التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا المقال بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون في المختبر باستخدام منظم الإضاءة مجهرية (SIM). فائقة الدقة باستخدام المجهر SIM توفر دقة وضوح الصورة بشكل كبير إلى أبعد من الحد حيود الضوء في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة، والسماح للتصوير العمود الفقري شجيري الفردية مع تحسين التفاصيل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العمود الفقري شجيري هي نتوءات الناشئة من التغصنات من الخلايا العصبية وتمثل الأهداف بعد المشبكي المدخلات الأولية مثير في الدماغ. وقد حددت هذه الهياكل التقدم التكنولوجي كعناصر رئيسية في اتصال الخلايا العصبية واللدونة متشابك. يبقى التحليل الكمي من التشكل العمود الفقري باستخدام المجهر الضوئي والمشكلة الأساسية بسبب القيود التقنية المرتبطة حد الانكسار الجوهرية للضوء. العمود الفقري شجيري يمكن تحديدها بسهولة من قبل متحد البؤر الليزر المسح المجهري مضان. ومع ذلك، وقياس التغيرات الطفيفة في الشكل والحجم في العمود الفقري صعب لأن أبعاد العمود الفقري غيرها من طول وعادة ما تكون أصغر من القرار البصرية التقليدية التي يحددها قرار الحد النظري المجهر الضوئي من 200 نانومتر.

وقد استخدمت العديد من التقنيات فائقة القرار وضعت مؤخرا لصورة الخلوية هياكل أصغر من 200 نانومتر، بما في ذلك العمود الفقري شجيري. Tوتستند تقنيات ذات المناظر على عمليات بعيدة الميدان الكلاسيكية، وبالتالي تسمح باستخدام أساليب إعداد العينات الموجودة وراء صورة سطح العينة. الموصوفة هنا هو بروتوكول عمل لتطبيق القرار السوبر منظم إضاءة المجهر (SIM) لتصوير العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين في الثقافات الأولية. التطبيقات الممكنة لSIM تتداخل مع تلك المجهري متحد البؤر. ومع ذلك، فإن اثنين من تقنيات تقديم انطباق مختلفة. يقدم SIM القرار الوحشي أعلى فعالة، في حين المجهري متحد البؤر، وذلك بسبب استخدام الثقب المادية، يحقق القرار التحسن على حساب إزالة من ضوء التركيز. في هذا البروتوكول، والخلايا العصبية الأولية هي مثقف على coverslips الزجاج باستخدام بروتوكول قياسي، transfected مع البلازميدات الحمض النووي ترميز البروتينات الفلورية وتصويرها باستخدام SIM. بروتوكول الموصوفة هنا كله يستغرق حوالي 2 أسابيع، ليتم تصوير العمود الفقري شجيري بعد 16-17 يوما في المختبر، عندالتنمية شجيري هو الأمثل. بعد الانتهاء من البروتوكول، العمود الفقري شجيري يمكن إعادة بنائها في 3D من سلسلة من مداخن صورة SIM باستخدام البرمجيات المتخصصة.

Introduction

A العمود الفقري شجيري هو نتوء صغير من غشاء الخلايا العصبية. وتتخصص هذه البنية المميزة لتلقي المدخلات عادة من المشبك واحد، ويمثل منطقة الاتصال الجسدي بين اثنين من الخلايا العصبية. تتكون معظم العمود الفقري شجيري ناضجة وظيفيا من طرف كروي، رئيس يطلق عليه، والعنق رقيقة الذي يربط الرأس إلى رمح شجيري. ومع ذلك، العمود الفقري ليست ثابتة وتتحرك بنشاط وتغيير التشكل بشكل مستمر حتى في الدماغ الكبار 2. خلال فترة 2 أسبوع من الوقت، الفئران الثقافات الخلايا العصبية قرن آمون الأولية المستمدة من أواخر الجنينية أو بعد الولادة المبكرة الوقت تطوير العرش شجيري معقدة مع العديد من نتوءات الغشاء الذي يتطور من filipodia في وقت مبكر لهياكل مثل العمود الفقري 3. على أساس هذا السلوك الديناميكي وغيرها من الخصائص، ويعتقد أن العمود الفقري شجيري لتوفير الركيزة التشريحية لتخزين الذاكرة ومتشابك 4،5 الإرسال.

نظرا عشره الدور الحاسم الذي شجيري العمود الفقري حجم وشكل وظيفة في متشابك، من المهم لقياس أبعادها بدقة. العمود الفقري تختلف من حوالي 200 إلى 2،000 نانومتر في طول ويمكن التعرف بسهولة عن طريق الليزر متحد البؤر المسح المجهري مضان. ومع ذلك، أبعاد العمود الفقري غيرها من طول وعادة ما تكون أقل من القرار النظم البصرية التقليدية '، ثابت نظريا بواسطة حيود نحو 200 نانومتر 6. حل هذه القوى غير كافية لتصوير التفاصيل الدقيقة، مثل عرض رقاب العمود الفقري ورؤساء. فقد تم تخصيص الكثير من العمل على حل هذه المشكلة وقدمت العديد من التقنيات الجديدة نسبيا المجهر فائقة القرار تقدما كبيرا. على وجه الخصوص، فمن الممكن لتحقيق القرار إلى أبعد من الحد الكلاسيكية دون تجاهل أي ضوء الانبعاثات باستخدام منظم أفقيا إضاءة المجهر (SIM) في واسعة المجال، مجهر غير متحد البؤر 7-10. باستخدام هذه التقنية في تركيبة مع غير الخط-تقنيات المجهر ص، فمن الممكن نظريا لتحسين القرار الوحشي المجهر الضوئي من قبل عامل غير محدود 11. ومع ذلك، في معظم الظروف التجريبية، SIM يسمح لتجاوز الحد القرار من قبل عامل من اثنين 1. تقنيات المجهر الضوئي فائقة الدقة أخرى مثل استنزاف الانبعاث المستحث (STED) المجهري 12 والصور تفعيل توطين المجهري (النخيل) 12 تم تطبيقها على التصوير من العمود الفقري شجيري. الأساليب القائمة على توطين مثل النخيل تتطلب أعدادا كبيرة جدا من الصور الخام لتحقيق فائقة الدقة، وبالتالي فهي محدودة في السرعة. من ناحية أخرى، يمكن تحقيق STED عالية السرعة التصوير، على الرغم من التهم الفوتون منخفضة نسبيا وحقول صغيرة للعرض، والتي قد لا يكون هذا هو الحال لSIM 13.

في هذه المقالة أن الهدف هو توفير بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الابتدائي تربيتها في المختبر

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تحسين جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات لتقليل معاناة الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجنة التجارب على الحيوانات، جامعة أمستردام، ديسمبر بروتوكول # DED204 وDED250.

1. إعداد ساترة

  1. خفض لل coverslips إلى حجم 15 ملم × 15 ملم باستخدام كربيد أو الماس الكاتب، بحيث تنسجم مع آبار من لوحة 12 جيدا.
  2. بينما كان يعمل في غطاء الدخان، وبدء طلاء ساترة عن طريق غمر بالكامل coverslips في حل حامض النيتريك المركز (70٪ وزن / وزن) في وعاء زجاجي. لضمان التوزيع حتى هزة، ثم احتضان لمدة لا تقل عن 4 ساعة. فمن الممكن لإعادة استخدام محلول حمض النتريك لحوالي 2 مرات، ولكنه يمكن أن تفقد اللون عن طريق التعرض للضوء.
  3. إزالة محلول حمض النتريك وغسل coverslips أربع مرات في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة، والهز بعناية بعد كل غسل.
  4. بحذر إزالةالماء.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات الثلاث المقبلة في العقيمة مجلس الوزراء تدفق الصفحي.
  5. نقع لل coverslips في 96٪ ETOH. إزالة لل coverslips من الحل ETOH والسماح لهم الجافة.
  6. لهب لل coverslips ووضعها في وعاء زجاجي. استخدام ملقط غرامة لمعالجة لل coverslips (نمط دومون ملقط NO.5 على سبيل المثال).
  7. تغطية الحاويات بورق الألمنيوم ويخبز في فرن الجافة للحرارة ل12-16 ساعة عند 180 درجة مئوية. ويمكن تخزين coverslips يخبز في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 في الشهر إذا غطت بإحكام.

2. ساترة طلاء

تفضل الإجراء ساترة طلاء مرفق الخلايا العصبية على سطح الزجاج وتشجر شجيري 14.

  1. في الصفحي هود العقيمة، واستخدام ملقط صغير معقم لوضع لل coverslips الفردية في الآبار واحد من 12 لوحة جيدا.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من بولي-L يسين حل (أو كميات كافية لغمر لل coverslips).
  3. التفاف رانه لوحة في رقائق الألومنيوم لمنع التبخر وترك الأمر بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  4. قبل البدء في الثقافة، نضح-L-يسين بولي حل بعناية في الصفحي هود العقيمة.
  5. غسل كل بئر مع 1 مل من الماء المعقم مرتين، في حين منعهم لتجف.
  6. نضح الماء تماما، إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة وترك لل coverslips في الحاضنة زراعة الأنسجة حتى على استعداد لوحة الخلايا. فمن المستحسن لوحة الخلايا في غضون 24 ساعة.

3. إزالة الأمخاخ من E16-E19 الجرذ الأجنة

  1. تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق تسخين لهم في التعقيم الجافة بين عشية وضحاها أو غسلها مع 70٪ ETOH. يجف تماما إذا تم استخدام ETOH.
  2. إعداد العديد من الأطباق 30 ملم مع عازلة 1X HBSS والاحتفاظ بها على الجليد.
  3. الموت ببطء السد الفئران مع حقنة داخل الصفاق من Euthasol (160 ملغ / كغ Euthasol في حجم ± 0.4 مل).
  4. تحقق من عدم وجود ردود الفعل.
  5. رش البطن السد مع 70٪ ETOH.
  6. إجراء شق على طول البطن وإزالة الرحم.
  7. إزالة الأجنة من الرحم ووضعها في 100 مم طبق بتري.
  8. إزالة رؤوس الأجنة مع مقص كبير ووضع رؤساء في طبق بتري جديدة تحتوي الباردة العازلة 1X HBSS.
    ملاحظة: من هنا إلى الخطوة 7.1 يتم تنفيذ الإجراء تحت ظروف معقمة في مجلس الوزراء تدفق الصفحي.
  9. باستمرار رؤساء على طول الجانبين مع ملقط كبير.
  10. مع مقص صغير، وجعل خفض السهمي في الجلد على الجزء العلوي من الرأس، ثم تقشر الجلد أفقيا أسفل مع ملقط كبير.
  11. استخدام النهج نفسه كما في الخطوة 3.10 لإزالة الجمجمة. اجراء خفض السهمي ابتداء من نهاية الذيلية؛ فتح الجمجمة بلطف دون الإضرار أنسجة المخ. أضعاف نصفي الجمجمة أفقيا بعيدا تعريض الدماغ.
  12. مع ملعقة حادة، يستخرج الدماغ ووضعه في العذبة الباردة 1X HBSS.
  13. 4. تشريح الحصين

    من المهم جدا أن يتم تشريح في أسرع وقت ممكن في ظروف معقمة لضمان بقاء الخلية. الحفاظ على عينات الباردة على الجليد.

    1. إزالة والتخلص من المخيخ مع مقص غرامة.
    2. تفصل بين نصفي الدماغ من خلال جعل خفض السهمي على طول خط الوسط.
    3. اتخاذ كل نصف الكرة الأرضية ووضع حد سواء في الجديدة 30 ملم صحن يحتوي الطازجة الباردة 1X HBSS.
    4. وضع كل نصف الكرة بحيث يواجه الفص الصدغي الجزء السفلي من الطبق.
      ملاحظة: من هنا، فمن المستحسن استخدام مجهر تشريح.
    5. عقد بلطف الدماغ المتوسط ​​باستخدام ملقط صغير وإزالة المخ الأوسط مع زوج آخر من الملقط. ترك ما تبقى من نصف الكرة سليمة تحتوي على القشرة والحصين.
    6. تسليم الأنسجة، بحيث الحصين يواجه الآن الجزء السفلي من الطبق.
    7. عقد بلطف نصف الكرة في عالدانتيل مع ملقط غرامة. باستخدام ملقط غرامة أخرى، بعناية وبلطف إزالة السحايا. فمن السهل أن تبدأ في البصلة الشمية. توخي الحذر حتى لا يلحق الضرر الحصين.
    8. توجيه الأنسجة بحيث الحصين يواجه الآن تصل. ويمكن الآن أن ينظر إلى قرن آمون بواسطة مميزة هيكلها على شكل حرف C.
    9. باستخدام ملقط غرامة، تشريح خارج الحصين. لانه جمع في الجديدة 30 ملم صحن يحتوي الطازجة الباردة 1X HBSS.

    5. التفكك الخليوي وتصفيح

    1. عد العدد الإجمالي للالحصين، ثم قطع منها الى قطع صغيرة.
    2. جمع القطع في 15 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 3 مل 1X HBSS.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية طاف.
    4. إضافة 6 ميكرولتر التربسين في قرن آمون.
    5. احتضان لمدة 20 دقيقة كحد أقصى في 37 درجة مئوية. دوامة بعد 3 دقائق.
    6. يغسل مرتين مع 5 مل من 1X HBSS الطازجة الباردة وتجاهل طاف.
    7. بعد سك الثانية يغسل، إضافة 1.5 مل من الطلاء المتوسطة، استعد مسبقا إلى 37 درجة مئوية. سوف المصل في المتوسط ​​الطلاء تعطيل النشاط التربسين.
    8. يسحن ببطء 30X مع باستور ماصة مصقول النار حتى تنتشر كل قطعة من نسيج متجانس في الخلايا واحد. تجنب أي فقاعات.
    9. إضافة 5 مل من الطلاء المتوسطة استعد مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
    10. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق تلطيخ الحيوية.
    11. البذور 50،000 خلايا لكل بئر من لوحة 12 جيدا في 1 مل تصفيح المتوسطة، الذي أعد في القسم 2 (مجموع حجم 2 مل).
    12. صخرة بلطف لوحة لتوزيعها بالتساوي الخلايا.
    13. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. بعد 2-3 أيام، واستبدال نصف المتوسطة الطلاء (0.5 مل) مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر FUDR.
      ملاحظة: يتم تنفيذ التصوير العمود الفقري شجيري 16-17 يوما بعد الطلاء (16-17 أيام في المختبر، DIV).

    6. الجرذ الحصين الابتدائية عصبون ترنسفكأيشن باستخدام Lipofectamine

    > في DIV و transfected 14-15 الخلايا العصبية باستخدام بروتوكول التالية:

    1. إعداد الحمض النووي البلازميد معربا عن GFP والحضانة المتوسطة (10 مل من المتوسطة Neurobasal مع 100 ميكرولتر من glutamax).
    2. قبل الدافئة المتوسطة الحضانة إلى 37 درجة مئوية.
    3. تحضير مزيج الحمض النووي (أنبوب A). لكل ساترة إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 100 ميكرولتر من السهل المتوسطة Neurobasal. المزيج بلطف.
    4. إعداد Lipofectamine مزيج (أنبوب B). لكل ساترة إضافة 2 ميكرولتر Lipofectamine في 100 ميكرولتر من السهل المتوسطة Neurobasal. المزيج بلطف.
    5. إضافة مزيج Lipofectamine إلى قطرة قطرة مزيج الحمض النووي.
    6. احتضان في غطاء تدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. إضافة 1 مل من قبل حرارة متوسطة الحضانة لوحة 1.
    8. متجر لوحة 2 لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    9. إضافة قطرة قطرة بلطف 200 ميكرولتر من الحمض النووي / Lipofectamine المزيج إلى كل بئر واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    10. مع استخدام ملقط صغير رفع coversliملاحظة تحتوي على الخلايا العصبية وشطف لهم عن طريق غمس لهم في طبق 3 سم تحتوي الطازجة المتوسطة Neurobasal دافئة ونقلها إلى لوحة 2.
    11. احتضان الخلايا العصبية transfected عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.
    12. تحقق من كفاءة ترنسفكأيشن 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

    7. المناعية وتركيب الخلايا العصبية الفئران الحصين الابتدائية

    لتحسين كثافة مضان في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، تنفيذ بروتوكول المناعية لتعزيز الكشف عن GFP 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

    1. إعداد PFA 4٪ و 0.05 M TBS.
    2. تدفئة 4٪ PFA حل ل37 درجة مئوية.
    3. نضح بلطف المتوسطة من الآبار التي تحتوي لل coverslips.
    4. إضافة 500 ميكرولتر من الحارة 4٪ PFA بعناية لمنع الإضرار التشعبات.
    5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    6. تغسل مع HBSS 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن تخزين العينات تصل إلى 3 أسابيع في 4 درجات مئويةأو المناعية يمكن أن تبدأ على الفور.
    7. إذا تم تخزين العينات، ويغسل مع 0.05 M TBS 3 مرات لمدة 5 دقائق.
    8. منع مع TBS-BSA (1٪) حل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    9. يغسل مع 0.05 M TBS 3 مرات لمدة 5 دقائق.
    10. إضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في مزيج الحضانة.
    11. احتضان لوحات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    12. علاوة على ذلك، احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
    13. إزالة الأجسام المضادة الأولية.
    14. يغسل مع 0.05 M TBS 3X لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: من هذه النقطة، والحفاظ لل coverslips محمية من الضوء.
    15. إضافة الأجسام المضادة فلوري، مترافق الثانوية مخففة في مزيج الحضانة.
    16. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    17. إزالة الأجسام المضادة الثانوية.
    18. يغسل مع 0.05 M TBS 3 مرات لمدة 5 دقائق.
    19. يغسل مع 1X السل 2 مرات لمدة 5 دقائق.
    20. استخدام ملاقط غرامة لإزالة لcoverslips من الآبار.
    21. تجف أي فائض من السل بمنديل وتركيب COVerslips باستخدام تصاعد المتوسط.
    22. ختم بطلاء الأظافر لمنع تبخر تصاعد المتوسط.

    8. شجيري العمود الفقري التصوير باستخدام الميكروسكوب هيكل الإضاءة

    شجيري العمود الفقري التصوير باستخدام نظام SIM هو موضح في المواد لديها من القرار الوحشي (XY) قيمة ما يقرب من 85-110 نانومتر وقيمة المحوري (Z) القرار بين 200-250 نانومتر، وتوفير عامل من 2 مرات التحسن في القرار مقارنة المجهر واسعة المجال.

    ملاحظة: يتم شجيري العمود الفقري باستخدام التصوير SIM عادة بعد 2 أيام الخطوة 7.22، ولكن يمكن القيام به تصل إلى 3 أسابيع في وقت لاحق إذا كان يتم الاحتفاظ العينات في الظلام وتحت درجة حرارة رقابة من 22-23 درجة مئوية.

    1. بدوره على الليزر 488 نانومتر، ومصباح الزئبق، وحدة تحكم المرحلة، وحدة تحكم بيزو، ومصابيح الهالوجين للضوء المنقولة والكمبيوتر وبدء البرنامج SIM في "ANDOR لN-SIM" واسطة.
    2. تنظيف الكائن TIRF 100Xإيف مع الايثانول 95٪ ثلاث مرات، وإذا لزم الأمر مع اثير البترول.
    3. استخدام إعدادات التصفية التالية: 520 ليرة لبنانية مع 488 مزدوج اللون.
    4. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف. تحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في الإفلات النفط. تحرك الهدف صعودا حتى تلامس النفط العينة.
      ملاحظة: ضع غطاء على خشبة المسرح لحماية عينة من الضوء المحيط وتحت أضواء خافتة في غرفة قدر الإمكان.
    5. تعيين طوق تصحيح الهدف إلى 37 ° C، 200 ميكرون، للحصول على أفضل التماثل من قوات الأمن الفلسطينية. من أجل تعيين الموضع الصحيح طوق، المركز الأول في حلقة الهدف في موقف الاسمية الأمثل ومن ثم تحقق عينة حبة 100 نانومتر. وفقا لأفضل التماثل قوات الأمن الفلسطينية، وتغيير طفيف في موقف طوق حول واحدة رمزية.
    6. للإضاءة، واستخدام 3D-SIM صريف (3D 1layer 100X/1.49 جميع الأطوال الموجية). للبدء في مكان المحاذاة صريف صريف كتلة المحددة إلى إضاءة SIM، مع 100X 1.49 هدف في المكان. استخدام عينة حبة 100 نانومتر التي شنت في وسائل الإعلام، مع التركيز التي يمكن أن تسمح بعزل 10-15 حبات لمجال الرؤية (فوف). بعد تعيين طوق تصحيح الهدف إلى الموضع المطلوب، حدد الإضاءة 3D-SIM والبدء في إجراء محاذاة موجهة البرمجيات. فستعمل (5 مراحل) × (1 الاتجاه) × (Z-100 طائرات) صور، من الذي سيكون إعادة بناء فوف مع الخرز. بعد اختيار حبة واحدة عن طريق العائد على الاستثمار المناسبة، والتي تغطي حبة بأكملها بما في ذلك عدم وضوح ضوء خارج التركيز، يقوم البرنامج بدء PSF التلقائي المناسب، وسوف ضبط الموقف صريف وفقا لنتيجة.
    7. للتحقق من أداء المجهر، كرر المحاذاة صريف كل 2 أسابيع، وذلك بسبب اختلال المحتملة الناجمة عن الحركات طاولة و / أو درجة الحرارة الانجراف. علاوة على ذلك، أيضا التحقق من كثافة الليزر والاستقرار وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة.
    8. تنظيف سطح العينة مع 95٪ ETHالآلام ثلاث مرات.
      ملاحظة: للحصول على الخطوات القادمة انظر الشكل 3 للاطلاع على لوحات التحكم والضبط الصحيح في داخل البرنامج SIM.
    9. في البرنامج SIM، حدد تكوين بصري العين FITC وتحديد كتلة مرشح فارغة في برج 1 للتفتيش البصرية مع الضوء الأبيض.
    10. تعيين سرعة التركيز وسرعة السفر من الجدول XY ل"الجميلة".
    11. فتح مصراع بسرعة والتركيز على العينة.
    12. إغلاق مصراع الكاميرا مرة أخرى وتعيين Z-تنسيق إلى الصفر.
    13. حدد مرشح الخضراء في برج 1 للتفتيش البصرية باستخدام قناة خضراء.
    14. تعيين شدة مصباح الزئبق إلى أدنى الإعداد.
    15. انتقال إلى الحدود من العينة بعناية، والتأكد من أن الهدف لا تلمس تسرب.
    16. فتح مصراع الكاميرا ومسح بسرعة من خلال عينة مع شدة ادنى حد ممكن.
    17. على مواجهة والتغصنات مشرق بما فيه الكفاية من الاهتمام وتركز جزء من الفائدةفي مجال الرؤية، وإغلاق مصراع الكاميرا.
    18. تعيين البرنامج لتكوين بصري 3D-SIM 488 وإعدادات الكاميرا إلى وضع تلا EM، وكسب 1 ميغاهيرتز 16 بت، وقت التعرض 100 ميللي ثانية، قوة الليزر 5٪ وكسب EM 200.
      ملاحظة: تأكد من أن يتم تحديد مرشح الخضراء في برج 2 وأن برج 1 فارغ.
    19. تأكد من أن يتم تعيين صريف إلى 'نقل' وانقر لايف لعرض عينة مع ضوء الليزر وذلك من خلال الكاميرا.
    20. تفعيل بحث لأعلى الجدول.
    21. توسيط كائن من الفائدة إذا لزم الأمر والتركيز مع سرعة التركيز لتعيين الجميلة إضافية.
      ملاحظة: في وضع قراءة العداد EM كسب 1 ميغاهيرتز 16 بت، وشدة المستهدفة للحصول على صورة جيدة SIM ما بين 30،000-45،000.
    22. ضبط إعدادات الكاميرا بسرعة للحصول على قيمة كثافة بين 30،000-45،000 في وضع قراءة العداد EM كسب 1 ميغاهيرتز 16 بت. استخدام البداية:
      1. قوة الليزر: 0٪ - 20٪ (مع عينات أعدت على النحو المبين أعلاه، 5٪ أو 2.6 ميغاواط كافية)
      2. وقت التعرض:50 ميللي ثانية، 2 ثانية
      3. وضع قراءة العداد: EM كسب 1 ميغاهيرتز 16 بت
      4. EM كسب: 0-300
      5. كسب التحويل: 1X - 5.1x
      6. تنسيق لايف: لا binning
      7. تنسيق لقطة: لا binning
        ملاحظة: هذه الإعدادات مع 6.3٪ ± 1.3٪ تبيض ويتحقق بشكل روتيني، في حدود 10٪ من الحد الأقصى تبيض مقبولة، والتي يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على جودة الصورة 15.
    23. انقر فوق إيقاف لإيقاف عرض لايف.
    24. تكوين إعدادات 3D Z المكدس في لوحة تسلسل ND إلى:
      1. المدى: 2 ميكرومتر
      2. حجم مجموعة: 120 نانومتر
      3. Z الطائرة
      4. انقر موقف الرئيسية
      5. حدد تكوين بصري 3D-SIM 488 في القسم امدا
    25. حدد 3D-SIM كوضع الاستحواذ في منصة N-SIM.
    26. تشغيل تسلسل اكتساب ND وحفظ البيانات الخام.
    27. حدد تكوين بصري العين FITC مرة أخرى وكرر الخطوات 8،15-8،27 حتى تم تصويرها العينة بأكملها
    28. إعادة الإعمار 3D صورة: إن البيانات التي حصل عليها في الخطوة 8.23 ​​يمكن أن تكون إما بناؤها على الفور أو في وقت لاحق. تبدأ من خلال إعادة بناء Z مكدس مع الإعدادات الافتراضية إعادة الإعمار في إعادة بناء أو إعادة بناء شريحة المكدس وضع وتعديل إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ينبغي بذل Z مداخن مع حجم الخطوة المشار إليها وإعادة بنائها في وضع إعادة بناء المكدس. دائما التحقق من صحة الصورة أعيد بناؤها من خلال مقارنة ذلك إلى البيانات الخام، أو يفضل، صورة واسعة المجال. المعلمات التي يمكن تعديلها لعملية إعادة الإعمار هي التباين وقمع الضوضاء عالية التردد. كل منهما يؤثر على كيفية اتخاذ مختلف خصائص الصورة الخام في الاعتبار أثناء عملية إعادة البناء. في حالة البيانات الخام عمق التشكيل منخفضة، المعلمة المقابل يلعب دورا هاما. إذا كان المستخدم لديه قواعد البيانات مع نسبة منخفضة إشارة إلى الضوضاء، ثم قمع المعلمة الضوضاء عالية التردد يمكن أن تؤثر على جودة إعادة الإعمار ذاتهverely.
    29. عند التصوير في النهائي، وسط مرحلة XY ونقل موضوعي على طول الطريق وصولا الى موقف يستريح فيها.
    30. إلغاء تحميل العينة وتنظيف كل من العينة والهدف مع الايثانول 95٪.
    31. اغلاق البرامج والكمبيوتر وإيقاف جميع الأجهزة الأخرى.
    32. إعادة الإعمار والعمود الفقري 3D تصنيف الصور المكتسبة يمكن القيام بها بعد تحويل الملفات إلى TIFF كما هو موضح قبل استخدام البرمجيات NeuronStudio (انظر الشكل 4) 16.
    33. استخدام المعلمات التالية لإعادة الإعمار في البرنامج NeuronStudios:
      1. حجم: أبعاد فوكسل: X: 0.03 ميكرومتر؛ Y: 0.03 ميكرومتر؛ Z: 0.120 ميكرون.
      2. كشف التغصنات: إرفاق نسبة: 1.3؛ الحد الأدنى لطول: 5 ميكرومتر؛ نسبة تفريد: 1؛ إعادة تنظيم التقاطعات: نعم.
      3. كشف العمود الفقري: ارتفاع الحد الأدنى: 0.2 ميكرومتر؛ أقصى ارتفاع: 5.001 ميكرون؛ أقصى عرض: 3 ميكرون؛ الحد الأدنى لحجم قصير: 10 voxels؛ الحد الأدنى لحجم غير قصير: 5 VOXإلس.
      4. العمود الفقري المصنف: نسبة الرقبة (نسبة رأس الرقبة): 1.1؛ نسبة رقيقة: 2.5؛ حجم الفطر: 0.35 ميكرومتر؛
    34. المعلمات NeuronStudio المستخدمة لتقديم: محوار شكل الرأس: كسوف الصلبة؛ لون محوار قنة: عن طريق نوع؛ محوار شكل الحافة: الخط؛ محوار حافة اللون: لون واحد؛ العمود الفقري الشكل: كسوف الصلبة؛ لون العمود الفقري: حسب النوع.
      ملاحظة: بعد إعادة الإعمار 3D هو الممكن أيضا لضبط حجم تقديم. تم تعيين عتبة الافتراضي إلى 20 مع خيار "إعادة إنشاء وحدة التخزين تقديم" النشط. تم تعيين التعتيم من قبل 'كثافة التلقائي' محددا. 'السطحية فقط "وكانت الخيارات' استخدام نقطة قبل التقديم 'نشطة أيضا

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الموصوفة هنا هو بروتوكول عمل موحدة لتصوير العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية الفئران في المختبر باستخدام SIM. يتم عرض سير العمل البروتوكول وخطواته حاسمة في الشكل 1. وعموما، فإن بروتوكول يستغرق حوالي 2 أسابيع من العمل التجريبي فصل في المرحلة الأولى من إعداد العينات، بما في ذلك الثقافة والتنمية وترنسفكأيشن من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية الفئران والمناعية، والمرحلة الثانية التصوير باستخدام عينة SIM. يتم إصلاح الخلايا العصبية قرن آمون الأولية الفئران بعد حوالي 2 أسابيع بداية من الثقافة، وعندما وضعت الخلايا العصبية العرش شجيري المعقدة التي تحمل العديد من العمود الفقري شجيري 3،5. باستخدام بروتوكول صفها بالتفصيل في الأقسام 1-8، فمن الممكن أن منهجية صورة العمود الفقري شجيري لقرار عظمى. بالمقارنة مع شجيري العمود الفقري طريقة التصوير التقليدية باستخدام متحد البؤر المجهري مضان الموضح قبل 16،17، وبروتوكول الموصوفة هنا باستخدام SIM يوفر أفضل بكثير دقة وضوح الصورة وإعادة الإعمار 3D، مما يسمح بتحديد وتصنيف الخلايا العصبية نتوءات غشاء تتراوح بين filipodia في وقت مبكر لهياكل مثل العمود الفقري.

الشكل 1
الشكل 1. يبين مخطط سير عمل البروتوكول، خطواتها والتوقيت.

الرقم 2
الشكل 2. الميكروسكوب الممثل من التشعبات والعمود الفقري شجيري المصورة مع متحد البؤر (A) وSIM المجهري (B). تم الحصول على صورة مجهرية SIM ممثل كما هو موضح في الباب 8، وحصلت على صورة مجهرية متحد البؤر ممثل شالغناء المادية حجم الثقب: 30 ميكرون قوة الليزر 2.6 ميغاواط، أي في المتوسط. تم بناؤها الاستحواذ من الصور ومتحد البؤر SIM (C و على التوالي) باستخدام برنامج NeuronStudio كما هو موضح قبل 16. وتتبع التشعبات والعمود الفقري صنفت تلقائيا مع البرنامج بعد تعديل المعالم الرئيسية مثل طول الرقبة، وقطر الرقبة وقطر الرأس. تظهر المناطق محاصر واحد العمود الفقري شجيري الفردية المصورة مع متحد البؤر (A) وسيم (B) وأعيد بناؤها من هذه المقابلة المداخن Z (C و D)، والتي تصور الاختلافات في القرار ودقة اعادة البناء 3D الناتجة عن ذلك. وفقا لقرار أعلى SIM، والتحليل الكمي من كل من رئيس (E) والعنق (F) قطر يكشف أن التدابير SIM أبعاد أصغر بكثير من المجهري متحد البؤر لنفس العمود الفقري شجيري، مشيرا إلى أن SIM قادر على اكتشاف التغيرات الصغيرة في شجيري التشكل العمود الفقري. D آتا في E و F هي تطبيع للمقاييس المرجعية متحد البؤر. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SD من 3 العمود الفقري شجيري المستخرجة من 5 قطاعات شجيري تصويرها في كل متحد البؤر المجهر وسائط SIM. لقطر الرقبة كانت هناك فروق معنوية (P = 0.0049 **) بين متحد البؤر (100.0 ± 4.296 وحدة تطبيع) وسيم (50.61 ± 7.642 وحدة تطبيع) الصور، كما تم اختبارها مع الطلاب اختبار t (E). لقطر الرأس كان هناك فرق كبير (* ع = 0.0209) بين متحد البؤر (100.0 ± 6.255 وحدة تطبيع) وسيم (58.12 ± 9.451 وحدة تطبيع) الصور، كما تم اختبارها مع الطلاب اختبار t.

الرقم 3
الرقم 3. لقطة من عناصر النزاهة الوطنية SIM 6.14 حزمة برامج نيكون مع الإعدادات الموضحة في هذا البروتوكول.

ve_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 4
الرقم 4. لقطة من إعادة الإعمار 3D NeuronStudio والبرامج تصنيف العمود الفقري لصورة ممثل التغصنات.

الجدول 1
الجدول 1. قائمة الكواشف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة يوصف بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الابتدائي تربيتها في المختبر باستخدام SIM. في قرن آمون طريقة ثقافة العصبية الأولية هو التكيف للطريقة الأصلية التي وصفها Kaech وبانكر 18. الاختلافات الرئيسية هي استخدام Neurobasal/B27 مستنبت، والذي يلغي شرط الثقافات المغذية astroglial، وبالإضافة إلى ذلك من FUDR الإنقسامية المانع في يوم 3 الذي يعزز بقاء الخلايا العصبية في حين قمع انتشار الدبقية، كما وصفها بريور وآخرون 19.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. سمك لل coverslips تستخدم لوحة الخلايا أمر بالغ الأهمية لتجربة SIM دقيقة. العقم أثناء إعداد ساترة والطلاء هو المهم. لا تدع coverslips تعامل بولي-L-يسين الجافة خلال 2.3 و 2.4. قطر ماصة مصقول اللهب المستخدمة في الخطوة 5.8 أمر بالغ الأهمية.سوف ضيقة جدا تلميح يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية في مراحل لاحقة. سوف عزل الحصين في أسرع وقت ممكن ضمان بقاء الخلية عالية. توقيت الحضانة وتركيزات التربسين حاسمة لضمان بقاء الخلية عالية. فقدان النشاط الأنزيمي التربسين قد تؤثر أيضا على بقاء الخلية. أخيرا، إضافة FUDR في الخطوة 5.14 أمر حاسم لتعزيز بقاء الخلايا العصبية وتمنع انتشار الدبقية.

مرحلة التصوير عينة واضحة عندما يقوم التالية بدقة وصف بروتوكول هنا والنتائج في اقتناء الصور ذات الدقة الفائقة التي يمكن بناؤها بسهولة في 3D لتحليل وتصنيف العمود الفقري شجيري وفقا لخصائصها المورفولوجية. كما هو مبين في الشكل 2، ونوعية الصور المكتسبة في وضع SIM هو أفضل بكثير من الصور بالضبط نفس شرائح شجيري العمود الفقري والفردية المكتسبة باستخدام وضع متحد البؤر من نفس المجهر. هذه النتيجة تشير إلى ثار استخدام SIM يمكن أن توفر فرصة ممتازة لأكثر من صورة والتغييرات الطفيفة في العمود الفقري شجيري التشكل، وكميا في أرقام و2E 2F.

حتى الآن، معظمها تم استخدام (الفلورسنت) المجهر واسعة المجال لصورة الخلايا الحية، وذلك بسبب الضيائية منخفضة. وبالمثل، نظرا لانخفاض التأثيرات الضوئية وتوليفة جيدة مع التقليدية (الوراثية) fluophores، SIM يسمح الخلايا الحية التصوير وتحديد العمود الفقري شجيري في البلدان المنخفضة fluophore معربا عن الخلايا فائقة في القرار. في مقارنة لأساليب المجهر فائقة القرار الأخرى مثل STED أو النخيل، وسيم يوفر طريقة سريعة وبأسعار معقولة لتصوير العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية الفئران في المختبر. رغم أنه في الممارسة SIM فقط يزيد القرار من قبل اثنين أضعاف مقارنة متحد البؤر المجهري التقليدية.

ومن الأمثلة على وجود قيود على SIM هو أنه يعتمد على مضان، والتي فييمكن لبعض الاجهزة التجريبية يكون من الصعب تطبيقها. تحقيقا لهذه الغاية، قد تقنيات الفحص المجهري التي لا تعتمد على مضان مثل المجهر الإلكتروني توفير حل ممكن. ومع ذلك، المجهر الإلكتروني على وجه الخصوص هو، ومكلفة وسيلة بطيئة مملة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن إلا أن المجهر الإلكتروني أجريت على عينات ثابتة. وبالتالي، SIM هو أكثر ملاءمة للفائقة القرار التصوير من الخلايا الحية. الأساس المنطقي لتطبيق الفلورسنت البروتين ترميز البلازميد ترنسفكأيشن هو أنه يؤدي إلى وضع العلامات حشوية نادرة، واستنساخه من خلايا معزولة، ومنع التداخل من التشعبات من الخلايا المختلفة وتحديد العمود الفقري شجيري الفردية. وقد تبين مزيج من ترنسفكأيشن مع المناعية سابقا لتعزيز مضان 17. ومع ذلك، يمكن أيضا أن يكون التقنيات الفلورسنت الأخرى التي تنطبق على التصوير من العمود الفقري شجيري مع SIM، على سبيل المثال يمكن الحصول عليها باستخدام تلطيخ فلوري دي كافية مؤخراتحقيقات بينه أكتين الملزمة 20.

منذ سمحت التطورات التقنية الأخيرة تطبيق SIM إلى التصوير الخلية الحيوية، مما يدل على أن فائق السرعة المجهر هيكلة الإضاءة قادر على القرار 100 نانومتر في إطار معدلات تصل إلى 11 هرتز 13، وتطبيقها في المستقبل منطقي جدا من بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن يكون تطبيقه على مرور الزمن SIM من الفئران الحية الخلايا العصبية قرن آمون الابتدائية وتحليل التغيرات الدينامية السريعة في التشكل شجيري العمود الفقري. والتحدي المقبل لهذا التطبيق يمكن أن يكون الضيائية التراكمي المتوقع المرتبطة فترات زمنية طويلة من الفحص المجهري المباشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل عدد H64.09.016 منحة VIDI من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO) لCPF. CPF ممتن للدكتور سلفينا A. Fratantoni لها تعليقات وتصحيحات الحرجة على المخطوطة النهائية. معتمدة GMRDL / EMMM من مؤسسة تقنية STW الهولندية (12151 المشروع و11350)، والذي هو جزء من NWO، والذي يتم تمويله جزئيا من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية. نشكر كاثرين كيتس وبيتر Drent من نيكون الآلات أوروبا BV للحصول على المساعدة والدعم. HX كان مدعوما من الأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (منحة 11CDP10) وWT كان مدعوما من منحة المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية (منحة 820.02.006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
  2. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
  3. Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
  6. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
  7. Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
  8. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 185-196 (1999).
  9. Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
  10. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
  12. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
  13. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
  14. James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
  15. Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
  16. Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. (2012).
  17. van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. (2009).
  18. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  20. Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics