成像大鼠原代海马神经元树突棘使用结构照明显微镜

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Neuroscience

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Summary

本文介绍了使用结构照明显微镜(SIM卡) 在体外海马神经元的工作协议,以形象的树突棘。使用SIM卡超高分辨率显微镜提供的图像分辨率显著超越在所有三个空间维度的光的衍射极限,允许单个树突棘与改进的细节的影像。

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Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

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Abstract

树突棘是新兴突起从一个神经元的树突和代表在脑兴奋性输入端的初级突触后指标。技术进步已经确定这些结构在神经元连通性和突触可塑性的关键要素。利用光学显微镜棘形态的定量分析仍然是由于光的折射内在限制相关的技术限制,一个重要的问题。树突棘可以很容易地确定共聚焦激光扫描荧光显微镜。然而,测量在刺的形状和大小的细微变化是困难的,因为比长度其他脊柱的尺寸通常比固定为200nm的光镜的理论分辨率极限传统的光学分辨率小。

几个最近开发的超分辨率技术已被用来对图像蜂窝结构比200纳米,包括树突棘小。 Ŧ淡褐色技术是基于经典的远场操作,因此允许使用现有的样品制备方法及图像以外的试样的表面上。这里描述的是工作协议,超分辨率结构照明显微镜(SIM)适用于原代海马神经元培养树突棘的影像。 SIM卡可能的应用重叠与激光共聚焦显微镜。然而,这两种技术提出不同的适用性。 SIM卡可提供更高的有效横向分辨率,而共焦显微镜中,由于一个物理针孔的使用量,实现了分辨率的改善以除去离焦光的费用。在这个协议中,原代神经元是使用标准协议,转染的DNA的质粒编码的荧光蛋白质和可使用SIM成像的玻璃盖玻片上培养的。这里所描述的整个协议需要大约2周,因为树突棘是体外后16-17天,当成像树突发育是最优的。协议完成后,树突棘可以在3D系列从使用专门的软件,SIM卡图像堆栈的重建。

Introduction

一个树突棘是神经元膜的小突起。这种结构的特点是专业,如从单一的突触接收输入并代表两个神经元之间的物理接触面积。功能最成熟的树突棘包括一个球状尖,称为头和颈细,头部连接到树突状轴。然而,刺不是静态的,积极移动,不断改变自己的形态,甚至在成人大脑2。在规定时间内有2周的时间,从胚胎后期或出生后早期的时间得出大鼠原代海马神经元培养开发复杂的树突状乔木与众多的膜突起,从早期的filipodia演变为棘状结构3。在此基础上动态行为等特点,树突棘被认为是提供了一个解剖基板的内存存储和突触传递4,5。

鉴于日Ë关键作用的树突棘的大小和形状都在突触功能,它准确地测量它们的尺寸是很重要的。刺从约200到2,000纳米,长度各不相同,可以通过共焦激光扫描荧光显微镜很容易识别。然而,长度比其他脊椎尺寸通常低于传统的光学系统的分辨率,理论上固定衍射约200纳米的6。这些解决权力是不够的成像更精细的细节,如脊柱的脖子和头的宽度。大量的工作一直致力于解决这个问题,许多相对较新的超高分辨率显微技术提供了实质性的进展。特别是,能够实现超越经典极限分辨率,不通过在一个宽视场,非共聚焦显微镜7-10采用横向结构照明显微镜(SIM)丢弃任何发射光。与非线理组合使用这种技术Ř显微技术,它在理论上是可能通过一个无限因子11,以提高光学显微镜的横向分辨率。然而,在大多数实验的情况下,SIM允许将超过由两个1的因子的分辨率极限。如受激发射损耗(STED)显微镜12和光激活定位显微镜(PALM)12其他超分辨率光学显微技术已被应用到树突棘的影像。定位为基础的方法,如PALM需要非常大的数字原始图像,实现超分辨率的,因此在有限的速度。另一方面,受激发射损耗可以达到高的成像速度,但是在相对 ​​低的光子数和视场小,这可能不是SIM卡13的情况。

