הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים מרחביים, המאפשרת ההדמיה של קוצים הדנדריטים בודדים עם פירוט משופר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קוצים הדנדריטים הם בליטות המתעוררות מדנדריט של נוירון ולייצג את מטרות postsynaptic העיקריות של תשומות מעוררות במוח. התקדמות טכנולוגית זיהו את המבנים האלה כמרכיבים מרכזיים בקישוריות נוירון ופלסטיות הסינפטית. ניתוח כמותי של מורפולוגיה עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אור נותר בעיה מהותית בשל מגבלות טכניות הקשורות לגבול השבירה הפנימי של האור. קוצים הדנדריטים יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייזר הסריקה confocal. עם זאת, מדידת שינויים עדינים בצורה ובגודל של עמוד השדרה קשה בגלל ממדי עמוד השדרה אחרים מאשר אורך הם בדרך כלל קטנים יותר מרזולוציה אופטית קונבנציונלית שנקבעה על ידי גבול הרזולוציה התיאורטי של מיקרוסקופ אור של 200 ננומטר.

טכניקות ברזולוציה כמה שפותחו לאחרונה סופר כבר בעבר מבנים הסלולר תמונה קטנים יותר מננומטר 200, כולל קוצים הדנדריטים. Tטכניקות hese מתבססות על פעילות שדה הרחוק קלאסית ולכן מאפשרות השימוש בשיטות הכנת מדגם קיימות ולתמונה מעבר לפני השטח של דגימה. שתואר כאן הוא פרוטוקול עבודה ליישם מיקרוסקופיה ברזולוציה מובנה סופר תאורה (SIM) להדמיה של קוצים הדנדריטים בתרבויות נוירון היפוקמפוס עיקריות. יישומים אפשריים של ה-SIM חפיפה עם אלו של מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, שתי הטכניקות להציג תחולה שונה. SIM מציע רזולוציה רוחב אפקטיבית גבוה יותר, ואילו מיקרוסקופיה confocal, בשל השימוש בחריר פיזי, משיגה שיפור רזולוציה על חשבון הסרת מחוץ לפוקוס אור. בפרוטוקול זה, הנוירונים עיקריים הם תרבותיים על coverslips זכוכית באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, transfected עם פלסמידים-DNA המקודדים חלבוני ניאון וצלמו באמצעות ה-SIM. כל הפרוטוקול המתואר במסמך זה לוקח כ 2 שבועות, בגלל קוצים הדנדריטים הם צילמו אחרי 16-17 ימים במבחנה, כאשרהתפתחות דנדריטים היא אופטימלית. לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן לשחזר קוצים הדנדריטים ב3D מסדרה של ערימות תמונת ה-SIM באמצעות תוכנה מיוחדת.

Introduction

עמוד השדרה הדנדריטים היא בליטה קטנה של קרום תא העצב. מבנה אופייני זו מתמחה לקבל בדרך כלל קלט מסינפסה אחת ומייצג את שטח המגע הפיזי בין שני תאי עצב. רוב הקוצים הדנדריטים תפקודי בוגרים מורכבים מקצה כדורי, ראש כינה, וצוואר דק שמחבר את הראש לפיר הדנדריטים. עם זאת, עמוד השדרה אינה סטטיים ופעיל להעביר ולשנות את המורפולוגיה שלהם ברציפות גם במוח הבוגר 2. בתוך פרק 2 בשבוע של זמן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס עכברוש העיקרי נובעות מזמן שלאחר לידה עוברי או בתחילת סוף לפתח סוכות הדנדריטים מורכבות עם בליטות קרום רבות שתתפתחנה מfilipodia המוקדם למבנים דמויי עמוד השדרה-3. בהתבסס על התנהגות דינמית זו ומאפיינים אחרים, קוצים הדנדריטים הם חשבו לספק מצע אנטומיים לאחסון זיכרון ו4,5 שידור סינפטי.

בהינתן הדואר תפקיד קריטי שגודל עמוד השדרה הדנדריטים וצורה שבתפקוד הסינפטי, חשוב למדוד את הממדים שלהם בצורה מדויקת. עמוד השדרה משתנה מסביב 200 ל -2,000 ננומטר באורך וניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייזר הסריקה confocal. עם זאת, ממדי עמוד השדרה אחרים מאשר אורך הם בדרך כלל מתחת לרזולוציה של המערכות אופטיות הקונבנציונלית, הקבוע באופן תיאורטי על ידי עקיפה סביב 200 ננומטרים 6. כוחות פתרון אלה אינם מספיקים להדמית פרטים מעודנים יותר, כגון הרוחב של צוואר עמוד השדרה וראשים. עבודה רבה הוקדשה לפתור את הבעיה הזו ושיטות מיקרוסקופיה רבות חדשות יחסית ברזולוציה הסופר סיפקו התקדמות משמעותית. בפרט, זה אפשרי כדי להשיג רזולוציה מעבר לגבול הקלאסי, בלי לזנוח את כל אור פליטה באמצעות מיקרוסקופיה תאורה מובנה רוחבי (SIM) בשדה רחב, מיקרוסקופ שאינו confocal 7-10. שימוש בטכניקה זו בשילוב עם אי - Lineaשיטות מיקרוסקופיה r, זה אפשרי תיאורטית לשפר את הרזולוציה לרוחב של מיקרוסקופ האופטי על ידי גורם בלתי מוגבל 11. עם זאת, ברוב מקרי ניסיוני, ה-SIM מאפשר לעלות את מגבלת הרזולוציה בפקטור של שתי 1. טכניקות מיקרוסקופיה אופטית אחרות רזולוציה סופר כגון מיקרוסקופיה דלדול פליטה מאולצת (STED) 12 ומיקרוסקופיה לוקליזציה צילום הפעלה (PALM) 12 הוחלו על הדמיה של קוצים הדנדריטים. שיטות המבוססת על לוקליזציה כגון PALM דורשות מספר גדול מאוד של תמונות גולמיות כדי להשיג רזולוציה סופר ולכן הם מוגבלים במהירות. מצד השני, STED יכולה להשיג מהירות גבוהה הדמיה, אם כי בספירת פוטון נמוכה יחסית ושדות קטנים של תצוגה, אשר לא יכול להיות במקרה של 13 ה-SIM.

במאמר זה המטרה היא לספק פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס עיקרי חולדה בתרבית במבחנה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי הניסוי כרוכים בבעלי חיים היו מותאמים כדי להפחית את הסבל של בעלי החיים ואושרו על ידי הוועדה לניסויים בבעלי החיים, אוניברסיטת אמסטרדם, DED204 דצמבר פרוטוקול # וDED250.

1. Coverslip הכנה

  1. צמצם את coverslips לגודל של 15 מ"מ x 15 מ"מ באמצעות קרביד או סופר יהלום, כך שהם מתאימים לבארות של צלחת 12 היטב.
  2. בעת שעבד במנדף, להתחיל ציפוי coverslip על ידי השריית coverslips באופן מלא בפתרון מרוכז חומצה חנקתית (70% wt / wt) במכל זכוכית. כדי להבטיח אפילו לנער הפצה, אז דגירה למינימום של 4 שעות. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסת החומצה חנקתית המרוכזת למשך כ 2 פעמים, אבל זה יכול לאבד את הצבע בחשיפה לאור.
  3. הסר את פתרון החומצה חנקתית המרוכז ולשטוף coverslips ארבע פעמים במים מזוקקים במשך 30 דקות, לוחץ בזהירות לאחר כל שטיפה.
  4. בזהירות להסיר אתמים.
    הערה: את שלושה השלבים הבאים מבוצעים בזרימה למינרית סטרילי.
  5. משרים את coverslips ב96% EtOH. הסר את coverslips מפתרון EtOH ולתת להם להתייבש.
  6. להבת coverslips ולשים אותם במכל זכוכית. שימוש במלקחיים בסדר להתמודד עם coverslips (המלקחיים No.5 סגנון דומון לדוגמא).
  7. כסה את המכל בנייר אלומיניום ואופה בתנור בחום יבש ל12-16 שעות ב180 ° C. ניתן לאחסן coverslips אפוי בטמפרטורת חדר לתקופה של עד 1 חודש, אם מכוסה היטב.

2. Coverslip ציפוי

הליך ציפוי coverslip מעדיף מצורף נוירון למשטח הזכוכית וarborization הדנדריטים 14.

  1. בברדס למינרית סטרילי, להשתמש במלקחיים קטנים סטרילית למקום coverslips הבודד בבארות בודדות של צלחת 12 היטב.
  2. הוסף 500 μl של פולי-L-ליזין פתרון (או סכומים מספיקים כדי להטביע את coverslips).
  3. לעטוף tהוא הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת חדר.
  4. לפני שמתחיל התרבות, לשאוב-L-ליזין פולי הפתרון בזהירות בברדס למינרית סטרילי.
  5. לשטוף היטב כל אחד עם 1 מיליליטר של מים סטריליים פעמיים, תוך מניעתם להתייבש.
  6. לשאוב מים לחלוטין, להוסיף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני ולהשאיר את coverslips בתרבית רקמת החממה עד מוכן לצלחת התאים. מומלץ צלחת התאים בתוך 24 שעות.

3. ההסרה של המוח מE16-E19 עכברוש עוברים

  1. לעקר את מכשירי ניתוח על ידי חימומם במעקר יבש בן לילה או לשטוף אותם עם EtOH 70%. להתייבש היטב אם EtOH משמש.
  2. להכין כמה מנות 30 מ"מ עם חיץ 1x HBSS ולשמור אותם על קרח.
  3. להרדים את סכר העכברוש עם זריקת intraperitoneal של Euthasol (160 מ"ג / קילוגרם Euthasol בהיקף של ± 0.4 מיליליטר).
  4. בדוק על היעדריו של הרפלקסים.
  5. ספריי בטן של הסכר עם EtOH 70%.
  6. עושה חתך לאורך הבטן ולהוציא את הרחם.
  7. הסר את העוברים מהרחם ומניח אותם בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ.
  8. הסר את ראשי העוברים במספריים גדולים ומניח את הראשים בצלחת פטרי חדשה המכילה חיץ 1x HBSS קר.
    הערה: מכאן ועד לשלב 7.1 ההליך מבוצע בתנאים סטריליים בזרימה למינרית.
  9. החזק את הראש בצדדים עם מלקחיים גדולים.
  10. במספריים קטנים, לעשות חתך sagittal בעור בחלק העליון של הראש, ולאחר מכן רוחבי לקלף את העור עם מלקחיים גדולים.
  11. השתמש באותה הגישה כמו בשלב 3.10 להסיר את הגולגולת. לעשות חתך sagittal החל בסוף הזנב; בעדינות פותח את הגולגולת מבלי לפגוע ברקמת המוח. מקפלים את שני החצאים של הגולגולת במרחק רוחבי החושפים את המוח.
  12. עם המרית הבוטה, לגרוף את המוח ולמקם אותו ב1x HBSS הקר הטרי.
  13. 4. Dissection של hippocampi

    זה מאוד חשוב, כי הנתיחה נעשה במהירות אפשרית בתנאים סטריליים כדי להבטיח את יכולת הקיום של תאים. שמור את הדגימות קרות על קרח.

    1. להסיר ולסלק המוח הקטן עם המספריים העדינים.
    2. להפריד בין שתי ההמיספרות של המוח על ידי ביצוע חתך sagittal לאורך קו האמצע.
    3. קח את כל חצי הכדור ומניח את שניהם בצלחת 30 מ"מ חדשה המכילה 1x HBSS הקר טרי.
    4. מניחים כל חצי הכדור כזה שהאונה הטמפורלית פרצופים התחתון של המנה.
      הערה: מכאן והלאה, מומלץ להשתמש במיקרוסקופ לנתח.
    5. צמד בעדינות את המוח התיכון באמצעות מלקחיים קטנים ולהסיר את המוח התיכון עם זוג נוסף של מלקחיים. השאר את שארית האונה שלמה המכיל את הקליפה וההיפוקמפוס.
    6. הפוך את הרקמה, כך שההיפוקמפוס הוא כעת מול תחתון של המנה.
    7. צמד בעדינות את חצי הכדור בעמ 'תחרה עם מלקחיים בסדר. באמצעות מלקחיים בסדר אחר, בזהירות ובעדינות להסיר את קרומי המוח. זה קל יותר להתחיל בנורת חוש הריח. השתמש בזהירות כדי שלא לפגוע בהיפוקמפוס.
    8. לכוון את הרקמה כך שההיפוקמפוס הוא כעת פונה כלפי מעלה. ההיפוקמפוס עכשיו ניתן לראות מבנה C בצורה האופייני שלו.
    9. באמצעות מלקחיים בסדר, לנתח את ההיפוקמפוס. לאסוף אותו בצלחת 30 מ"מ חדשה המכילה 1x HBSS הקר טרי.

    5. תא דיסוציאציה וציפוי

    1. לספור את המספר הכולל של היפוקמפוס, ולאחר מכן לחתוך אותם לחתיכות קטנות.
    2. לאסוף את החלקים בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר 1x HBSS.
    3. צנטריפוגה XG 300 5 דקות ולהסיר את supernatant בזהירות.
    4. הוסף 6 μl טריפסין להיפוקמפוס.
    5. דגירה עבור 20 דקות מקסימום ב 37 ° C. מערבולת אחרי 3 דקות.
    6. שטוף פעמיים עם 5 מיליליטר של 1x HBSS הקר הטרי וזורקים supernatant.
    7. אחרי הערוץ nd לשטוף, להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום ציפוי, מראש חימם עד 37 ° C. הסרום במדיום ציפוי יהיה להשבית את פעילות טריפסין.
    8. לאט triturate 30x עם פיפטה פסטר אש המלוטשת עד שכל החתיכות של רקמה מפוזרות homogenously לתוך תאים בודדים. הימנע מכל מבעבע.
    9. הוסף 5 מיליליטר של ציפוי מדיום מראש חימם עד 37 ° C.
    10. ספירת תאים באמצעות צביעה חיונית כחולה Trypan.
    11. זרעי 50,000 תאים לכל גם צלחת 12 גם ב1 מיליליטר ציפוי בינוני, שהוכנו בסעיף 2 (נפח כולל 2 מיליליטר).
    12. נער בעדינות את הצלחת כדי לפזר באופן שווה את התאים.
    13. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אחרי 2-3 ימים, להחליף מחצית בינוני ציפוי (0.5 מיליליטר) עם מדיום תרבות המכיל 10 מיקרומטר FUDR.
      שים לב: הדמיה עמוד השדרה הדנדריטים מבוצעת 16-17 ימים לאחר ציפוי (16-17 ימים במבחנה, DIV).

    6. עכברוש היפוקמפוס הראשי Neuron Transfection באמצעות Lipofectamine

    > על DIV 14-15 נוירונים הם transfected באמצעות הפרוטוקול הבא:

    1. הכן את ה-DNA פלסמיד להביע GFP ובינוני דגירה (10 מיליליטר של מדיום Neurobasal עם של Glutamax 100 μl).
    2. טרום חם מדיום הדגירה ל37 ° C.
    3. הכן תערובת ה-DNA (Tube). לכל coverslip להוסיף 1 מיקרוגרם של ה-DNA בבינוני Neurobasal רגיל 100 μl. לערבב בעדינות.
    4. הכן תערובת Lipofectamine (Tube ב '). לכל coverslip להוסיף 2 μl Lipofectamine בבינוני Neurobasal רגיל 100 μl. לערבב בעדינות.
    5. מוסיף את תערובת Lipofectamine לdropwise תערובת ה-DNA.
    6. דגירה בזרימה למינרית במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    7. הוסף 1 מיליליטר של מדיום דגירה מחומם מראש לצלחת 1.
    8. חנות צלחת 2 למשך 5 דקות בשעה 37 ° C CO, 2 5%.
    9. בעדינות להוסיף dropwise 200 μl של ה-DNA / Lipofectamine לערבב היטב כל אחד והדגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    10. עם השימוש במלקחיים קטנים להרים את coversliנ.ב. המכיל את תאי העצב ולשטוף אותם על ידי טבילתם בצלחת 3 סנטימטר המכילה בינוני Neurobasal חם טרי ולהעביר אותם לצלחת 2.
    11. דגירה נוירונים transfected על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
    12. הגעה ליעילות transfection 24 שעות לאחר transfection.

    7. Immunostaining וההרכבה של עכברוש נוירונים העיקרי בהיפוקמפוס

    כדי לשפר את עוצמת הקרינה בתאי transfected, לבצע פרוטוקול immunostaining כדי לשפר את גילוי ה-GFP 48 שעות לאחר transfection.

    1. הכן PFA 4% ו0.05 TBS M.
    2. לחמם את 4% PFA הפתרון ל37 ° C.
    3. בעדינות לשאוב את המדיום מהבארות המכילות coverslips.
    4. הוסף 500 μl של 4% PFA החמים בזהירות כדי למנוע פגיעה בדנדריטים.
    5. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
    6. לשטוף עם 1x HBSS 3 פעמים במשך 5 דקות.
      הערה: בשלב זה יכול להיות מאוחסן עד דגימות עד 3 שבועות על 4 מעלות צלזיוסאו ניתן להתחיל immunostaining באופן מיידי.
    7. אם דגימות אוחסנו, לשטוף עם 0.05 M כפות 3 פעמים במשך 5 דקות.
    8. לחסום עם פתרון TBS-BSA (1%) בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות.
    9. לשטוף עם 0.05 M כפות 3 פעמים במשך 5 דקות.
    10. מוסיף את הנוגדן הראשוני מדולל בתמהיל דגירה.
    11. דגירה הצלחות במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
    12. יתר על כן, דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רעד עדין.
    13. הסר את הנוגדן הראשוני.
    14. לשטוף עם 0.05 M TBS 3x במשך 5 דקות.
      הערה: מנקודה זו ואילך, לשמור על coverslips המוגן מפני אור.
    15. מוסיף את נוגדני ניאון מצומדות המשניים בדילול מלא בתערובת דגירה.
    16. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
    17. הסר את הנוגדנים משני.
    18. לשטוף עם 0.05 M כפות 3 פעמים במשך 5 דקות.
    19. לשטוף עם 1X TB 2 פעמים במשך 5 דקות.
    20. השתמש בפינצטה בסדר להסיר לcoverslips מהבארות.
    21. ייבש כל עודף של שחפת עם רקמה והר coverslips באמצעות הרכבה בינונית.
    22. לאטום עם לק על מנת למנוע אידוי של הרכבה בינונית.

    8. דנדריטים השדרה ההדמיה באמצעות מבנה תאורה מיקרוסקופית

    יש הדמיה עמוד השדרה הדנדריטים באמצעות מערכת ה-SIM שמתוארת בחומרים ברזולוציה רוחב ערך (XY) של כ 85-110 ננומטר וערך צירי רזולוציה (Z) בין 200-250 ננומטר, מתן פקטור של פי 2 שיפור ברזולוציה לעומת מיקרוסקופ רחב בתחום.

    הערה: הדמיה עמוד השדרה הדנדריטים באמצעות ה-SIM נעשה בדרך כלל על 2 ימים לאחר צעד 7.22, אבל ניתן לעשות זאת עד 3 שבועות מאוחר יותר, אם דגימות נשמרות בחושך ותחת טמפרטורה מבוקרת של 22-23 ° C.

    1. הפעל את לייזר 488 ננומטר, המנורה כספית, בקר הבמה, בקר piezo, מנורת ההלוגן לאור מועבר והמחשב ולהפעיל את תוכנת ה-SIM במצב "תידור עבור N-SIM".
    2. נקה את אובייקט TIRF 100xive עם 95% אתנול שלוש פעמים, ובמידת צורך עם אתר נפט.
    3. השתמש בהגדרות המסנן הבאות: 520 LP עם dichroic 488.
    4. לשים טיפה של שמן טבילה על המטרה. בדוק שאין בועות אוויר ב- טיפת השמן. הזז את המטרה כלפי מעלה עד שהשמן נוגע במדגם.
      הערה: מקום כיסוי על הבמה כדי להגן על המדגם מאור הסביבה ולעמעם את האורות בחדר ככל האפשר.
    5. הגדר את צווארון התיקון האובייקטיבי ל37 מעלות צלזיוס, 200 מיקרומטר, כדי להשיג הסימטריה הטובה ביותר של כוחות הביטחון הפלסטיניים. על מנת לקבוע את מיקום הצווארון הנכון, המיקום ראשון הטבעת האובייקטיבית בעמדה הנומינלית האופטימלית ולאחר מכן לבדוק מדגם חרוז 100 ננומטר. על פי הסימטריה של כוחות הביטחון הפלסטיניים הטובים ביותר, מעט לשנות את מיקום הקולר סביב נומינלי אחד.
    6. לתאורה, השתמש צורם 3D-SIM (3D 1layer 100X/1.49 כל אורכי הגל). כדי להתחיל את מקום היישור הצורם הבלוק הצורם שנבחר לנורת ה-SIM, עם 100x 1.49 אובייקטיבי במקום. השתמש במדגם חרוז 100 ננומטר רכוב בתקשורת, עם ריכוז שיכול לאפשר בידוד 10-15 חרוזים לשדה הראייה (FOV). לאחר הגדרת צווארון התיקון האובייקטיבי למצב הרצוי, בחר את תאורת 3D-SIM ולהתחיל את הליך יישור מודרך תוכנה. זה יפעל (5 שלבים) x x (כיוון 1) (100 Z-מטוסים) תמונות, שממנו יהיה לשחזר את FOV עם חרוזים. לאחר בחירת חרוז יחיד באמצעות החזר השקעה מתאימה, המכסה את כל חרוז כולל האור המטושטש מחוץ לפוקוס, התוכנה תתחיל כוחות הביטחון הפלסטיניים אוטומטיים ראויה וזה יהיה להתאים את המיקום הצורם על פי התוצאה.
    7. כדי לבדוק את הביצועים של המיקרוסקופ, חזור על היישור הצורם כל 2 שבועות, בגלל חוסר התיאום האפשרי שנגרם על ידי תנועות שולחן ו / או נסחף טמפרטורה. יתר על כן, גם לבדוק את עוצמת הלייזר ויציבות על פי ההצעות של היצרן.
    8. נקה את פני השטח המדגם עם המכון הטכנולוגי של 95%anol שלוש פעמים.
      הערה: הצעדים הבאים ראו איור 3 לסקירה של לוחות הבקרה וההגדרות הנכונות בתוכנת ה-SIM.
    9. בתוכנת ה-SIM, בחר בתצורה אופטית העיניים FITC ובחר לחסום מסנן ריק ב1 צריח לבדיקה ויזואלית באור לבן.
    10. קבע את מהירות מיקוד ומהירות הנסיעה של שולחן XY ל" בסדר ".
    11. לפתוח את התריס ובמהירות להתמקד במדגם.
    12. סגור את התריס שוב ולהגדיר את Z-לתאם לאפס.
    13. בחר את המסנן הירוק ב1 צריח לבדיקה ויזואלית באמצעות הערוץ הירוק.
    14. הגדר את עוצמת מנורת הכספית להגדרה הנמוכה ביותר.
    15. מעבר לגבול של המדגם בזהירות, ולוודא כי המטרה לא לגעת באיטום.
    16. לפתוח את התריס ובמהירות סריקה באמצעות המדגם עם העצמה הנמוכה ביותר האפשרית.
    17. במפגשי דנדריט בהיר מספיק עניין ומרכוז קטע של ענייןבתחום התצוגה, סגור את התריס.
    18. הגדר את התוכנה לתצורה האופטי 3D-SIM 488 והגדרות המצלמה לקריאה החוצה EM מצב, לקבל MHz 1 16 סיביות, זמן חשיפת msec 100, כוח הלייזר 5% וEM להשיג 200.
      הערה: בדוק שהמסנן הירוק בצריח 2 נבחר וש1 הצריח הוא ריק.
    19. בדוק שהצורם מוגדר 'העברה' ולחץ בשידור חי כדי להציג את המדגם עם אור הלייזר ובאמצעות המצלמה.
    20. הפעל חפש הטבלה.
    21. מרכז את מושא העניין במידת צורך ולהתמקד במהירות תוך התמקדות מוגדרת פיין במיוחד.
      הערה: במצב הקריאה החוצה EM להשיג MHz 1 16 סיביות, עצמת היעד לתמונת ה-SIM טוב היא בין 30,000-45,000.
    22. במהירות להתאים את הגדרות המצלמה כדי לקבל ערך עוצמה בין 30,000-45,000 במצב הקריאה החוצה EM להשיג MHz 1 16 סיביות. בתחילה להשתמש:
      1. כוח לייזר: 0% - 20% (עם דגימות מוכנות כפי שתואר לעיל, 5% או 2.6 mW הוא מספיק)
      2. זמן חשיפה:50 שניות msec-2
      3. מצב קריאה מתוך: EM להשיג 1 MHz 16 סיביות
      4. EM להשיג: 0-300
      5. רווח המרה: 1x - 5.1x
      6. פורמט לשידור: לא binning
      7. פורמט ללכידה: לא binning
        הערה: עם הגדרות אלה 6.3% ± הלבנת 1.3% מושגת באופן שיגרתי, בתוך מגבלת 10% מהלבנה המרבית מקובלת, אשר באופן משמעותי עלולים להשפיע על איכות תמונת 15.
    23. לחץ על עצור כדי לכבות את התצוגה בזמן האמת.
    24. קבע את ההגדרות של מחסנית 3D Z בפנל רצף ND ל:
      1. טווח: 2 מיקרומטר
      2. הגדרת גודל: 120 ננומטר
      3. מטוס Z
      4. לחץ על מיקום הבית
      5. בחר אופטי התצורה 3D-SIM 488 בסעיף מבדה
    25. בחר 3D-SIM כמצב הרכישה בכרית N-SIM.
    26. הפעל את רכישת רצף ND ולשמור את הנתונים הגולמיים.
    27. בחר בתצורה אופטית העיניים FITC שוב וחזור על שלבים 8.15-8.27 עד המדגם כולו כבר צילם
    28. שחזור תמונת 3D: נתונים שנרכשו בשלב 8.23 ​​יכולים להיות משוחזרים באופן מיידי או בשלב מאוחר יותר. התחל על ידי בנייה מחדש של מחסנית Z עם הגדרות שחזור ברירת מחדל במצב בנייה מחדש פרוס או הבנייה מחדש סטאק ולהתאים במידת צורך.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ערימות Z צריכים להיעשות עם גודל צעד מצויינים ושחזרו במצב הבנייה מחדש סטאק. יש לבדוק תמיד את תוקפו של התמונה המשוחזרת על ידי השוואתו לנתונים הגולמיים או, עדיף, תמונה רחב בתחום. הפרמטרים שיכולים להיות מותאם לתהליך השיקום הם הניגוד ודיכוי רעש בתדר גבוה. שניהם להשפיע על איך מאפייני תמונת גלם שונים נלקחים בחשבון בתהליך השיקום. במקרה של נתונים גולמיים עומק אפנון נמוך, פרמטר הניגוד ממלא תפקיד חשוב. אם למשתמש יש מערכי נתונים עם יחס אות לרעש נמוך, ולאחר מכן את הפרמטר להפחתת רעשים בתדר הגבוה יכול להשפיע על איכות שיקום severely.
    29. כאשר הדמיה במרכז הבמה המוגמרת, XY ולהעביר את המטרה כל הדרך למטה למצב המנוחה שלה.
    30. ניתק את המדגם ולנקות גם את המדגם ואובייקטיבי עם 95% אתנול.
    31. כבה את התוכנה ואת המחשב ולכבות את כל מכשירים אחרים.
    32. סיווג שיקום ועמוד השדרה 3D של התמונות שנרכשו יכול להתבצע לאחר המרת הקבצים ל-TIFF כפי שתואר לפני השימוש בתוכנת NeuronStudio (ראה איור 4) 16.
    33. השתמש בפרמטרים לשיקום הבאים בתוכנת NeuronStudios:
      1. נפח: ממדי Voxel: X: 0.03 מיקרומטר; Y: 0.03 מיקרומטר; Z: 0.120 מיקרומטר.
      2. איתור דנדריט: צרף יחס: 1.3; אורך מינימאלי: 5 מיקרומטר; יחס discretization: 1; ליישר מחדש צמתים: כן.
      3. השדרה זיהוי: גובה מינימאלי: 0.2 מיקרומטר; גובה מרבי: 5.001 מיקרומטר; רוחב מרבי: 3 מיקרומטר; גודל מינימאלי קצר ועבה: 10 voxels; גודל שאינו קצר ועבה מינימאלי: 5 ווקסאלס.
      4. השדרה מסווג: יחס צוואר (יחס ראש הצוואר): 1.1; יחס דק: 2.5; גודל פטריות: 0.35 מיקרומטר;
    34. פרמטרים NeuronStudio משמשים לעיבוד: צורת קודקוד neurite: ליקוי מוצק; צבע קודקוד neurite: לפי סוג; צורת קצה neurite: קו; צבע neurite קצה: צבע אחד; השדרה צורה: ליקוי מוצק; צבע השדרה: לפי סוג.
      הערה: לאחר שחזור 3D גם אפשר להגדיר את עוצמת הקול לעבד. סף ברירת המחדל היה מוגדר 20 עם האפשרות 'להתחדש נפח טיוח' פעילה. אטימות הוקמה על ידי 'עוצמה אוטומטית' מסומנת. "Surface רק 'והאפשרויות' השתמש פוינט מראש טיוח 'היו פעילים גם

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שתואר כאן הוא פרוטוקול עבודה סטנדרטי להדמית קוצים הדנדריטים מתא העצב בהיפוקמפוס עכברוש עיקרי במבחנה באמצעות ה-SIM. זרימת העבודה הפרוטוקול והצעדים המכריעים שלה מוצגות באיור 1. בסך הכל, הפרוטוקול לוקח כ 2 שבועות של עבודה ניסויית מופרדים בשלב ראשון של הכנת מדגם, כוללים תרבות, פיתוח וtransfection של נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש עיקריים ואימונוהיסטוכימיה, ושלב שני של הדמיה מדגם באמצעות ה-SIM. נוירונים בהיפוקמפוס העכברוש עיקריים הם קבועים כ 2 שבועות לאחר תחילתה של התרבות, כאשר הנוירונים פיתחו סוכות הדנדריטים מורכבות נושאת קוצים הדנדריטים רבים 3,5. באמצעות הפרוטוקול המתואר בפירוט בסעיפים 1-8, זה אפשרי באופן שיטתי קוצים הדנדריטים תמונה עם רזולוציה סופר. בהשוואה לשיטת הדמיה עמוד השדרה הדנדריטים קונבנציונלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal המתוארת לפני 16,17, הפרוטוקול המתואר במסמך באמצעות ה-SIM מספק רזולוציית תמונה טובה יותר באופן משמעותי ושחזור 3D, המאפשר זיהוי והסיווג של בליטות קרום תא עצב החל filipodia המוקדם למבנים דמויי עמוד השדרה.

איור 1
איור 1. התכנית מציגה זרימת עבודה פרוטוקול, את צעדיה ועיתוי.

איור 2
איור 2. Micrographs נציג של דנדריטים וקוצים הדנדריטים צילמו עם confocal () ומיקרוסקופיה SIM (ב '). מיקרוסקופ ה-SIM הנציג נרכש כאמור בסעיף 8, מיקרוסקופ confocal הנציג נרכש uלשיר גודל חריר פיזי: 30 מיקרומטר כוח הלייזר 2.6 mW, לא מיצוע. רכישות שוחזרו מתמונות confocal ו-SIM (C ו-D, בהתאמה) באמצעות תוכנת NeuronStudio כפי שתואר קודם 16. דנדריטים אותרו וקוצים סווגו באופן אוטומטי עם התוכנה לאחר התאמת פרמטרים עיקריים כגון אורך צוואר, בקוטר צוואר וקוטר הראש. האזורים התאגרפו להראות עמוד השדרה אחד בודדת הדנדריטים צילמה עם confocal () ו-SIM (B) ושחזר מארובותיהם המתאימות Z (C ו-D), המתארות את ההבדלים ברזולוציה ודיוק של 3D שחזורי וכתוצאה מכך. על פי הרזולוציה גבוהה יותר של ה-SIM, ניתוח כמותי של שני ראש (ה ') ובצוואר (F) בקוטר מגלה כי צעדי SIM ממדים קטנים יותר באופן משמעותי מאשר מיקרוסקופיה confocal עבור אותו קוצים הדנדריטים, המציין כי ה-SIM הוא מסוגל לאתר שינויים קטנים יותר במורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים. D אתא בE ו-F הם מנורמלים למדידות confocal ההתייחסות. תוצאות מוצגות כממוצע ± SD של 3 קוצים הדנדריטים מופקים 5 מגזרים הדנדריטים צילמו בשני confocal ומצבי מיקרוסקופ ה-SIM. לקוטר צוואר היה הבדל משמעותי (** p = 0.0049) בין confocal (100.0 ± 4.296 יחידות מנורמלות) ו-SIM (50.61 ± 7.642 יחידות מנורמלות) תמונות, כפי שנבדק עם סטודנטים מבחן t (E). לקוטר ראש היה הבדל משמעותי (* p = .0209) בין confocal (100.0 ± 6.255 יחידות מנורמלות) ו-SIM (58.12 ± 9.451 יחידות מנורמלות) תמונות, כפי שנבדק עם סטודנטים מבחן t.

איור 3
איור 3. מסך משל ניקון ש"ח אלמנטי חבילת תוכנת 6.14 SIM עם ההגדרות מתוארות בפרוטוקול זה.

ve_content "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 4
איור 4. מסך משיקום NeuronStudio 3D ותוכנת סיווג עמוד השדרה של תמונה מייצגת של דנדריט.

טבלת 1
טבלת 1. רשימה של חומרים כימיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס עיקרי חולדה בתרבית במבחנה באמצעות ה-SIM הוא תאר. שיטת תרבות נוירון היפוקמפוס העיקרית היא עיבוד של השיטה המקורית שתוארה על ידי Kaech והבנקאי 18. ההבדלים העיקריים הם השימוש במדיום Neurobasal/B27 תרבות, אשר מבטל את הדרישה של תרבויות מזין astroglial, והתוספת של FUDR מעכב mitotic ביום 3 אשר מקדם הישרדות עצבית תוך דיכוי התפשטות גליה, כפי שתוארו על ידי ברואר ואח' 19.

יש הרבה שלבים קריטיים בפרוטוקול. העובי של coverslips משמש לצלחת התאים חיוני לניסוי ה-SIM מדויק. עקרות במהלך הכנת coverslip וציפוי היא חשובות. אל תתנו coverslips פולי-L-ליזין שטופלה להתייבש במהלך 2.3 ו2.4. הקוטר של פיפטה מלוטשת הלהבה משמשת בשלב 5.8 הוא קריטי.צר מדי טיפ יגרום לכדאיויות תא נמוכות בשלבים מאוחר יותר. בידוד של hippocampi מהר ככל האפשר יבטיח כדאיות תא גבוהות. העיתוי של הדגירה וריכוזי טריפסין הוא חיוני כדי להבטיח את יכולת הקיום של תאים גבוהות. הפסד של פעילות האנזימטית טריפסין עשוי להשפיע גם על כדאיות תא. לבסוף, התוספת של FUDR בשלב 5.14 היא חיונית כדי לקדם את הישרדות תא עצב ומעכבים את התפשטות גליה.

מדגם שלב ההדמיה הוא פשוט כאשר היא מבוצעת לאחר קפדנות הפרוטוקול מתואר כאן ותוצאות ברכישה של תמונות ברזולוציה סופר כי ניתן לשחזר בקלות ב-3D כדי לנתח ולסווג קוצים הדנדריטים על פי תכונות המורפולוגיות שלהם. כפי שניתן לראות בתרשים 2, איכות התמונות שנרכשו במצב SIM היא באופן משמעותי טובה יותר מאשר תמונות של בדיוק אותם הקטעים הדנדריטים וקוצים בודדים שנרכשו באמצעות מצב confocal של אותו מיקרוסקופ. תוצאה זו מרמזת thaלא את השימוש של ה-SIM יכול לספק הזדמנות מצוינת ליותר מתמונת שינויים עדינים במורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים, כלכמת ב2E דמויות ו2F.

עד כה, רובם מיקרוסקופית (ניאון) שדה רחב כבר בשימוש לתאי חי תמונה, בשל phototoxicity הנמוך שלה. בדומה לכך, בשל השפעותיו נמוכות phototoxic ושילוב טוב עם fluophores הקונבנציונלי (גנטי), ה-SIM מאפשרת הדמיה תאי חיים והזדהות של קוצים הדנדריטים בfluophore הנמוך לבטא בתאים ברזולוצית סופר. בהשוואה לשיטות מיקרוסקופיה אחרות רזולוציה סופר כגון STED או PALM, SIM מספק שיטה מהירה ונוחה להדמיה של קוצים הדנדריטים מתאי העצב בהיפוקמפוס עכברוש עיקריים במבחנה. למרות שבפועל ה-SIM רק מגבירה את הרזולוציה על ידי שני לקפל בהשוואה למיקרוסקופיה confocal הקונבנציונלית.

דוגמא אחת להגבלה של ה-SIM היא שהיא מסתמכת על הקרינה, אשר בכמה setups ניסיוני יכול להיות קשה ליישום. לשם כך, שיטות מיקרוסקופיה, שאינו מסתמכות על הקרינה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית עשויות לספק פתרון אפשרי. עם זאת, במיקרוסקופ אלקטרונים בפרט הוא שיטה מייגע, יקרה איטית. יתר על כן, במיקרוסקופ אלקטרונים יכול להתבצע רק על דגימות קבועות. לכן, ה-SIM הוא מתאים יותר להדמיה ברזולוציה סופר של תאי חיים. הרציונל להחלת transfection פלסמיד ניאון חלבון קידוד הוא שזה גורם לתיוג cytoplasmic נדיר, אך במקביל לשחזור של תאים מבודדים, מניעת חפיפה של דנדריטים מהתאים שונים וזיהוי של קוצים הדנדריטים בודדים. שילוב של transfection עם immunostaining הוכח בעבר כדי לשפר את הקרינה 17. עם זאת, טכניקות ניאון אחרות יכולים גם להיות רלוונטיות להדמיה של קוצים הדנדריטים עם SIM, למשל מכתים ניאון מספיק יכול להיות שנרכש באמצעות דה לאחרונהבדיקות מחייבות אקטין veloped 20.

מאז התפתחויות טכניות האחרונות אפשרו את היישום של ה-SIM להדמית תא דינמי, הוכחת כי מיקרוסקופ מובנה תאורה במהירות גבוהה הוא מסוגל רזולוציה 100 ננומטר במסגרת שיעורים עד 11 הרץ 13, יישום עתידי מאוד הגיוני של הפרוטוקול המתואר במסמך זה יכול להיות היישום שלה ל-SIM זמן לשגות של נוירונים בהיפוקמפוס חיים עכברוש ראשוני והניתוח של שינויים דינמיים מהירים במורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים. אתגר הבא עבור יישום זה יכול להיות phototoxicity המצטבר הצפוי הקשורים למרווחים של מיקרוסקופיה לחיות זמן רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי H64.09.016 מספר מענק vidi מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) לCPF. ע.מ. מודה לד"ר סילבינה א Fratantoni להערות הביקורתיים שלה ותיקונים בכתב היד הסופית. GMRDL / EMMM נתמך על ידי ההולנדים הטכנולוגיה הקרן STW (12151 פרויקט ו11350), שהוא חלק מההסתדרות הלאומית, ואשר ממומן בחלקו על ידי המשרד לענייני כלכלה. אנו מודים קיטס קתרין ופיטר Drent של ניקון מכשירי Europe BV לקבלת סיוע ותמיכה. HX נתמכה על ידי האקדמיה ההולנדית המלכותית לאמנויות ולמדעים (מענק 11CDP10) וWT נתמכה על ידי מענק בארגון ההולנדי למחקר מדעי (מענק 820.02.006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
  2. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
  3. Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
  6. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
  7. Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
  8. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 185-196 (1999).
  9. Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
  10. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
  12. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
  13. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
  14. James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
  15. Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
  16. Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. (2012).
  17. van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. (2009).
  18. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  20. Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics