Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen beskriver en arbeidsprotokoll til bilde dendrittutløperne fra hippocampus nevroner in vitro ved hjelp av Structured Illumination Mikros (SIM). Super-oppløsning mikroskopi ved hjelp av SIM gir bildeoppløsningen betydelig utover lyset diffraksjon grensen i alle tre romlige dimensjoner, slik at avbildning av individuelle dendrittutløperne med forbedret detalj.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schouten, M., De Luca, G. M., Alatriste González, D. K., de Jong, B. E., Timmermans, W., Xiong, H., Krugers, H., Manders, E. M., Fitzsimons, C. P. Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (87), e51276, doi:10.3791/51276 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dendrittutløperne er fremspring som kommer ut dendrite av et nevron, og representerer den primære postsynaptiske mål for eksitatoriske innganger i hjernen. Teknologiske fremskritt har identifisert disse strukturene som sentrale elementer i nevron tilkobling og synaptisk plastisitet. Den kvantitative analysen av ryggraden morfologi ved hjelp av lysmikroskopi forblir et viktig problem på grunn av tekniske begrensninger knyttet til lysets iboende brytning grense. Dendrittutløperne kan lett identifiseres ved konfokal laser-scanning fluorescens mikroskopi. Men, måler små endringer i form og størrelse av pigger er vanskelig fordi ryggraden dimensjoner enn lengden er vanligvis mindre enn konvensjonell optisk oppløsning løst ved lysmikroskopi teoretiske oppløsning grense på 200 nm.

Flere nyutviklede super oppløsning teknikker har blitt brukt til bilde cellulære strukturer mindre enn 200 nm, inkludert dendrittutløperne. These teknikker er basert på klassiske fjernfeltoperasjoner, og derfor tillater bruk av eksisterende prøveprepareringsmetoder og til bilde utover overflaten av en prøve. Beskrevet her er en arbeids protokoll skal gjelde super oppløsning strukturert belysning mikroskopi (SIM) til avbildning av dendrittutløperne i primær hippocampus nevroner kulturer. Mulige anvendelser av SIM overlapper med de konfokalmikroskopi. Men de to teknikkene presentere forskjellige anvendbarhet. SIM gir høyere effektiv lateral oppløsning, mens konfokal mikroskopi, på grunn av bruken av en fysisk pinhole, oppnår oppløsning forbedring på bekostning av fjerning av ute av fokus lys. I denne protokollen, primære nevroner er dyrket på glass dekkglass ved hjelp av en standard protokoll, tilført med DNA-plasmider som koder fluorescerende proteiner og avbildes ved hjelp av SIM. Hele protokollen beskrevet heri tar omtrent 2 uker, fordi dendrittutløperne er avbildes etter 16-17 dager in vitro, nårdendrittiske utvikling er optimal. Etter gjennomføringen av protokollen, kan dendrittutløperne bli rekonstruert i 3D fra serie SIM bildestakker hjelp av spesialisert programvare.

Introduction

En dendrittiske ryggraden er en liten utvekst av nervecellen membran. Dette karakteristiske struktur er spesialisert til typisk motta innspill fra en enkelt synapse og representerer den fysiske kontaktflaten mellom to nerveceller. De funksjonelt modne dendrittutløperne består av en kuleformet spiss, betegnet med hodet, og en tynn hals som forbinder hodet til dendrittiske akselen. Men piggene er ikke statisk og aktivt flytte og endre sin morfologi kontinuerlig selv i den voksne hjernen to. Innen en to ukers periode, rotte primære hippocampus nevroner kulturer som stammer fra slutten av embryonale eller tidlig postnatal tid utvikle komplekse dendrittiske lysthus med mange membran utstikkere som utvikler seg fra tidlig filipodia til spine-lignende strukturer tre. Basert på dette dynamiske atferd og andre kjennetegn, er dendrittutløperne tenkt å gi en anatomisk substrat for minne lagring og synaptisk overføring 4,5.