在本文中,目的是从大鼠原代海马神经元在体外培养提供了一个工作协议到图像树突棘

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Protocol

所有涉及动物实验的程序进行了优化,以减少动物的痛苦,并获得证监会核准的动物实验,阿姆斯特丹大学,赤纬协议#DED204和DED250。

1,准备盖玻片

  1. 切下来的盖玻片为15毫米×15毫米用碳化物或金刚石划片的尺寸,以使它们放入一个12孔板的孔中。
  2. 而在通风橱内工作时,通过充分浸没的盖玻片在浓硝酸溶液(70%重量/重量)在玻璃容器中开始盖玻片涂层。为了确保均匀分布的抖动,然后孵育至少4小时的。它可以重复使用大约2倍的浓硝酸溶液,但它可以通过暴露于光散色。
  3. 除去浓硝酸溶液和蒸馏水洗涤盖玻片四倍30分钟,每次洗涤后小心摇动。
  4. 小心取出水。
    注:接下来的三个步骤是在无菌的层流柜进行。
  5. 浸泡盖玻片在96%的乙醇。从乙醇溶液中取出盖玻片,让他们干。
  6. 火焰盖玻片,并把它们放在一个玻璃容器。用细镊子处理的盖玻片(杜蒙风格工作日钳为例)。
  7. 覆盖容器用铝箔和烘烤在12〜16小时的干热烘箱中于180℃下烤盖玻片可存放在室温下长达1个月,如果盖紧。

2,涂层盖玻片

盖玻片涂层过程有利于神经细胞附着到玻璃表面和树突分支14。

  1. 在无菌层流罩,用消毒小镊子把个人盖玻片在单井12孔板的。
  2. 加入500μl的聚-L-赖氨酸溶液(或足量的淹没盖玻片)。
  3. 包裹吨他板铝箔,以防止蒸发,让它在室温下过夜。
  4. 开始培养之前,小心地吸出聚-L-赖氨酸溶液在无菌的层流罩。
  5. 各用1ml无菌水洗涤两次以及洗,同时防止它们干燥。
  6. 吸出的水完全,加入1 ml电镀液中,并留在组织培养孵化器的盖玻片,直到准备培养板上的细胞。建议在24小时内板上的细胞。

3,拆卸的大脑从E16-E19大鼠胚胎

  1. 通过加热在干燥灭菌过夜或用70%乙醇洗涤它们消毒手术器械。彻底干燥,如果乙醇使用。
  2. 准备几个30毫米菜用1X HBSS缓冲液,并保持他们在冰上。
  3. 安乐死大鼠坝腹膜内注射Euthasol的(160毫克/千克Euthasol在±0.4毫升的体积)。
  4. 核实没有反射的。
  5. 喷雾大坝的腹部用70%乙醇。
  6. 使沿腹部切口,取出子宫。
  7. 从子宫中取出胚胎,并将它们放在一个直径100毫米的培养皿。
  8. 除去大剪刀胚胎的头部,然后将头部中含有冷的1×HBSS缓冲一个新的培养皿。
    注意:从这里在无菌条件下在层流柜中执行的程序到步骤7.1。
  9. 按住头以及大钳的两侧。
  10. 用小剪刀,使在头顶部皮肤矢状切,然后横向剥离皮肤下的大钳。
  11. 使用相同的方法与步骤3.10移除头骨。使矢状切开始在尾端;轻轻地打开颅骨而不损伤脑组织。折叠头骨的两半了横向露出大脑。
  12. 用钝铲,舀出大脑,并将其放入新鲜的冷的1×HBSS。
  13. 海马的4。解剖

    这是非常重要的是,剥离,尽可能快地完成在无菌条件下,以确保细胞活力。保持样品寒冷的冰。

    1. 取下并扔掉小脑与细剪刀。
    2. 通过使沿中线矢状切分离大脑的两个半球。
    3. 就拿每个半球,并放置在两个含有新鲜冷的1×HBSS一个新的30毫米的菜。
    4. 将每个半球,使得颞叶朝向培养皿的底部。
      注:从这里开始,建议使用解剖显微镜。
    5. 轻轻地用小镊子持脑并用另一双钳取出脑。离开半球的其余部分完好无损含有皮质和海马。
    6. 翻身的组织,使海马现面向培养皿的底部。
    7. 轻轻握住半球用p花边用细镊子。使用另一种细镊子,小心地,轻轻取出脑膜。它是更容易开始在嗅球。请小心,以免损坏海马。
    8. 东方的组织,使海马现在朝上。海马现在可通过其特征的C形结构可以看出。
    9. 用细镊子,解剖出海马。它收集在含有新鲜冷的1×HBSS一个新的30毫米的菜。

    5,细胞分离和电镀

    1. 海马计数的总数,然后切成小块。
    2. 收集的碎片,在含有3毫升的1X HBSS一个15毫升的离心管中。
    3. 离心300×g离心5分钟,小心取出上清液。
    4. 加入6微升每海马胰蛋白酶。
    5. 孵育最大20分钟,在37°C。 3分钟后,漩涡。
    6. 洗2次用5ml新鲜冷的1×HBSS,并弃去上清液。
    7. 塞科后ND洗净,加1.5毫升电镀液中,预热至37°C。在电镀介质中的血清会失活胰蛋白酶的活性。
    8. 慢慢磨碎30X与火抛光的巴斯德吸管,直到组织的所有部分都均匀分散成单个细胞。避免起泡。
    9. 加入5 ml电镀的介质预加热到37℃。
    10. 采用台盼蓝活体染色计数细胞。
    11. 播种每孔50000个细胞的12孔板中的1ml电镀培养基中,在第2(总体积2毫升)溶液制备。
    12. 轻轻摇动板均匀分布的细胞。
    13. 在37℃,5%CO 2。后2-3天,用含有10μMFUDR培养基替换一半的电镀培养基(0.5ml)中。
      注:树突棘成像电镀后16-17天进行(16-17天在体外 ,DIV)。

    6。大鼠海马神经元主要使用转染脂质体

    1. 准备表达GFP和培养液(10毫升Neurobasal培养基用100微升GLUTAMAX的)质粒DNA。
    2. 预温孵化中期至37°C。
    3. 准备DNA混合物(A管)。对于每个盖玻片加1微克的DNA在100μl纯Neurobasal培养基中。轻轻混匀。
    4. 准备脂质体混合物(B管)。对于每个盖玻片在100μl纯Neurobasal培养基中加入2μl脂质体。轻轻混匀。
    5. 添加脂质体混合的DNA混合溶液。
    6. 孵育在层流罩30分钟,在室温下进行。
    7. 加入1 ml预热的孵化介质在板1。
    8. 存储板2为5分钟,在37℃,5%CO 2。
    9. 轻轻地逐滴加入200微升的DNA /脂质体的混合到每个孔中并孵育45分钟,在37℃,5%CO 2。
    10. 随着使用小镊子提起coversliPS含有神经元和它们浸泡在含有新鲜温暖的Neurobasal培养基3 cm的天线冲洗,将其移动到板2。
    11. 孵育转染的神经元,在37℃,5%CO 2的48小时。
    12. 检查转染效率转染后24小时。

    7,安装免疫染色的大鼠海马神经元原发性和

    为了提高转染细胞荧光强度,进行免疫染色协议,以提高检测的GFP转染后48小时。

    1. 准备4%PFA和0.05M的TBS。
    2. 温暖的4%PFA溶液至37°C。
    3. 轻轻地从含有盖玻片的孔中吸出培养基。
    4. 加入500μl温暖的4%PFA仔细,以免损坏树突。
    5. 在室温下孵育15分钟。
    6. 用1×HBSS中5分钟洗涤3次。
      注:在这一点上的样品可以存储长达3周,在4℃或免疫染色可以立即开始。
    7. 如果样品储存,洗净用0.05M TBS 3次,每次5分钟。
    8. 在室温下30分钟的TBS-BSA(1%)溶液进行阻挡。
    9. 用0.05M TBS 5分钟洗涤3次。
    10. 添加稀释在温育混合物的初级抗体。
    11. 孵育板1小时,在室温下进行。
    12. 此外,孵育过夜,4℃下轻轻摇动。
    13. 除去第一抗体。
    14. 用0.05M TBS的3倍5分钟洗净。
      注:从这个角度上,保持避光的盖玻片。
    15. 添加辅助荧光标记的抗体稀释孵育混合物。
    16. 在室温下孵育2小时。
    17. 去除二级抗体。
    18. 用0.05M TBS 5分钟洗涤3次。
    19. 用1X结核5分钟,洗2次。
    20. 用细镊子从井中取出盖玻片。
    21. 干用纸巾任何多余的结核病和安装COVerslips使用的安装介质。
    22. 用指甲油密封,防止安装介质的蒸发。

    8,树突棘成像使用结构照明显微镜

    使用的材料中描述的SIM系统树突棘成像具有横向分辨率约为85-110纳米(XY)值和200之间的轴向(Z)的分辨率值 - 250纳米,提供2倍分辨率的提高的一个因素相比,宽视场显微镜。

    注意:使用的SIM树突棘成像典型的做法是一步7.22后2天,但可以做长达3个星期后,如果样品被蒙在鼓里和22受控温度下 - 23°C。

    1. 转动488纳米的激光,汞灯,级控制器,压电调节器中,卤灯,用于发射光并在PC上,并在“ANDOR为N-SIM”模式启动的SIM软件。
    2. 清洁100X TIRF对象的ive用95%乙醇3次,并在必要时,用石油醚。
    3. 使用下面的过滤器设置:520 LP有488分色。
    4. 把浸油对目标下降。检查有没有气泡中的油滴。移动目标向上直到油接触到样品。
      注意:将一个盖过来保护样品不受环境光线和昏暗的灯光在房间里尽可能的阶段。
    5. 物镜的校正彩色设置为37℃,200微米,以获得PSF的最好的对称性。为了设置正确的领口位置,第一个位置在最佳标称位置的客观环,然后检查一个100纳米磁珠的样本。按照最好的PSF的对称性,稍微改变围绕标称1套环的位置。
    6. 用于照明,使用3D-SIM光栅(3D 1layer 100X/1.49所有波长)。开始光栅对准的地方所选光栅块插入SIM照明,与100X 1.49目标到位。使用安装在介质100纳米磁珠样品,用浓度,可以让孤立10-15珠子的视角(FOV)的字段。客观修正衣领设置到所需位置后,选择3D-SIM照明和启动软件引导的调整过程。它将运行(5阶段)×(1方向)×(100的z平面)的图像,从其中将重构FOV与珠。通过适当的投资回报率选择单个珠子,覆盖整个珠,包括失焦的模糊的光后,软件将启动一个自动的PSF拟合,它会根据结果调整光栅的位置。
    7. 检查显微镜的性能,因为重复引起的表的动作和/或温度漂移可能的失准的光栅对准每2周。此外,根据制造商的建议,还检查激光强度和稳定性。
    8. 用95%乙清洁样品表面anol三次。
      注意:对于接下来的步骤见图3的控制面板和内部的SIM软件的正确设置的概述。
    9. 在SIM卡的软件,选择光学配置眼睛FITC和在炮塔1选择一个空滤块,用于目视检查与白光。
    10. 设定的对焦速度和XY工作台,以“微调”的行驶速度。
    11. 打开快门和快速聚焦在样品上。
    12. 再次关闭快门,并将Z坐标为零。
    13. 在炮塔1选择绿色的过滤器使用绿色通道目视检查。
    14. 设置汞灯为最低值的强度。
    15. 移动到样品的边界小心,确保目标不接触密封剂。
    16. 打开快门并迅速通过与可能的最低强度的样品进行扫描。
    17. 当遇到感兴趣的足够明亮的枝晶,围绕感兴趣的片段在视场中,关闭快门。
    18. 软件设置为光学配置3D-SIM卡488和相机设置到读出方式的EM,获得1 MHz的16位,曝光时间100毫秒,激光功率5%和EM获得200。
      注意:请检查绿色滤光片在炮塔2被选中并且炮塔1是空的。
    19. 检查光栅被设置为“移动”,然后单击现场用激光,并通过摄像头查看示例。
    20. 激活查找表。
    21. 如果有必要围绕感兴趣的对象和焦点与对焦速度设置为极精细。
      注意:在读出模式EM增益1 MHz的16位,目标强度的好SIM卡的图像是30,000-45,000之间。
    22. 快速调整相机设置以获得在读出模式EM增益1 MHz的16位30,000-45,000之间的强度值。首次使用:
      1. 激光功率:0% - 20%(以上述制备的样品,5%或2.6毫瓦就足够了)
      2. 曝光时间:50毫秒,2秒
      3. 读出模式:EM增益1 MHz的16位
      4. EM增益:0-300
      5. 转换增益:1倍 - 5.1倍
      6. 格式直播:无分级
      7. 格式捕获:无分级
        注意:这些设置6.3%±1.3%漂白的技术实现的,可接受的最大脱色,这可能显著影响图像质量15的10%限额内。
    23. 单击停止,关闭实时取景。
    24. 在ND序列面板配置3DŽ堆栈的设置:
      1. 范围:2微米
      2. 设置尺寸:120纳米
      3. Z平面
      4. 点击首页位置
      5. 在lambda部分选择的光学配置3D-SIM卡488
    25. 选择3D-SIM作为在N-SIM卡垫的采集模式。
    26. 运行ND序列采集并保存原始数据。
    27. 再次选择光学配置眼睛FITC和重复步骤8.15-8.27,直到整个样品已成像
    28. 三维图像重建:在步骤8.23获取的数据可以重建马上或稍后。开始由Z堆栈与重构切片或重建堆栈模式的默认设置重建重建,必要时进行调整。
      注:为获得最佳效果,Z堆栈应与所指示的步长和重建中重构堆栈模式。总是通过比较它的原始数据,或者最好是在宽视场图像检查重建图像的有效性。可以调整为在重建过程中的参数是对比度和高频率的噪音抑制。两者影响不同原始图片属性如何在重建过程中考虑进去。在箱子低的调制深度的原始数据时,对比度参数起着重要的作用。如果用户拥有的数据集与一个低信号 - 噪声比,则高频的噪声抑制参数可以影响重建质量本身verely。
    29. 当成像完成后,中心的XY工作台和移动目标,一路下跌到其静止位置。
    30. 卸载样品并清洗样品和目标用95%的乙醇。
    31. 关闭软件,并在PC和关掉所有其它设备。
    32. 所获取的图像的三维重建和脊柱的分类可以根据使用NeuronStudio软件之前描述的转换的文件,以TIFF格式(参见4)16以后进行。
    33. 使用重建下列参数在NeuronStudios软件:
      1. 体积:体素尺寸:X:0.03微米; Y:0.03微米; Z:0.120微米。
      2. 枝晶检测:附加比:1.3;最小长度:5微米;离散率:1;重新调整路口:是的。
      3. 脊柱检测:最低高度:0.2微米;最大高度:5.001微米;最大宽度:3微米;最小粗短的大小:10像素;最小的非粗短大小:5 VOXELS。
      4. 脊柱分类:颈部比(头颈部比):1.1;薄比:2.5;蘑菇大小:0.35微米;
    34. 轴突顶点形状:用于渲染NeuronStudio参数固体蚀;突起的顶点颜色:按类型;突起的边缘形状:线;突起的边缘颜色:单色;脊柱形状:固体蚀;脊柱颜色:按类型。
      注意:在三维重建是它也可以设置音量渲染。预设的阈值被设置为20的“重新生成体绘制”选项活跃。不透明是由“自动亮度”检查设置。 “表面只有'和'使用点预渲染”选项也很活跃

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Representative Results

这里描述的是一种标准化的工作协议,用于从成像使用的SIM 体外大鼠原代海马神经元树突棘。该协议的工作流程,其关键步骤示于图1。总体而言,协议需要大约2周的实验工作中的样品制备的第一阶段,包括文化,发展和大鼠原代海马神经元和免疫组化染分离,并且第二相使用SIM卡的样品成像。大鼠原代海马神经元的文化,当神经元已经开发出复杂的树突状乔木承载无数树突棘3,5开始后大约2个星期固定。使用中详细截面1-8中描述的协议,它可以系统地图像树突棘与超分辨率。在使用即16日之前描述的共聚焦荧光显微镜常规树突棘的成像方法比较17,本文所描述使用SIM卡的协议提供了显著更好的图像分辨率和三维重建,允许的神经元膜的突起从早期filipodia到棘状结构的识别和分类 ​​。

图1
图1。该计划显示了一个协议的工作流程,其步骤和时间安排。

图2
图2。树突和树突棘与成像共焦(A)和SIM显微镜(B)的代表性显微照片。如第8所述的收购代表的SIM显微镜,代表共聚焦显微收购ü唱物理针孔大小:30微米激光功率2.6毫瓦,没有平均。收购是从共聚焦和SIM图像(CD,分别)使用NeuronStudio软件16如前所述重建。树突进行了追溯和刺都与调整主要参数,如颈长,颈部直径和头直径后,软件会自动归类。盒装区域显示一个人树突棘与成像共焦(A)和SIM卡(B)和从他们对应的Z个栈(C和D),描绘在分辨率和由此产生的三维重建的精度的差异重建。根据SIM卡的更高的分辨率,无论是头部(E)和颈部(F)的定量分析直径表明,SIM措施显著更小的尺寸比激光共聚焦显微镜对同一树突棘,表明SIM卡能够检测树突棘形态变化较小。 ð ATA在E和F是归一化的参考共焦测量。结果以平均值±5成像在两个及共聚焦显微镜SIM卡模式的树突状部分提取3树突棘的SD。对于颈部直径有焦(100.0±4.296归一化单位)和SIM(50.61±7.642归一化单位)之间的显著差异(** P = 0.0049)的图像,如用学生t检验(E)进行测试。对于头部直径有焦(100.0±6.255归一化单位)和SIM(58.12±9.451归一化单位)之间的显著差异(* P = 0.0209)的图像,如用学生t检验进行测试。

图3
图3截图来自尼康的NIS元素6.14 SIM软件包在本协议中所述的设置。

ve_content“FO:保持together.within页=”总是“> 图4
图4。截图从NeuronStudio三维重建和枝状晶体的代表图像的脊柱分类软件。

表1
表1列出的试剂。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

在这篇文章中的工作协议从大鼠原代海马神经元使用SIM卡在体外培养的图像树突棘描述。在原代海马神经元培养方法是通过Kaech和庄家18中描述的原始方法的改编。的主要差别是使用Neurobasal/B27培养基中,从而消除了星形胶质细胞培养物进料器的要求,并且除了在第3天的有丝分裂抑制剂FUDR能促进神经元的存活,同时抑制神经胶质增生的,如所描述由Brewer 等人 19。

有在协议中许多关键步骤。用于培养板上的细胞的盖玻片的厚度是一个准确的SIM实验的关键。盖玻片处理和涂装过程中不育是很重要的。不要让在2.3和2.4的聚-L-赖氨酸处理过的盖玻片上干燥。在步骤5.8中使用的火焰抛光的移液管的直径是关键的。过于狭隘的提示将导致在稍后阶段低细胞活力。海马尽可能快的隔离可以确保高细胞活力。在培养和胰蛋白酶浓度的时序是至关重要的,以确保高细胞活力。胰蛋白酶酶活性的丧失也可能会影响细胞活力。最后,在步骤5.14中加入FUDR的关键是要促进神经元的存活和抑制神经胶质增殖。

样品成​​像阶段是简单的,当严格遵循协议中所述的收购,可以很容易地重建的三维根据其形态特征进行分析和分类树突棘超分辨率图像在这里和结果进行。如图2所示,在SIM模式下获取的图像的质量显着大于刚好使用相同的显微镜的共焦模式下获得的相同的树突段和个人棘图像更好。这一结果表明THA吨使用的SIM卡可能提供了一个极好的机会,形象多于树突棘形态的微妙变化,作为量化图2E2F。

到目前为止,大部分(荧光)的宽视场显微镜已被用于图像的活细胞,由于其较低的光毒性。同样地,由于其较低的光毒性作用,与常规的(遗传性)fluophores很好的结合,SIM允许活细胞成像和鉴定树突棘在低fluophore在超分辨率表达细胞。相较于其他超高分辨率显微镜的方法,如受激发射损耗或手掌,SIM卡提供了一个快速,低成本的方法从体外大鼠原代海马神经元树突棘的影像。虽然在实践中仅SIM卡比传统的激光共聚焦显微镜由两个折提高分辨率。

SIM卡的限制的一个例子是,它依赖于荧光,这在一些实验设置可以是难以适用。为此,它不依赖于荧光诸如电子显微镜的显微技术可以提供一种可行的解决方案。然而,特别是电子显微镜是一项繁琐,昂贵的一个缓慢的方法。此外,电子显微镜只能进行固定样本。因此,SIM卡更适合活细胞超分辨率成像。用于施加荧光蛋白编码质粒转染的理由是,它会导致在分离的细胞中的一种稀有的,但可再现的胞质标记,防止不同小区重叠枝晶和个人树突棘的识别。转染的免疫染色的组合以前已经显示出增强的荧光17。然而,其他的荧光技术也可以适用于树突棘与SIM的成像,例如可以使用最近去获得足够的荧光染色veloped肌动蛋白结合探针20。

由于最近的技术发展已经使SIM卡的动态细胞成像的应用,证明了高速结构照明显微镜能够100纳米分辨率的帧速率可达11赫兹13,协议本文所述一个非常合乎逻辑的应用前景可能是其应用到现场大鼠原代海马神经元的延时SIM卡和树突棘形态快速的动态变化进行分析。这个应用程序中的下一个挑战可能是与活显微镜长的时间间隔相关的预期累积光毒性。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

这项工作的经费由荷兰科学研究组织(NWO)以中央公积金的VIDI授权号H64.09.016。 CPF是感激医生Silvina A. Fratantoni她的批评意见,并在最后的手稿更正。 GMRDL / EMMM公司受荷兰技术基金会STW(项目12151和11350),这是苏国的一部分,这部分是由经济事务部资助支持。我们感谢尼康仪器Europe BV公司的凯瑟琳·基茨和彼得·德​​兰特的援助和支持。被授予荷兰科学研究组织(补助金820.02.006)支持HX是支持艺术和科学的荷兰皇家科学院(补助11CDP10)和WT。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

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References

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