e degas TInuma câmara de vácuo durante 20 minutos, a fim de reduzir a concentração de oxigénio na solução, que evita a polimerização hidroxi-PAAm.
  5. Dentro de uma câmara estéril, filtrar a solução desgaseificados com um filtro de 0,2 um de tamanho de poro, de modo a esterilizar.
  6. Ative lamínulas de vidro circulares (22 mm de diâmetro), em um aspirador de UV / ozônio durante 7 min.
  7. Prepare a 100 ul de solução de persulfato de amónio (APS) 10%, que é de 10 mg de EPA 100 ul ddH 2 O. É importante para preparar uma solução de APS fresco.
  8. Adicionar 2,5 mL de tetrametilenodiamina (TEMED) e 25 ul de solução de APS ao hidroxi-PAAm solução esterilizada (passo 2.5), para iniciar a polimerização. Misture a solução por 3 pipettings sucessivas sem introdução de bolhas, em condições estéreis.
  9. Dentro de uma câmara esterilizada, colocar uma gota de 25 ul da solução de hidroxi-PAAm sobre uma lamela de 25 mm (disponível a partir do passo 1.9) e colocar imediatamente a gl 22 milímetroslamela de burro (preparado no passo 2.5) em cima da gota para espremer a solução de hidroxi-PAAm. Centralize a lamela de vidro 22 mm com pinças estéreis e eliminar possíveis bolhas.
  10. Permitir hidrogéis PAAm-hidroxi para polimerizar à temperatura ambiente durante 15 min. Inverta manualmente a solução restante hidroxi-PAAm no tubo Eppendorf a seguir à realização do processo de polimerização.
  11. Mergulhar totalmente lamelas com ddH2O estéril, e cuidadosamente separar as lamelas 22 mm de vidro através da introdução da extremidade de uma lâmina de barbear entre as lamelas de 22 mm de vidro e a camada de hidrogel hidroxi-PAAm.
  12. Lave hidrogéis-PAAm hidroxi com PBS estéril (3 trocas de PBS) e deixe o gel totalmente imersos em PBS estéril para manter a hidratação.
  13. Armazenar hidrogéis PAAm-hidroxi em PBS estéril, a 4 ° C durante até 3 dias.

3. polidimetilsiloxano (PDMS) Microstamp Fabrication

NOTA: A fabricação de um mestre de silício é necessária antes de start o PDMS fabricação microstamp. Este microfabricação de um mestre de silício pode ser feito por meio de técnicas de litografia, que requer equipamentos e treinamento especializado. Colaborações com uma instalação de nanofabricação são incentivados a fabricar o mestre de silício. Alternativamente, entre em contato com a empresa que fabrica os mestres de silício microestruturada feitos sob demanda. É importante notar que a fabricação do mestre de silício só precisa ser feito uma vez. Na verdade, os mestres de silício microstructured pode ser usado indefinidamente para produzir selos elastoméricos.

  1. Mistura de PDMS e o agente de cura em um proporção de 10: 1, num copo de plástico e homogeneizar utilizando uma pipeta de 10 min.
  2. Desgaseificar a mistura PDMS sob vácuo para remover as bolhas de ar que se formaram durante o passo 3.1.
  3. Coloque o mestre de silício microestruturada em uma placa de Petri e lançou a 10 mm de espessura da mistura de PDMS desgasado nele sem formar bolhas.
  4. Let curar o PDMS durante 2 horas a 60 ° C numaforno.
  5. Em um ambiente livre de poeira, peel-off da camada de PDMS e impostos especiais de consumo 1 cm 2 microstamps com um bisturi.
  6. Utilizando uma pinça, coloque PDMS microstamps padrão-up em uma placa de Petri.

4. micropatterning Hidroxi-PAAm hidrogéis

  1. Colocar solução PDMS microstamps em uma mistura de etanol / água (50/50) e sonicado durante 15 minutos.
  2. Secar os selos com uma corrente de fluxo de azoto, e colocá-los padrão-se num dispositivo de limpeza de UV / Ozono (λ <200 nm) durante 7 min.
  3. Dentro de uma câmara esterilizada, colocar uma gota de 150 mL de uma solução de proteína desejada (por exemplo, 100 ug / ml de laminina em PBS ou 25 ug / ml de fibronectina em PBS) para a superfície de uma microestrutura de 1 cm 2 de PDMS selo.
  4. Opcional: modificar a concentração da solução de proteínas para modular a densidade celular-ligando.
  5. Espalhar a solução de proteína através da superfície do selo, movendo-a com a ponta de uma pipeta estéril para cada cantoo selo.
  6. Deixar a solução de proteína para adsorver sobre o selo PDMS durante 60 minutos sob uma cobertura estéril. Desligue lâmpadas para evitar danos proteína.
  7. Dentro de uma câmara estéril, transferem-hidroxi PAAm lamelas revestidas (disponíveis a partir do passo 2.13) em uma placa de Petri.
  8. Remover o excesso de PBS a partir da superfície de substratos hidroxi-PAAm com um fluxo baixo de azoto sob condições estéreis. Parar o processo logo que há evidência de água que está sobre a superfície do gel é observado. O gel não deve ser completamente seca nesta fase.
  9. Secar cuidadosamente a superfície estruturada do PDMS selo com um fluxo constante de elevada pureza do gás de azoto.
  10. Segure o selo revestido de proteína com uma pinça de vestir e colocar a superfície estruturada em contato com a superfície do hidrogel seco. Aplicar os pontos de pressão breves com a ponta da pinça sobre a parte superior do selo PDMS para assegurar um bom contacto entre as microestruturas do selo e a superfície do hidrogel.
  11. Deixe o selo PDMS em the superfície do hidrogel durante 1 hora à temperatura ambiente.
  12. Remova cuidadosamente PDMS selos a partir de hidrogéis hidroxi-PAAm com uma pinça de vestir e seguir o passo 4.1 para limpar o selo.
  13. Lave exaustivamente os hidrogéis-PAAm hidroxi estampadas por 3 trocas de PBS (pH = 7,4) em condições estéreis por 10 minutos por troca.
  14. Opcional: micropadrões adicionais de outras proteínas de ECM podem ser adicionados ao PAAm hidroxi-superfície, seguindo passos 4,5-4,11.
  15. As zonas não impressas passivar com uma solução estéril de BSA a 5 mg / ml em PBS durante uma noite a 4 ° C, sob uma agitação suave em uma placa de balanço.
  16. Lave extensivamente por 3 trocas de PBS (pH = 7,4) em condições estéreis por 10 minutos por troca. Nesta fase, os hidrogéis-hidroxi PAAm estampadas podem ser armazenadas a 4 ° C até uma semana.

5. Deposição celular em micropatterned hidroxi-PAAm hidrogéis

  1. Incubar lamelas em mídia celular para 30-45 min antes de chapeamento cvaras.
  2. Lave as células aderentes cultivadas num frasco de 2 75 centímetros cultura com PBS estéril a 37 ° C e separá-lo com 3 ml de tripsina-EDTA ou Accutase durante 10 min.
  3. Transferir a quantidade desejada de pré-aquecido completa de meio de crescimento apropriado para a sua linha de células para dentro do frasco contendo as células destacadas e centrifugar a suspensão de células durante 3 minutos a 650 x g.
  4. Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e ressuspender as células em meio de cultura completo às 15-20,000 células / ml.
  5. Adicionar 4 ml da solução de células para uma lamela micropadronadas (obtido a partir do Passo 5.1) e colocar a lamela coberta por células em cultura numa incubadora a 37 ° C e 5% de humidade durante 1-2 horas.
  6. Aspirar delicadamente as células solto e substituir meio de cultura. Devolver as células ligadas à incubadora e deixá-los totalmente espalhar (3-6 horas, dependendo do tipo de célula).

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Representative Results

A Figura 1A apresenta a co-polimerização de acrilamida (AAm) e bisacrilamida (bis-AAm) com N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monómeros contendo um grupo hidroxilo primário formado por polimerização por radicais de uma rede aleatória hidrófila de poliacrilamida com grupos hidroxilo incorporados (hidroxi-PAAm) . Neste protocolo, um peso de 65 mg de HEA deve ser diluída num volume de 1 ml de HEPES. Sabendo-se que a densidade da HEA é aproximadamente igual a um, vamos supor que obtemos um volume de trabalho de 1.065 l (HEA + HEPES). Conforme apresentado na Tabela 1, a adição total de 1065 ul e 400 ul de AAM e 50 ul de bisAAm conduz a um volume de 1515 mL. Portanto, é necessário um volume de 3485 mL de HEPES para ajustar a solução a um volume final de 5 ml. Tal como indicado no passo 2.6, a superfície da lamela de vidro de 22 milímetros deve ser activado durante 7 min no UV / Ozono de modo a removê-la sem causarquaisquer danos à superfície do hidrogel. De facto, a superfície do vidro torna-se mais hidrofílica após o tratamento de UV / ozono e, por conseguinte, pode ser facilmente removida por imersão de todo o sistema de água. Além disso, o tratamento com UV / Ozono evita a contaminação química da lamela de 22 mm, o que está em contacto directo com a superfície do hidrogel. Esta técnica permite a obtenção de uma superfície circular plana de poliacrilamida (22 mm de diâmetro) ligado a uma lamela de vidro (25 mm de diâmetro).

Como apresentado na Figura 1B, micropadrões de proteínas pode ser criada sobre a superfície de hidrogéis hidroxi-PAAm por impressão microcontacto. Nesse procedimento experimental, a exposição de UV / ozono para permitir reduzir, temporariamente, a hidrofobicidade intrínseca dos selos PDMS pela formação de grupos silanol na superfície. Na verdade, a linha 185 nm produz ozônio a partir de oxigênio molecular, enquanto a linha 254 nm converte o ozônio para oxigênio atômico. Esta espécie reativa ataca as ba siloxanockbone de PDMS para formar rica camada de sílica-like SiOx oxigênio e grupos superficiais Si-OH. A superfície de PDMS oxidados é conhecido para recuperar a sua hidrofobicidade em apenas algumas horas após a exposição ao ar, devido à migração de baixo peso molecular, as cadeias poliméricas reticuladas da fase em massa para a superfície. Esta estratégia ajuda a difusão da solução de proteína na superfície do selo PDMS.

Uma das principais vantagens deste método é o de modular a rigidez de forma independente da matriz (Figura 2A), a geometria micropattern (Figura 2B), células de densidade de ligando (Figura 2C), e natureza proteica (Figuras 3A e 3B). Como mostrado na Figura 2A, os hidrogéis-hidroxi PAAm mostram uma dependência linear dos módulos elásticos na concentração do agente de reticulação a partir de alguns kPa a várias dezenas kPa, permitindo reproduções de obras da rigidez do microambiente celular. Figura 2B Figura 2C mostra que a célula -ligand densidade pode ser modulado através da variação da concentração da solução de proteína utilizada para incubar selos PDMS. Figura 3 apresenta uma imagem de fluorescência de linhas estampadas de colagénio através de laminina, fibronectina, e utilizando linhas de impressões microcontact sequenciais.

É interessante para os leitores notar que vários tamanhos e formas de micropadrões foram marcados de forma eficiente, independentemente da rigidez hidrogel. Temos reproduzido com sucesso microfeições de proteínas com arestas cortantes (por exemplo, triângulos e estrelas) e reto (por exemplo, linhas), ou (por exemplo, círculos) formas curvas, demonstrando que não há major limitação à complexidade padrão. Para o experimento de uma única célula, a área de superfície micropattern foi entre 400 e 2.500 mM 2, o valor mais baixo corresponde ao limite da viabilidade de célula única. Como muitos outros métodos baseados em micro-impressão, a principal limitação do método apresentado diz respeito à sua resolução espacial. Em hidrogéis duros (E> 10 kPa), a resolução espacial é em torno do micrômetro e determinada, principalmente, pela resolução do selo, que, em hidrogéis "soft", o limite de resolução torna-se, em parte, determinada pela deformação da superfície, que pode ocorrer durante o proteína de transferência.

A toxicidade de hidrogéis hidroxi-PAAm foi investigada pela quantificação da viabilidade das células endoteliais primárias banhado por um, 2, e 3 dias de cultura em homogeneamente revestido e microprinted hidrogéis hidroxi-PAAm moles (Figura 4A). Cerca de 80% dos HUVECs banhado em micropatterned suaves hidrogéis hidroxi-PAAm mantidosa sua viabilidade durante três dias, o que demonstra a biocompatibilidade de hidroxi-PAAm hidrogéis para a cultura de células. Curiosamente, a viabilidade similar foi obtido em nosso laboratório com células neuronais corticais primárias. Além disso, as células endoteliais primárias proliferam mais para "duro" (500 kPa), em comparação com (25 kPa) substratos "soft" (Figura 4B), indicando que este método proporciona um micro-ambiente apropriado para o estudo da proliferação celular através de uma ampla gama de rigidez .

Para dissociar o efeito da rigidez do substrato e área espalhando em Mecanotransdução, células endoteliais primárias (HUVEC) foram semeadas em micropadrões revestido de FN retangulares (área constante de 1,200 mM 2) depositado em hidrogéis hidroxi-PAAm de três rigidezes diferentes (2,5, 8,5, e 25 kPa). Em seguida, HUVEC foram coradas para os filamentos de actina, vinculina e DNA, seguindo um procedimento padrão imunocitoquímica, tal como se utiliza para a mamalian células semeadas em substratos de vidro. Nos substratos suaves, HUVECs exibem baixa densidade de fibras e um núcleo actina arredondada, ao passo que sobre substratos mais rígidos, as fibras de actina são mais espessas e reto e do núcleo deformado (Figura 5). As alterações na rigidez do substrato em constante área espalhando modular a tensão e de distribuição de fibras de stress de actina, o que resulta na remodelação do núcleo. Esta observação sugere que uma ligação mecânica entre a rigidez da matriz, o citoesqueleto, e núcleo.

Final proporção AAM / bisAAm AAm 40% (ul) Peso de HEA a dissolver em 1 ml de HEPES (mg) AAm bis (2%)
(Ul)
HEPES (ul) O módulo de Young
(3 10 Pa)
0,2 / 50
0,5 / 50
1/50
2/50
3/50
400
400
400
400
400
65
65
65
65
65
50
125
250
500
750
3485
3410
3285
3035
2785
~ 1.4
~ 3.6
~ 8.7
~ 17,2
~ 25

Tabela 1 Preparação de hidroxi-PAAm hidrogéis com vários factores de rigidez. Soluções de trabalho para preparar hidrogéis-PAAm hidroxi com rigidez final, variando de 1,4 a 25 kPa.

Figura 1
A Figura 1 (A) de acrilamida (AAm, a preto), N, N'-metilenobisacrilamida (bis-AAm, em azul) e N-hydroxyethylacrylamide (HEA, em vermelho) foram misturados em conjunto para formar hidroxi Hidrogéis. PAAm (b) Representação esquemática das diferentes etapas do procedimento micropatterning em hidrogéis hidroxi-PAAm. A solução de proteína é incubada primeiro durante 1 hora sobre a face de uma estrutura microstamp (passo 1). A superfície de hidrogel é gentilmente seca com um fluxo de azoto (passo 2). O microstamp é então colocado em contacto com a superfície do formal de hidroxi-PAAm durante 1 hora (passo 3). Depois de lavagens sucessivas, a superfície microprinted é passivado com uma solução estéril de BSA depositada O / N a 4 ° C (passo 5) para bloquear as áreas não impressas. Por fim, o PAAm hidroxi-superfície microprinted é lavado várias vezes com PBS estéril e está pronto para a semeadura de células (etapa # 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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A Figura 2 (A) A evolução da rigidez de hidrogéis PAAm-hidroxi está linearmente correlacionado com a quantidade de bis-AAm de reticulação (a linha vermelha representa uma regressão linear, com R 2 = 0,995). Imagens (B) de fluorescência micro-características laminina retangular estampadas em hidrogéis hidroxi-PAAm de diferentes rigidezes (E = 2,5, 15 e 40 kPa). As barras de escala correspondem a (A) 65 uM, (B) de 80 um, e (C) de 50 ^ m. (C) As linhas paralelas de 15 mm de largura forma um gradiente de LM em hidrogel 25 kPa hidroxi-PAAm, como indicado pela evolução do perfil de intensidade de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura imagem 3 (A) Imunofluorescência de fibronectina (em vermelho) e laminina (em verde) listras cruzados a 90 °. (B) Multilabeling de fibronectina (em vermelho), laminina (em verde) e colágeno (em azul) listras microprinted posteriormente, sobre um substrato de 25 kPa hidrogel PAAm. Barras de escala correspondem a 30 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 (A) A quantificação da viabilidade das células demonstraram excelente sobrevivência celular em 24, 48, e 72 horas depois de serem semeadas em homogeneamente revestido e micropadronadas superfícies hidroxi-PAAm. O número indicado nao fundo de cada barra corresponde ao número total de células contadas para o ensaio de viabilidade. (B) Quantificação da proliferação de HUVEC em 25 e 500 kPa homogeneamente substratos revestidos após 1 (barras brancas) e 7 (barras hash) dias de cultura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5 imagens fluorescentes das células endoteliais primárias imunoistoquímica, cultivadas em micropadrões revestido de FN retangulares, que foram depositados em hidrogéis hidroxi-PAAm de 2,5 kPa, 8,5 kPa e 25 kPa (da esquerda para a direita). As fibras de stress de actina (em verde ) foram marcadas com Alexa Fluor 488 phalloidin, adesões focais (em vermelho) foram marcadas com um polyclo ratoanticorpo primário nal e marcadas com um anticorpo secundário IgG vermelho fluorescentes e o ADN foi corado com DAPI em azul. As barras de escala correspondem a 17 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Muitos em observações in vitro em moderna biologia celular ter sido realizada em lamelas de vidro rígidas, muitas vezes revestidos com uma fina camada de proteínas de ECM ou de péptidos sintéticos contendo a sequência RGD. No entanto, tais substratos de cultura básicos não recapitular toda a complexidade físico-química da ECM e, portanto, não fornecem um modelo exato para o estudo de processos Mecanotransdução celulares. Para resolver este problema, propomos uma alternativa simples para funcionalizar hidrogéis bidimensionais com qualquer quantidade desejada ea natureza das proteínas da MEC. Este método permite o controle independente de sinais Mecanotransdução importantes, tais como a rigidez da matriz, a morfologia celular e do parto ou a densidade celular-ligando. Além disso, os hidrogéis hidroxi-PAAm superar uma das maiores limitações dos métodos de funcionalização de corrente, que é a incapacidade de se imobilizar e para controlar a distribuição espacial de mais do que uma proteína da MEC. Devido à elevada afinidade dos hidroxy-PAAm hidrogéis para biomoléculas, pode-se controlar a distribuição espacial de várias proteínas de ECM na mesma superfície, independentemente da rigidez da matriz, utilizando microprintings sequenciais, que não requerem qualquer equipamento adicional.

Propomos um novo procedimento baseado na incorporação de grupos hidroxila dentro de hidrogéis de acrilamida para superar suas propriedades intrinsecamente não-adesivas com os requisitos mínimos em termos de custo ou de especialização. Em comparação com as técnicas existentes para padronizar as proteínas em hidrogéis, o método hidroxi-PAAm evita o uso de produtos químicos tóxicos (por exemplo, hidrato de hidrazina), agentes de reticulação fotorreactivos caros (por exemplo, sulfo-SANPAH) e a dependência da potência da lâmpada de UV e ao posicionamento funcionalizar hidrogéis macios. Hidrogéis Hidroxi-PAAm permanecer estável e activo durante várias semanas, podem ser produzidos em massa, facilmente microprinted e sua elevada afinidade para biomoléculas permite investigar os efeitos sinérgicos deproteínas da MEC conjugados sobre as funções celulares. Além disso, os hidrogéis hidroxi-PAAm pode ser usado para investigar quantitativamente a quantidade de forças exercidas pelas células contrácteis no seu microambiente circundante. De facto, mostrámos previamente que 1,20 esferas fluorescentes podem ser facilmente incorporados em hidrogéis hidroxi-PAAm, a fim de utilizar a microscopia de força de tracção de célula (TFM) para medir o campo de deslocamento e estimar o campo de tracção resultante exercida por células eucarióticas semeadas em micropadrões bidimensionais.

Tal como muitos outros métodos baseados em micro-impressão, a principal limitação de hidrogéis PAAm-hidroxi refere-se à resolução espacial de microestruturas de proteína. Em hidrogéis rígidas (E> 10 kPa), a resolução espacial é de cerca de um micrómetro, e determinada, principalmente, pela resolução do selo, dependendo da técnica de litografia utilizada para fabricar o molde de silicone. Em hidrogéis mais suaves, a resolução espacial torna-se, em parte, determinada por the deformação da superfície durante a transferência de proteína, a qual torna-se a principal limitação para alcançar micrómetro resolução espacial. A abordagem aqui apresentada é atualmente limitado a substratos bidimensionais. No entanto, este método é altamente escalável e novos estudos estão em andamento em nosso laboratório para estender este método para estruturas tridimensionais.

Esperamos que hidrogéis hidroxi-PAAm pode ajudar a decifrar os mecanismos fundamentais de processos celulares e de tecidos complexos, que estão intimamente relacionados com as propriedades físico-químicas do microambiente celular 21,22, incluindo o desenvolvimento embrionário, respostas inflamatórias, cicatrização de feridas, crescimento de neuritos, tecidos adultos homeostase, e na patogênese de doenças como a fibrose e câncer.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV/Ozone Photoreactor Ultra-Violet Products Model PR-100
Rocking plate IKAcWerke Model KS 130 Basic
Vortexer Scientific Industries Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber Applied Vacuum Engineering DP- 8-KIT
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip Sigma-Aldrich Z225304-1EA
Dressing tissue forceps Sigma-Aldrich F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene Sigma-Aldrich P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm Sigma-Aldrich 266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) Millipore GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter) Neuvitro GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter) Neuvitro GG-25
Variable volume micropipette Sigma-Aldrich Z114820
Protein microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA
Scalpel handles Sigma-Aldrich S2896-1EA
Scalpel blades Sigma-Aldrich S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2) Sigma-Aldrich CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) Sigma-Aldrich Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane  Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder) Sigma-Aldrich A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide) Sigma-Aldrich 146072
N-Hydroxyethylacrylamide Sigma-Aldrich 697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281
Amonium PerSulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate Sigma-Aldrich 1805
Human Plasma Fibronectin Millipore FC010
Laminin from EHS Sigma-Aldrich L2020
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium Cells Applications 211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Invitrogen C-003-5C
Accutase PAA laboratories L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O Sigma-Aldrich 83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics PAA laboratories P11-002
Phosphate Buffer Saline solution PAA laboratories H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin Molecular Probes A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine Molecular Probes T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit) Sigma-Aldrich F3648
Streptavidin  Sigma-Aldrich 41469
Anti-Laminin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich L9393
Anti-rabbit IgG-FITC Sigma-Aldrich F7512
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Absolute ethanol Sigma-Aldrich 459844-2.5L

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References

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