Gitt the kritisk rolle som dendrittiske ryggrad størrelse og form er i synaptiske funksjon, er det viktig å måle deres dimensjoner nøyaktig. Pigger varierer fra rundt 200 til 2000 nanometer i lengde og kan lett identifiseres ved konfokal laser-scanning fluorescens mikroskopi. Men ryggraden dimensjoner enn lengde er vanligvis under den konvensjonelle optiske systemer 'oppløsning, teoretisk fast ved diffraksjon rundt 200 nanometer seks. Disse løse krefter er utilstrekkelig for imaging finere detaljer, for eksempel bredden på ryggraden nakken og hodet. Mye arbeid har vært dedikert til å løse dette problemet, og mange relativt nye super-oppløsning mikroskopi teknikker har gitt betydelig framgang. Spesielt er det mulig å oppnå oppløsningen ut over den klassiske grense uten å forkaste enhver emisjon lys ved hjelp av sideveis strukturert belysning mikroskopi (SIM) i en bred-felt, ikke-konfokalmikroskop 7-10. Ved hjelp av denne teknikken i kombinasjon med ikke-linear mikroskopi-teknikker, er det teoretisk mulig å forbedre den laterale oppløsning av det optiske mikroskop av et ubegrenset faktor 11.. Men i de fleste eksperimentelle omstendigheter, tillater SIM å overgå oppløsning grense ved en faktor på to til en. Andre super-oppløsning optisk mikroskopi teknikker som stimulert emisjon mangel (STED) mikros 12 og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 12 har blitt brukt til avbildning av dendrittutløperne. Lokaliseringsbaserte metoder som PALM krever svært stort antall RAW-bilder for å oppnå super-oppløsning og er derfor begrenset i hastighet. På den annen side, kan STED oppnå høy bildehastighet, selv ved relativt lave fotontellinger og små synsfelt, noe som kanskje ikke er tilfelle for SIM 13.

I denne artikkelen Målet er å gi en arbeidsprotokoll til bilde dendrittutløperne fra rotte primære hippocampus nerveceller dyrket in vitro

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr ble optimalisert for å redusere dyrs lidelser og ble godkjent av Kommisjonen for forsøk med dyr, Universitetet i Amsterdam, Dec protokollen # DED204 og DED250.

En. Cover Forberedelse

  1. Kutt ned Dekkglass til en størrelse på 15 mm x 15 mm ved hjelp av en karbid eller diamantspiss, slik at de passer inn i brønnene til en 12-brønns plate.
  2. Under arbeidet i et avtrekksskap, begynner dekkbelegg ved fullt submerging dekkglass i konsentrert salpeter-syreløsning (70% vekt / vekt) i en glassbeholder. For å sikre jevn fordeling rister, og deretter inkuberes i minst 4 timer. Det er mulig å gjenbruke den konsentrerte salpetersyreoppløsning i omtrent to ganger, men det kan miste farge ved eksponering for lys.
  3. Fjern den konsentrerte salpetersyre-oppløsning og vaske Dekkglass fire ganger i destillert vann i 30 minutter, forsiktig risting etter hver vask.
  4. Med forsiktighet fjernevann.
    Merk: de tre neste trinn utføres i en steril laminær skap.
  5. Sug Dekk i 96% EtOH. Fjern Dekkglass fra EtOH løsning og la dem tørke.
  6. Flamme Dekkglass og legg dem i en glassbeholder. Bruk fin pinsett til å håndtere Dekkglass (Dumont style nr.5 tang for eksempel).
  7. Dekke beholderen med folie og stek aluminium i en tørr-varme ovnen i 12-16 timer ved 180 ° C. Bakte Dekk kan lagres ved romtemperatur i opptil en måned hvis dekket tett.

2. Cover Coating

Dekk belegg prosedyre favoriserer nevron vedlegg til glassoverflaten og dendrittiske arborization 14.

  1. I et sterilt laminær hette, brukes sterile små tenger for å plassere de enkelte dekkglass i enkeltbrønner i en 12-brønns plate.
  2. Legg 500 mL av Poly-L-lysin løsning (eller tilstrekkelige mengder til å dukke Dekk).
  3. Pakk tHan plate i aluminiumsfolie for å forhindre fordamping og la det stå over natten ved romtemperatur.
  4. Før start av kulturen, suge Poly-L-lysin-løsning forsiktig i et sterilt laminær hette.
  5. Vask hver brønn med 1 ml sterilt vann to ganger, samtidig hindrer dem i å tørke ut.
  6. Sug vannet helt, legge en ml plating medium og la Dekk i vevet kulturinkubatoren til alt er klart til plate cellene. Det anbefales å plate cellene innen 24 timer.

Tre. Fjerning av Brains fra E16-E19 Rat embryo

  1. Sterilisere kirurgiske instrumenter ved å varme dem i en tørr sator over natten eller i å vaske dem med 70% EtOH. Tørk grundig hvis EtOH brukes.
  2. Forbered flere 30 mm retter med 1x HBSS buffer og holde dem på is.
  3. Avlive rat dam med en intraperitoneal injeksjon av Euthasol (160 mg / kg Euthasol i et volum på ± 0,4 ml).
  4. Sjekk for fravær av reflekser.
  5. Spray demningen mage med 70% EtOH.
  6. Gjør et snitt langs buken og fjerne livmor.
  7. Fjern embryoene fra livmor og plassere dem i en 100 mm diameter petriskål.
  8. Fjern hodene på embryoer med store saks og plassere hodet i en ny petriskål inneholder kald 1x HBSS buffer.
    Merk: herfra til trinn 7.1 fremgangsmåten utføres under sterile betingelser i en laminær strømningsskap.
  9. Hold nede hodene langs sidene med store tang.
  10. Med liten saks, foreta en sagittal snitt i huden på toppen av hodet, og deretter sideveis skrelle den ned med en stor tang.
  11. Bruk samme metode som i trinn 3.10 for å fjerne skallen. Lag en sagittal kutt starter på hale slutten; åpning forsiktig skallen uten å skade hjernevev. Brett de to halvdelene av skallen bort lateralt utsette hjernen.
  12. Med den butte spatel, øse ut hjernen og legg den i friskt kaldt 1x HBSS.
  13. 4.. Disseksjon av hippocampi

    Det er svært viktig at disseksjonen er ferdig så raskt som mulig i sterile forhold for å sikre celle levedyktighet. Hold prøvene kaldt på isen.

    1. Fjern og kast lillehjernen med de fine saks.
    2. Skill de to halvkuler av hjernen ved å gjøre en sagittal kutt langs midtlinjen.
    3. Ta hver halvkule og plasser både i en ny 30 mm fatet inneholder frisk kald 1x HBSS.
    4. Plasser hver halvkule slik at tinninglappen vender mot bunnen av fatet.
      MERK: Herfra på, anbefales det å bruke en dissekere mikroskop.
    5. Hold forsiktig midthjernen ved hjelp av en liten tang og fjern midthjernen med en annen pinsett. La resten av halvkulen intakt inneholder cortex og hippocampus.
    6. Snu vev, slik at hippocampus nå er vendt mot bunnen av skålen.
    7. Hold forsiktig halvkule i psnøre med en fin pinsett. Ved å bruke en annen fin pinsett, nøye og forsiktig fjerne hjernehinnene. Det er lettere å starte på luktelappen. Vær forsiktig så du ikke skader hippocampus.
    8. Orientere vev slik at hippocampus er nå vendt opp. Hippocampus kan nå bli sett av sin karakteristiske C-formet struktur.
    9. Ved å bruke fin pinsett, dissekere ut hippocampus. Samle det i en ny 30 mm fatet inneholder frisk kald 1x HBSS.

    5. Cell Dissosiasjon og plating

    1. Telle det totale antall hippocampi, så kutt dem i små biter.
    2. Samle bitene i en 15 ml sentrifugerør inneholder 3 ml 1x HBSS.
    3. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter og fjern supernatanten.
    4. Legg 6 mL trypsin per hippocampus.
    5. Inkuber i maks 20 minutter ved 37 ° C. Swirl etter 3 min.
    6. Vask to ganger med 5 ml av frisk kald 1x HBSS og kast supernatanten.
    7. Etter Second vask, tilsett 1,5 ml av plette medium, forvarmes til 37 ° C. Serumet i pletteringsmedium vil inaktivere trypsin-aktivitet.
    8. Sakte Triturer 30x med en brann-polert Pasteur pipette før alle biter av vev er homogent fordelt i enkeltceller. Unngå bobler.
    9. Tilsett 5 ml av plette medium forvarmet til 37 ° C.
    10. Telle celler ved hjelp av en Trypanblå vital farging.
    11. Seed 50 000 celler per brønn av en 12-brønns plate i en ml plating medium, utarbeidet i § 2 (totalt volum 2 ml).
    12. Rist plate å fordele cellene.
    13. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2. Etter 2-3 dager, erstatte halvparten av pletteringsmedium (0,5 ml) med dyrkningsmedium inneholdende 10 uM FUDR.
      Merk: Dendritic ryggrad bildebehandling er utført 16-17 dager etter plating (16-17 dager in vitro, DIV).

    6. Rat Hippocampus Primær Neuron Transfection hjelp Lipofectamine

    1. Forbered plasmid DNA som uttrykker GFP og inkubering medium (10 ml Neurobasal medium med 100 mL av Glutamax).
    2. Forvarm inkuberingsmediet til 37 ° C.
    3. Forbered DNA mix (Tube A). For hver dekk tilsett 1 ug av DNA i 100 ul av vanlig Neurobasal medium. Bland forsiktig.
    4. Forbered Lipofectamine mix (Tube B). For hver dekk legge to mL Lipofectamine i 100 mL med vanlig Neurobasal medium. Bland forsiktig.
    5. Tilsett Lipofectamine blanding av DNA-blandingen dråpevis.
    6. Inkuber i laminær strømningshette i 30 minutter ved romtemperatur.
    7. Tilsett 1 ml av forvarmede inkuberingsmediet til platen 1..
    8. Butikk plate 2 for 5 min ved 37 ° C, 5% CO 2.
    9. Tilsett dråpevis 200 ul av DNA / Lipofectamine blanding til hver brønn og inkuberes i 45 min ved 37 ° C, 5% CO2.
    10. Ved bruk av små tenger løfte coverslips inneholder nevroner og skyll dem ved å dyppe dem i en 3 cm skål med fersk varm Neurobasal medium og flytte dem til platen to.
    11. Inkuber transfekterte nevroner ved 37 ° C, 5% CO2 i 48 timer.
    12. Sjekk for transfeksjon effektivitet 24 timer etter transfeksjon.

    7. Immunostaining og Montering av Rat hippocampus Primær Neuroner

    For å forbedre fluorescens intensiteten i transfekterte celler, utføre en farging protokollen til å forbedre GFP deteksjon 48 timer etter transfeksjon.

    1. Forbered 4% PFA og 0,05 M TBS.
    2. Varm 4% PFA-løsning til 37 ° C.
    3. Forsiktig aspirere mediet fra brønnene inneholdende Dekkglass.
    4. Legg 500 mL av varm 4% PFA forsiktig for å unngå å skade dendritter.
    5. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    6. Vask med 1x HBSS tre ganger for 5 min.
      MERK: på dette punktet prøver kan lagres i opp til tre uker ved 4 ° Celler farging kan startes umiddelbart.
    7. Ved prøvene ble lagret, vask med 0,05 M TBS 3 ganger i 5 min.
    8. Blokker med TBS-BSA (1%) oppløsning ved romtemperatur i 30 min.
    9. Vask med 0,05 M TBS 3 ganger i 5 min.
    10. Til det primære antistoff fortynnet i inkuberingsblandingen.
    11. Inkuber platene i 1 time ved romtemperatur.
    12. Videre Inkuber over natten ved 4 ° C med forsiktig risting.
    13. Fjern det primære antistoff.
    14. Vask med 0,05 M TBS 3x i 5 min.
      MERK: fra nå av, holde Dekk beskyttet mot lys.
    15. Legg den sekundære fluorescerende-konjugert antistoff fortynnes i inkubasjon mix.
    16. Inkuber ved romtemperatur i 2 timer.
    17. Ta ut den sekundære antistoff.
    18. Vask med 0,05 M TBS 3 ganger i 5 min.
    19. Vask med 1X TB to ganger for 5 min.
    20. Bruk fin pinsett til å fjerne til Dekk fra brønnene.
    21. Tørk overflødig TB med en vev og montere coverslips bruker monteringsmedium.
    22. Forsegle med neglelakk for å hindre fordamping av monteringsmedium.

    8. Dendritic Spine Imaging bruker Struktur Illumination Mikros

    Dendrittiske ryggrad avbildning ved hjelp av SIM-systemet som er beskrevet i materialet har en lateral oppløsning (XY)-verdi på ca 85 til 110 nm og en aksial (Z)-oppløsning verdi mellom 200 til 250 nm, noe som gir en faktor på to ganger forbedring i oppløsning sammenlignet bredt felt mikroskopi.

    MERK: Dendritic ryggraden imaging bruke SIM gjøres vanligvis to dager etter trinn 7.22, men kunne gjøres opp til tre uker senere dersom prøvene er holdt i mørke og under en kontrollert temperatur på 22 - 23 ° C.

    1. Slå på 488 nm laser, kvikksølv lampe, scenen kontrolleren, piezo-kontrolleren, halogenlampen for overført lys og PC-en og starte opp SIM-programvare i "ANDOR for N-SIM"-modus.
    2. Rengjør 100x TIRF objektive med 95% etanol tre ganger, og dersom det er nødvendig med petroleter.
    3. Bruk følgende innstillinger filter: 520 LP med en 488 dichroic.
    4. Ta en dråpe nedsenking olje på målet. Sjekk at det ikke er luftbobler i olje-slipp. Flytt målet oppover til oljen berører prøven.
      Merk: Legg et dekke over scenen for å beskytte prøven mot omgivelseslys, og dimme lysene i rommet så mye som mulig.
    5. Sett korreksjon krage av målet til 37 ° C, 200 mikrometer, for å oppnå best symmetri av PSF. For å stille inn riktig krage posisjon, første posisjon målet ring på optimal nominell stilling, og deretter sjekke en 100 nm perle prøven. Ifølge den beste PSF symmetri, noe endre kragen posisjon rundt den nominelle en.
    6. For belysning, bruke 3D-SIM rist (3D 1layer 100X/1.49 alle bølgelengder). Til å begynne risten innretting sted valgt gitterblokk i SIM-illuminator, med ett00X 1,49 mål i stedet. Bruk en 100 nm perle prøve montert i media, med en konsentrasjon som kan tillate å isolere 10-15 perler for et synsfelt (FOV). Etter å ha satt objektiv korreksjon kragen til ønsket posisjon, velger du 3D-SIM belysning og start programvaren styrt justering prosedyre. Det vil kjøre (5 faser) x (en retning) x (100 z-fly) bilder, som det vil rekonstruere FOV med perler. Etter valg av en enkelt perle via en passende ROI, som dekker hele vulsten herunder ut-av-fokus sløret lys, vil programmet starter en automatisk PSF montering, og det vil justere gitterposisjonen i henhold til resultatet.
    7. For å sjekke ytelsen til mikroskopet, gjenta rist justering hver to uker, på grunn av den mulige feiljusteringer som følge av bordbevegelsene og / eller temperatur drivende. Videre er også kontrollere laserintensitet og stabilitet i henhold til produsentens forslag.
    8. Rengjør prøven overflaten med 95% ethmetanol tilsettes tre ganger.
      Merk: For de neste trinnene se figur 3 for en oversikt over kontrollpaneler og de riktige innstillingene i SIM-programvare.
    9. I SIM-programvaren, velger den optiske Configuration Eye FITC og velg et tomt filter blokk i Turret en for visuell inspeksjon med hvitt lys.
    10. Sett fokus hastighet og kjørehastigheten på XY bordet til "Fine".
    11. Åpne lukkeren og raskt fokusere på prøven.
    12. Lukk lukker igjen og sette Z-koordinat til null.
    13. Velg grønt filter i Turret en for visuell inspeksjon ved hjelp av den grønne kanalen.
    14. Sett intensiteten av kvikksølvlampe på laveste innstilling.
    15. Flytt til grensen av prøven nøye, og pass på at målet ikke berører tetningsmasse.
    16. Åpne lukkeren og raskt søke gjennom prøven med lavest mulig intensitet.
    17. Når man møter på en tilstrekkelig lys dendrite av interesse og sentre et segment av interessei synsfeltet, lukke lukkeren.
    18. Satt opp programvaren for optisk Configuration 3D-SIM 488 og kamerainnstillingene til å lese-ut-modus EM, få en MHz 16-bit, eksponeringstid 100 msek, laser makt 5% og EM får 200.
      MERK: Kontroller at den grønne filter i Turret 2 er valgt og at Turret en er tom.
    19. Sjekk at risten er satt til "Moving" og klikk Live for å vise prøven med laserlys og gjennom kameraet.
    20. Aktiver Look Up Table.
    21. Sentrere objektet av interesse dersom det er nødvendig og fokus med fokushastigheten satt til Extra Fine.
      MERK: i lese-ut-modus får EM 1 MHz 16-bit, er målet intensitet for en god SIM bilde mellom 30,000-45,000.
    22. Raskt justere kamerainnstillingene for å få en intensitet verdi mellom 30,000-45,000 i lese-ut-modus EM få en MHz 16-bit. I første omgang bruke:
      1. Lasereffekt: 0% - 20% (med prøver fremstilt som beskrevet ovenfor, 5% eller 2,6 mW er tilstrekkelig)
      2. Eksponeringstid:50 msek-2 sek
      3. Les-ut-modus: EM få en MHz 16-bit
      4. EM vinne: 0-300
      5. Konvertering gevinst: 1x - 5,1 x
      6. Format for Live: Ingen binning
      7. Format for Capture: Ingen binning
        MERK: med disse innstillingene 6,3% ± 1,3% bleking er rutinemessig oppnådd, innenfor en 10% grense for akseptabel maksimal bleking, noe som kan ha stor innvirkning på bildekvaliteten 15.
    23. Klikk Stopp for å slå av Live view.
    24. Konfigurer innstillingene for 3D-Z stabelen i ND Sequence panelet til:
      1. Range: 2 mikrometer
      2. Sett størrelse: 120 nm
      3. Z planet
      4. Klikk på Hjem stilling
      5. Velg den optiske Configuration 3D-SIM 488 i Lambda-delen
    25. Velg 3D-SIM som oppkjøpsmodus i N-SIM pad.
    26. Kjør ND Sequence oppkjøp og lagre rådata.
    27. Velg den optiske Configuration Eye FITC igjen og gjenta trinn 08.15 til 08.27 til hele prøven er fotografert
    28. 3D Image rekonstruksjon: De data innhentet i trinn 8.23 ​​kan enten bli rekonstruert med en gang eller senere. Start med å rekonstruere Z stabel med standard gjenoppbygging innstillinger i Gjenoppbygg Slice eller Gjenoppbygg Stack modus og juster om nødvendig.
      MERK: For best resultat, bør Z stabler gjøres med den angitte trinnstørrelse og rekonstruert i Gjenoppbygg Stack modus. Sjekk alltid gyldigheten av den rekonstruerte bildet ved å sammenligne den med rådata, eller fortrinnsvis et bredt felt image. Parametrene som kan justeres for gjenoppbyggingen er kontrasten og høyfrekvent støy undertrykkelse. Begge påvirke hvordan ulike rå bildeegenskaper blir tatt hensyn til under gjenoppbyggingen. Ved lav modulasjonsdybde rå data, spiller kontrast parameter en viktig rolle. Hvis brukeren har datasett med lav signal-til-støy-forholdet, så kan den høyfrekvente støybegrensning parameter kan påvirke kvaliteten rekonstruksjon severely.
    29. Når bildebehandling i ferdig, senter XY scenen og flytte målet hele veien ned til sin hvileposisjon.
    30. Koble fra prøven og å rense både prøven og objektiv med 95% etanol.
    31. Slå av programvare og PC-en og slå av alle andre enheter.
    32. 3d gjenoppbygging og ryggrad klassifisering av de oppkjøpte bildene kan utføres etter å konvertere filene til TIFF som beskrevet før du bruker NeuronStudio programvare (se figur 4) 16.
    33. Bruk følgende parametere for gjenoppbygging i NeuronStudios programvare:
      1. Volum: voxel dimensjoner: X: 0,03 mikrometer; Y: 0,03 mikrometer; Z: 0.120 mikrometer.
      2. Dendrite deteksjon: Fest ratio: 1,3; Minimum lengde: 5 mikrometer; Diskretisering Ratio: 1; Rett veikryss: Ja.
      3. Spine deteksjon: Minimum høyde: 0,2 mikrometer; Maksimal høyde: 5,001 mikrometer; Maksimal bredde: 3 mikrometer; Minimum stubby størrelse: 10 voxel; Minimum ikke-stubby størrelse: 5 voxels.
      4. Spine Klassifiserings: Neck ratio (hode-hals ratio): 1,1; Thin ratio: 2,5; Mushroom størrelse: 0,35 mikrometer;
    34. NeuronStudio parametrene som brukes for å gjengi: neurite toppunktet form: Massiv eclipse; Neurite toppunktet farge: etter type; Neurite kanten form: linje; Neurite kantfarven: én farge; Spine form: Massiv eclipse; Spine farge: etter type.
      Merk: Etter 3D rekonstruksjon er det også mulig å stille inn volumet gjengi. Standard terskelen ble satt til 20 med "Regenerate volumgjengivelse alternativet aktiv. Opacity ble satt av 'Automatisk Intensitet' sjekket. 'Surface bare og Bruk Point Pre-Rende' alternativene var også aktiv

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beskrevet her er en standardisert arbeidsprotokoll for imaging dendrittutløperne fra rotte primære hippocampus nevroner in vitro ved hjelp av SIM. Protokollen arbeidsflyten og dens avgjørende trinn er vist i figur 1.. Generelt tar protokollen omtrent 2 uker med eksperimentelt arbeid separert i en første fase av prøvepreparering, inklusive kultur, utvikling og transfeksjon av primære rotte-hippocampus-neuroner og immunohistokjemi og andre fase av prøven imaging bruker SIM. Rotte primære hippocampus nevroner er løst ca 2 uker etter start av kulturen, når nerveceller har utviklet komplekse dendrittiske lysthus bærer mange dendrittutløperne 3,5. Ved hjelp av den protokoll som er beskrevet i detalj i avsnittene 1-8, er det mulig å systematisk bilde dendrittutløperne med super-oppløsning. I sammenligning med en konvensjonell dendrittisk ryggrad avbildningsmetode ved hjelp av konfokal fluorescens mikroskopi som er beskrevet tidligere, 16,17, protokollen beskrevet her ved hjelp av SIM gir betydelig bedre bildeoppløsning og 3D rekonstruksjon, slik at identifisering og klassifisering av nerve membran utstikkere som spenner fra tidlig filipodia til spine-lignende strukturer.

Figur 1
Figur 1. Ordningen viser en protokoll arbeidsflyt, sine trinn og timing.

Fig. 2
Figur 2. Representative mikrografer av dendritter og dendrittutløperne bilde av med confocal (A) og SIM-mikroskopi (B). Representanten SIM micrograph ble kjøpt som beskrevet i punkt 8, ble representant confocal micrograph kjøpte usynge fysisk pinhole størrelse: 30 mikrometer laser makt 2,6 mW, ingen i snitt. Oppkjøp ble rekonstruert fra confocal og SIM-bilder (C og D, henholdsvis) bruker NeuronStudio programvare som beskrevet før 16.. Dendritter ble sporet og pigger ble klassifisert automatisk med programvaren etter justering viktigste parametrene som nakke lengde, nakke diameter og hodet diameter. Eske områdene viser ett individ dendritter i ryggmargen avbildes med confocal (A) og SIM (B) og rekonstruert fra sine tilsvarende Z stabler (C og D), som skildrer forskjellene i oppløsning og nøyaktighet av de resulterende 3D rekonstruksjoner. Ifølge SIM sin ​​høyere oppløsning, kvantitativ analyse av både hode (E) og hals (F) diameter avslører at SIM måler betydelig mindre dimensjoner enn konfokalmikroskopi for de samme dendrittutløperne, noe som indikerer at SIM er i stand til å oppdage mindre endringer i dendrittiske ryggraden morfologi. D ata i E og F er normalisert til referanse confocal målinger. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre dendrittutløperne hentet fra fem dendrittiske segmenter fotografert i både confocal og SIM mikroskop moduser. For nakke diameter var det en signifikant forskjell (** p = 0,0049) mellom confocal (100,0 ± 4,296 normalisert enheter) og SIM (50,61 ± 7,642 normalisert enheter) bilder, som testet med en Students t-test (E). For hode diameter var det en signifikant forskjell (* p = 0,0209) mellom confocal (100,0 ± 6,255 normalisert enheter) og SIM (58,12 ± 9,451 normalisert enheter) bilder, som testet med en Studenter t-test.

Figur 3
Figur 3. Skjermbilde fra Nikons NiS Elements 6,14 SIM programvarepakke med de innstillingene som er beskrevet i denne protokollen.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 4
Figur 4. Skjermbilde fra NeuronStudio 3D rekonstruksjon og ryggrad klassifisering programvare av et representativt bilde av en dendrite.

Tabell 1
Tabell 1. Liste over reagenser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen en arbeidsprotokoll til bilde dendrittutløperne fra rotte primære hippocampus nerveceller dyrket in vitro ved hjelp av SIM-kortet er beskrevet. Den primære hippocampus neuron kulturmetode er en tilpasning av den opprinnelige metoden beskrevet av KAECH og Banker 18.. Den viktigste forskjellen er bruken av Neurobasal/B27 kulturmediet, noe som eliminerer behovet for astroglial matekulturer, og tilsetningen av mitotisk inhibitor FUDR på dag 3 som fremmer neuronal overlevelse med demping av glial proliferasjon, som beskrevet av Brewer et al 19..

Det er mange viktige trinnene i protokollen. Tykkelsen av dekkglass som brukes til platen cellene er avgjørende for en nøyaktig SIM eksperiment. Sterilitet under dekk forberedelse og belegget er viktig. Ikke la poly-L-lysin-behandlet Dekk tørke under 2.3 og 2.4. Diameteren av flamme-polert pipette anvendes i trinn 5.8 er avgjørende.For smal et tips vil resultere i lav celle levedyktighet på senere stadier. Isolering av hippocampi så raskt som mulig vil sikre høy cellelevedyktighet. Tidspunktet for inkubasjon og trypsin konsentrasjoner er avgjørende for å sikre høy celle levedyktighet. Tap av trypsin enzymatisk aktivitet, også kan påvirke cellenes levedyktighet. Til slutt, er tilsetningen av FUDR i trinn 5.14 avgjørende for å fremme neuron overlevelse og inhibere glial proliferasjon.

Prøven bildebehandling fasen er grei når utført følgende strengt protokollen beskrevet her og resultater i oppkjøpet av super oppløsning som lett kan rekonstruert i 3D for å analysere og klassifisere dendrittutløperne henhold til deres morfologiske funksjoner. Som vist i figur 2, er kvaliteten av de bilder ervervet i SIM-modus i det vesentlige bedre enn bilder av nøyaktig de samme dendrittiske segmenter og de enkelte pigger ervervet ved hjelp av konfokal modus av samme mikroskop. Dette resultatet tyder på that bruk av SIM kunne gi en utmerket mulighet til bildet mer enn subtile endringer i dendrittiske ryggraden morfologi, som kvantifiseres i figurene 2E og 2F.

Så langt, for det meste (fluorescerende) bred-felt mikroskopi har vært brukt til å avbilde levende celler, på grunn av sin lave fototoksisitet. Tilsvarende, på grunn av sin lave fototoksiske effekter og god kombinasjon med konvensjonelle (genetiske) fluophores, lar SIM levende celler bildebehandling og identifisering av dendrittutløperne i lav fluophore uttrykker cellene på super-oppløsning. I forhold til andre super-oppløsning mikroskopi metoder som STED eller PALM, gir SIM en rask og rimelig metode for avbildning av dendrittutløperne fra rotte primære hippocampus nevroner in vitro. Selv i praksis SIM bare øker oppløsningen av to ganger sammenlignet med konvensjonelle konfokalmikroskopi.

Et eksempel på en begrensning av SIM er at den er avhengig av fluorescens, noe som inoen eksperimentelle oppsett kan være vanskelig å anvende. For dette formål kan mikros teknikker som ikke er avhengige av fluorescens som elektronmikroskopi tilveiebringe en mulig løsning. Ikke desto mindre er elektronmikroskopi i særdeleshet en omstendelig, dyrt en langsom metode. Videre kan elektronmikros bare utføres på faste prøver. Derfor er SIM mer egnet for super-oppløsning avbildning av levende celler. Begrunnelsen for påføring av et fluoriserende protein som koder plasmid transfeksjon, er at det resulterer i en mangelvare, men reproduserbar cytoplasmisk merking av isolerte celler, og hindrer overlapping av dendritter fra forskjellige celler og identifikasjon av individuelle dendrittutløperne. Kombinasjon av transfeksjon med farging har blitt vist tidligere for å øke fluorescensen 17.. Likevel kunne andre fluorescerende teknikker også gjelde for avbildning av dendrittutløperne med SIM, for eksempel tilstrekkelig fluorescentfarvningsteknikk kunne fremskaffes med nylig utelattveloped aktin bindingsprobene 20.

Siden siste tekniske utviklingen har tillatt bruk av SIM-kortet til dynamisk celle bildebehandling, som viser at høy hastighet strukturert-belysning mikroskop er i stand til 100-nm oppløsning på bildefrekvens på opptil 11 Hz 13, en veldig logisk fremtidig anvendelse av protokollen beskrevet her kunne være sin søknad til time-lapse SIM av levende rotte primære hippocampus nevroner og analyse av raske dynamiske endringer i dendrittiske ryggraden morfologi. En neste utfordring for dette programmet kan være den forventede kumulative fototoksisitet assosiert med lang tidsintervaller av levende mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av en VIDI stipend nummer H64.09.016 fra Nederland Organization for Scientific Research (NWO) til CPF. CPF er takknemlig til Dr. Silvina A. Fratantoni for hennes kritiske kommentarer og rettelser på det endelige manuskriptet. GMRDL / emmm støttes av den nederlandske Technology Foundation STW (prosjekt 12151 og 11350), som er en del av NWO, og som er delvis finansiert av Ministry of Economic Affairs. Vi takker Catherine Kitts og Peter Drent av Nikon Instruments Europe BV for å få hjelp og støtte. HX ble støttet av Royal Dutch Academy of Arts and Sciences (stipend 11CDP10) og WT ble støttet av stipend den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (stipend 820.02.006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker
Name Company Catalog Number Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
  2. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
  3. Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
  4. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
  6. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
  7. Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
  8. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 185-196 (1999).
  9. Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
  10. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
  12. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
  13. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
  14. James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
  15. Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
  16. Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. (2012).
  17. van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. (2009).
  18. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  19. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  20. Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics