TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एकल घटना के प्रस्ताव पर जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis Visualizing

Biology

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Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51805, doi:10.3791/51805 (2014).

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Abstract

Introduction

क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई) के प्रक्रिया पुटिकाओं 1-3 में कार्गो इकट्ठा और प्लाज्मा झिल्ली में हेरफेर करने क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytic मशीनरी के कई घटकों की अच्छी तरह से समय आगमन पर निर्भर है. सीएमई endocytosis 1 की नवजात स्थलों पर एक साथ आते हैं कि झिल्ली deforming और कार्गो एडाप्टर प्रोटीन द्वारा शुरू की है. ये प्रोटीन क्लैथ्रिन में लिपटे गड्ढे (सीसीपी) 4 कि रूपों एक पिंजरे की तरह संरचना में assembles जो कोट प्रोटीन क्लैथ्रिन, भर्ती. सीसीपी पूरी तरह से मुख्य रूप से बड़े GTPase, DYNAMIN की कार्रवाई के माध्यम से एक गोलाकार आकृति, झिल्ली बँटवारा, में इकट्ठे होने के बाद, मुक्त क्लैथ्रिन में लिपटे पुटिकाओं (CCVs) 5,6 उत्पन्न करता है. यह internalization घटकों सीएमई के कई दौर के लिए फिर से इस्तेमाल करने की अनुमति, क्लैथ्रिन कोट का तेजी से disassembly हो सके.

सीएमई में शामिल प्रोटीन की खोज और लक्षण वर्णन पारंपरिक bioch में निहित किया गया हैemical, आनुवंशिक, और माइक्रोस्कोपी तकनीक 4-6,8. ये assays इन endocytic घटकों की भूमिकाओं और बातचीत अंक elucidated है. तस्करी मशीनरी की आवश्यक घटकों को परिभाषित करने के लिए बहुत उपयोगी है, इन assays अत्यधिक सीएमई घटकों या कार्गो एकाग्रता के गतिशील व्यवहार पर कब्जा करने में सीमित कर रहे हैं. सीएमई परिभाषित चरणों में प्रोटीन मॉड्यूल के सेट का नृत्य विधानसभा से प्रेरित है, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण सीमा है, और व्यक्तिगत endocytic घटनाओं की गतिशीलता में छोटे परिवर्तन endocytosis पर बड़े संचयी परिणाम हो सकते हैं. इसके अलावा, हाल के डेटा व्यक्ति CCPS इस प्रक्रिया के शारीरिक विनियमन अत्यधिक स्थानिक और अस्थायी 9-14 विवश, सुझाव है कि रचना में और व्यवहार में दोनों अलग हो सकता है कि संकेत मिलता है. व्यक्तिगत endocytic घटनाओं Visualizing, इसलिए, सीएमई में शामिल कई अनावश्यक प्रोटीन और कैसे इन प्रोटीनों से नियंत्रित किया जा सकता है ख कर रहे हैं समझने के लिए क्यों जरूरी हैवाई शारीरिक संकेतों कार्गो internalization को विनियमित करने के लिए.

यहाँ हम जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत CCPS की गतिशीलता के स्तर पर सीएमई का निरीक्षण करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के उपयोग का वर्णन. TIRFM कांच coverslip और कोशिकाओं 15,16 के तरल पदार्थ वातावरण के बीच अपवर्तनांक में अंतर पर निर्भर करता है. उत्तेजना प्रकाश महत्वपूर्ण कोण से अधिक कोशिकाओं की ओर निर्देशित किया जाता है, यह आंतरिक coverslip ऊपर लगभग 100 एनएम का विस्तार रोशनी की एक पतली क्षेत्र का कहना है कि एक क्षणभंगुर लहर पैदा कर देता है. यह इस संकीर्ण क्षेत्र के भीतर ही फ्लोरोसेंट अणुओं उत्साहित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है. व्यावहारिक रूप से, इस पर या प्लाज्मा झिल्ली के पास फ्लोरोसेंट अणुओं की उत्तेजना की अनुमति देता है, और सेल के आंतरिक भागों से प्रतिदीप्ति कम करता है. यह प्लाज्मा झिल्ली, सह पर घटनाओं कल्पना करने के लिए एक काफी उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात और जेड अक्ष संकल्प प्रदान करता हैऐसे पारंपरिक epifluorescence या confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में अधिक अधिक इस्तेमाल किया प्रकार mpared. हम भी एक परिचयात्मक और व्यावहारिक स्तर पर, का वर्णन है, आमतौर पर इस्तेमाल किया छवि विश्लेषण मंच के उपयोग का विश्लेषण और सरल रूपात्मक सुविधाओं और व्यक्तिगत कार्गो endocytic घटनाओं की गतिशीलता quantitate लिए.

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Protocol

Fluorescently 1. अभिव्यक्ति संवर्धित कोशिकाओं में सीएमई अवयव टैग की गईं

HEK293 कोशिकाओं GPCR जीव विज्ञान और endocytosis अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, और इसलिए इस प्रोटोकॉल में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है कि उपयोगी मॉडल कोशिकाओं रहे हैं. Overexpression और कम cytotoxicity बिना वर्दी अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए किसी भी अभिकर्मक प्रोटोकॉल का प्रयोग करें.

  1. एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में सभी सेल संस्कृति संभाल लेना. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ Dulbecco संशोधित आवश्यक मीडिया (DMEM) के 1 मिलीलीटर के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली के 4 कुओं भरें. HEK293 कोशिकाओं का एक मिला हुआ T25 कुप्पी से 4 कुओं में से प्रत्येक में क्रमश: 01:50, 01:25, 1:16, 1:10 पतला.
    1. वैकल्पिक रूप से, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, इच्छित आकार का एक बहु अच्छी तरह से थाली तक कोशिकाओं बीज. एक 12 अच्छी तरह से थाली में 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं - 0.4 बीज. 5% सीओ 2 और 95% नमी के साथ एक बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात कोशिकाओं को विकसित.
      नोट: कि विकास अनुसंधान को ध्यान में रखतेates की स्थिति और सेल लाइनों के आधार पर बदलती है, यह अभिकर्मक के लिए आदर्श confluency अगले दिन या दो प्रतियों में transfections प्रदर्शन की संभावना को सुनिश्चित करने के लिए कई कुओं बीज के लिए बेहतर हो सकता है.
  2. अगली सुबह, है कि एक अच्छी तरह से ~ अभिकर्मक के लिए 70% मिला हुआ (चित्रा 1 बी देखें) का चयन करें. कोई अच्छी तरह से इस राज्य तक पहुँच गया है, एक दिन इंतजार.
    नोट: 70% confluency HEK293 कोशिकाओं के लिए आदर्श है. कोशिका मृत्यु और विषाक्तता में अधिक विरल परिणाम हैं कि कोशिकाओं transfecting. गरीब अभिव्यक्ति में अधिक मिला हुआ कोशिकाओं परिणाम transfecting.
  3. निर्माता प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में (अभिकर्मक किट से) चुनाव आयोग बफर 60 μl जोड़ें, एन्कोडिंग plasmids के 400 एनजी, GPCRs और / या क्लैथ्रिन मशीनरी का घटक है, और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बढ़ाने के 2.4 μl चिह्नित. 2 सेकंड के लिए भंवर पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने, और तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए 2 सेकंड के लिए 2,000 XG पर एक microfuge में स्पिन करने के लिए.
  4. जोड़ेंनिर्माता प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 6 μl Effectene. एक microfuge में 2 सेकंड के लिए 2,000 XG पर 2 सेकंड के लिए भंवर, और स्पिन तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए. अभिकर्मक जटिल मिसेल्स के गठन के लिए अनुमति देने के लिए 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  5. अच्छी तरह से महाप्राण मीडिया ट्रांसफ़ेक्ट हो. धीरे मिसेल्स तोड़ने को कम करने के लिए धीरे धीरे नीचे अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए 10% FBS के साथ DMEM के 0.8 मिलीलीटर जोड़ने और ऊपर pipetting द्वारा मिश्रण और. ओर से बहुत धीरे से अच्छी तरह से करने के लिए मीडिया और अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें. अच्छी तरह से एक micropipettor का उपयोग करने के लिए microcentrifuge ट्यूब से किसी भी शेष अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं gentler अभिकर्मक और कम क्षणिक अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप अतिरिक्त पोषण देने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट अच्छी तरह से करने के लिए 10% FBS के साथ DMEM के एक अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
  7. अभिकर्मक मिश्रण युक्त महाप्राण मीडिया. 10% FBS के साथ DMEM के 1 एमएल के साथ बदलें. अनुमति देंकोशिकाओं रातोंरात विकसित करने के लिए.
  8. अगले दिन, पहले autoclaving द्वारा निष्फल uncoated coverslips, कोशिकाओं से गुजरती हैं.
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिमी EDTA के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. वैकल्पिक रूप से, 0.05% trypsin EDTA के 0.5 मिलीलीटर का उपयोग करें. 1 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में छोड़ दें.
    2. 3 दौर, 6 अच्छी तरह से थाली की अलग कुओं में बाँझ 25 मिमी coverslips रखें. मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक भरें. धीरे coverslip के तल पर बढ़ती से कोशिकाओं को रोकने के लिए अच्छी तरह से नीचे के लिए नीचे coverslip धक्का.
    3. मैन्युअल अच्छी तरह से नीचे से कोशिकाओं लिफ्ट बंद करने के लिए अच्छी तरह से आंदोलन. 10% FBS के साथ DMEM के 1 मिलीलीटर resuspend में जोड़ें. 3 coverslips के बीच समान रूप से एक 12 अच्छी तरह से थाली में से 1 अच्छी तरह से उठा लिया कोशिकाओं बांटो. वैकल्पिक रूप से, 3 गिलास तली व्यंजन पर कोशिकाओं थाली.
  9. कोशिकाओं इमेजिंग से पहले कम से कम 48 घंटे के लिए coverslips पर विकसित करने की अनुमति. कोशिकाओं बाहर फैला है और फ्लैट हैं कि सुनिश्चित करें.

2.इमेजिंग सीसीपी और कार्गो गतिशीलता का प्रयोग TIRFM

  1. निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार एलेक्सा Fluor प्रोटीन लेबलिंग किट का उपयोग कर एलेक्सा रंगों के साथ एकत्रित एम 1 विरोधी झंडा एंटीबॉडी. वैकल्पिक रूप से, पूर्व संयुग्मित एंटीबॉडी खरीदा जा सकता है.
  2. (इमेजिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 50 मिमी HEPES पीएच 7.4 और 10% FBS के साथ 10% FBS, या Opti- सदस्य के साथ पूर्व गर्म लेबोविट्ज़ माध्यम से 1 मिलीलीटर में 1,000 कमजोर पड़ने: एक 1 में एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं पूर्व सेते मध्यम), कोशिका की सतह पर झंडा चिह्नित GPCRs लेबल करने के लिए. ऐसे GFP के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन,, टैग के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं (विवरण के लिए चर्चा देखें) इन चरणों को छोड़.
  3. एक जीवित कोशिका इमेजिंग कक्ष coverslip स्थानांतरण. वैकल्पिक रूप से, और गिलास तली बर्तन, महाप्राण एंटीबॉडी लेबलिंग मीडिया के लिए पूर्व गर्म इमेजिंग माध्यम के 700 μl जोड़ें.
    1. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें और एक हुक में एक 25 गेज सुई की नोक मोड़.
    2. प्रमुख हाथ में संदंश की एक जोड़ी पकड़ो. अन्य संगठनों में तुला सुई पकड़ोइंजी. नीचे कांच की ओर हुक घटता जब तक सुई मुड़ें. यह coverslip पर हुक धीरे जब तक 6 अच्छी तरह से थाली के नीचे के पार, नीचे सुई, हुक ओर खींचें. यह कोशिकाओं को अलग करेगा, coverslip की सतह खरोंच नहीं करने के लिए ध्यान रखना. धीरे अच्छी तरह से नीचे से coverslip उठा. समर्थन के लिए अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ coverslip शेष.
    3. Coverslip के किनारे के पास समझ और इमेजिंग कक्ष coverslip सेल की ओर ऊपर ले जाएँ, और चैम्बर इकट्ठा संदंश का प्रयोग करें. पूर्व गर्म इमेजिंग माध्यम के 700 μl (या उचित मात्रा) जोड़ें. खुर या तोड़ने को रोकने के लिए दबाव के बिना ध्यान से coverslips संभाल लेना.
  4. माइक्रोस्कोप पर चैम्बर स्थानांतरण और एक मंच हीटर या एक संलग्न इनक्यूबेटर का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के तापमान रखना.
  5. एक 100X या 60X TIRF उद्देश्य तेल विसर्जन (ऊपर 1.45 एनए या) का उपयोग ध्यान में कोशिकाओं लाओ. पारंपरिक epifluorescence या चुनाव में छवि कोशिकाओंरोशनी (यानी नहीं TIRFM) के फोकल मोड उपयुक्त निर्माणों व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए. कोशिकाओं बनाने TIRF रोशनी की पतली गहराई में लगभग अदृश्य बाहर का ध्यान केंद्रित यह मुश्किल फोकल हवाई जहाज़ और कोशिकाओं को खोजने के लिए.
    नोट: कुछ सिस्टम महत्वपूर्ण कोण से ऊपर लेजर की घटना के कोण ले जाकर, पारंपरिक epifluorescence में छवि को TIRFM के लिए एक ही लेसरों का उपयोग करें. एक महत्वपूर्ण सुरक्षा एहतियात के रूप में, हमेशा लेजर बीम के कोण के बारे में पता है, और हमेशा दूर पर्यवेक्षक से यह प्रत्यक्ष.
  6. सेल के आसपास प्लाज्मा झिल्ली की रूपरेखा गायब हो जाता है और कोशिका के केंद्र में प्रकट होता है जब तक एक व्यक्त सेल के नीचे की सतह के नीचे ध्यान दें. इस तरह के μ-opioid रिसेप्टर (2A चित्रा देखें) के रूप में एक प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकृत कार्गो प्रोटीन के साथ सबसे स्पष्ट है.
  7. TIRF इमेजिंग में बदलें.
    1. पारंपरिक epifluorescence में इमेजिंग के लिए एक ही लेसरों का उपयोग करते हैं, की घटना के कोण में वृद्धिसेल के इंटीरियर में बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति तक लेजर गायब हो जाता है, और सेल के आसपास प्लाज्मा झिल्ली की कोई रूपरेखा में देखा जाता है. (आंकड़े 2A और 2 बी को चित्रा -2 की तुलना करें)
      नोट: TIRFM में, फोकल हवाई जहाज़ से आगे बढ़ ध्यान और / या मंद पूरी तरह से बाहर जाने के लिए छवि का कारण बनता है, और समग्र प्रतिदीप्ति स्तर रोशनी के छोटे गहराई की वजह से कम हो जाती है. इसलिए, एक वैकल्पिक विधि TIRFM रोशनी करने के लिए स्विच करने के लिए तो प्लाज्मा झिल्ली के नीचे ध्यान केंद्रित तो आप प्रतिदीप्ति की सबसे खोना जब तक घटना के कोण में वृद्धि, और पारंपरिक / confocal epifluorescence में सेल के केंद्र पर पहले ध्यान केंद्रित है.
    2. एक बार TIRFM में, उत्तेजना लेजर उद्देश्य के माध्यम से वापस दर्शाता है और उद्देश्य के ऊपर दिखाई तो नहीं है. लेजर हाजिर दिख रहा है अगर जाँच करके यह पुष्टि.
      नोट: पारंपरिक epifluorescence या confocal मोड में, लेजर रोशनी, उद्देश्य ऊपर दिखाई देता हैछत पर जैसे.
    3. एक कुरकुरा छवि प्राप्त करने के लिए ध्यान केंद्रित करने को परिष्कृत करें. endocytic मशीनरी का मुख्य घटक है, ऐसे क्लैथ्रिन के रूप में, puncta में दिखाई जाएगी. ठीक पर फोकस समायोजित करें, ताकि puncta संभव के रूप में गोल के रूप में कर रहे हैं.
      नोट: filopodia अलग दिखाई देते हैं जब तक झिल्ली स्थानीय माल के लिए, ठीक ध्यान समायोजित.
    4. ऐसे दर्पण और TIRF कोण के रूप में सभी इमेजिंग मापदंडों को बचाने के लिए एक अधिग्रहण कार्यक्रम का उपयोग करें. सभी आवश्यक तरंगदैर्ध्य के लिए यह करो.
  8. सभी वांछित endocytic मार्कर व्यक्त कोशिकाओं को खोजने के लिए coverslip चारों ओर स्कैन: μ-opioid रिसेप्टर और चित्रा 3 ए में दिखाए गए उदाहरण में अनुकूलक β-arrestin. व्यक्त लेकिन अधिक व्यक्त नहीं कर रहे हैं कि कोशिकाओं का चयन करें. विवरण के लिए चर्चा देखें.
  9. कोशिकाओं की पहचान हो जाने के बाद 10 मिनट के लिए छवियों हर 3 सेकंड के अधिग्रहण. इन परिस्थितियों में imaged HEK293 कोशिकाओं में एक सीसीपी की औसत जीवनकाल एआरओ है, क्योंकि यह एक सीसीपी के जीवनकाल पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त हैअंड 40 सेकंड 10-11. इस सीसीपी निरीक्षण करने के बारे में 12-14 फ्रेम की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए फिल्म 1 देखें. छवि अतिरिक्त कक्षों के लिए सभी चरणों को दोहराएँ.

मैनुअल सत्यापन द्वारा endocytic गतिशीलता की 3 विश्लेषण

सीसीपी जन्मों की पुस्तिका सत्यापन काफी पता लगाया जा सकता है कि CCPS की संख्या सीमित है, हालांकि, यह अभी भी छवि और पहचान कलाकृतियों में वैश्विक परिवर्तन से व्याकुल पता लगाने का सही साधन बनी हुई है. विवरण के लिए चर्चा देखें.

  1. ImageJ में फ़ाइल खोलें. छवियाँ interleaved चैनल के साथ झगड़ा फ़ाइलों की एक एकल ढेर के रूप में जमा हो जाती है. Hyperstacks लिए छवियों को बदलने. Hyperstacks> Hyperstack को ढेर> छवि पर जाएँ. (इमेजिंग β-arrestin और μ-opioid रिसेप्टर, 2 दर्ज यानी अगर) का अधिग्रहण चैनलों की संख्या दर्ज करें, (TIRFM एक ही विमान है) जेड ढेर के लिए 1 लिखें, और फिल्म के तख्ते की संख्या (यानी एक 10 मिनट 1 फ्रेम हर 3 सेकंड मैं पर फिल्मपॉप अप विंडो में 200).
  2. hyperstack प्रारूप दो स्क्रॉल सलाखों के साथ एक खिड़की पैदावार. समय के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए चैनलों और नीचे के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए शीर्ष पट्टी का उपयोग करें. जिसका जीवन काल assayed किया जाएगा प्रोटीन के चैनल के लिए स्क्रॉल.
  3. जिसका पूरे अवधियों दिखाई नहीं कर रहे पूर्व मौजूदा CCPS के शामिल किए जाने को कम करने के लिए 10 या फिल्म के 15 फ्रेम करने के लिए ले जाएँ. यादृच्छिक पर चुना एक स्थान के चारों ओर एक रॉय बॉक्स आकर्षित.
  4. एक जगह दिख रहा है फ्रेम की संख्या की गणना.
    नोट: endocytic घटनाओं 10,11,16-19 के तीन रूपात्मक श्रेणियों के उदाहरण के लिए चित्रा 3B और 3C देखें.

उद्देश्य मान्यता से endocytic गतिशीलता के 4 विश्लेषण

उद्देश्य मान्यता एक सेल में imaged CCPS के लगभग सभी का पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन कारण गलत संरचनाओं के नकली का पता लगाने के लिए त्रुटि होने का खतरा हो सकता है. फायदे और ई के नुकसान तौल विवरण के लिए चर्चा देखेंACH विधि. कस्टम निर्मित एल्गोरिदम सहित कई कार्यक्रमों, निष्पक्ष CCPS पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल Imaris, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री देखें) का उपयोग CCPS के उद्देश्य मान्यता का वर्णन है.

  1. शुरू करने के लिए, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कच्चे छवि फ़ाइल खोलने. डिफ़ॉल्ट रूप से, एक विलय रंग छवि प्रकट होता है. एक चैनल की चमक को समायोजित करने के लिए "प्रदर्शन समायोजन" विंडो का उपयोग करें. प्रदर्शित रंग बदलने के लिए एक चैनल के नाम पर क्लिक करें. अपने प्रदर्शन को रोकने के लिए चैनल के बगल में बॉक्स को अनचेक (चित्रा -4 ए देखें).
  2. नारंगी रंग के धब्बे के साथ आइकन पर क्लिक करके "स्पॉट" बनाएँ. 4B चित्रा देखें. सेल के आसपास ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करें. चित्रा 4C देखें. गलत तरीके से उज्ज्वल प्रमुख किनारों और सजीले टुकड़े का पता लगाने जाएगा कि क्षेत्रों को बाहर करने के लिए एक रॉय का प्रयोग करें. अलग अलग अभिव्यक्ति के स्तर के साथ कई कोशिकाओं का विश्लेषण.
  3. प्रावधानों को एक स्थान का व्यास उपायएल्गोरिथ्म के लिए डे प्रारंभिक अनुमान. "स्लाइस" मोड में स्विच करें, और उसके व्यास को मापने के लिए एक जगह के ध्रुवीय सिरों पर क्लिक करें. चित्रा 4E देखें. गठन के बाद और बँटवारा से पहले, अपनी स्थिरता की ऊंचाई पर एक सीसीपी का संकेत है कि देखो 4 या 5 दौर स्पॉट के लिए यह करो. एक माइक्रोन के निकटतम दसवें करने के लिए नीचे औसत व्यास की गणना करने के लिए इन माप का उपयोग करें.
  4. स्पॉट का पता लगाने. "पार" मोड में वापस. पता लगाने के लिए उपयुक्त चैनल का चयन करें. , आमतौर पर 0.3 या 0.4 माइक्रोन औसत मापा व्यास लिखें. स्पॉट यों नीले आगे तीर पर क्लिक करें. चित्रा 4E देखें. स्पॉट के व्यास को कम करके आंका जाता है, तो प्रतिदीप्ति की नकली अंक धब्बे के रूप में पहचाना जाएगा. व्यास भी बड़ी है, सच स्पॉट नजरअंदाज कर दिया जाएगा. जब अनिश्चित, थोड़ा सा कम का अनुमान है, और बाद में गलत detections बाहर फिल्टर.
  5. गुणवत्ता से स्पॉट फ़िल्टर. पीठ के बिना संभव के रूप में कई स्थानों पर कब्जा करने के लिए फिल्टर समायोजितजमीन. गुणवत्ता फिल्टर डिफ़ॉल्ट 20 से चयन किया जाता है. चित्रा 4F देखें.
    1. एक उचित सीमा निर्धारित करने के लिए एक गाइड के रूप में "गुणवत्ता" वक्र का प्रयोग करें. वक्र में यह पहली डुबकी के लिए बाईं माउस बटन के साथ फिल्टर के नीचे दहलीज पर ले जाएँ. इस स्थिति में आम तौर पर ही दिखाई स्पॉट का पता लगाने को परिष्कृत रूप में इस फिल्टर के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है. चित्रा 4F देखें.
    2. पता लगाया गया स्पॉट क्षेत्रों या केंद्र पिक्सल के रूप में फिल्म पर दिखाई देते हैं. "रंग" टैब का उपयोग करना, यह आसान उन्हें देखने के लिए बनाने के लिए एक विषम रंग को स्पॉट का रंग समायोजित करें. प्रत्येक फ्रेम में स्पॉट समीक्षा करने के लिए फिल्म के माध्यम से स्क्रॉल करें. लक्ष्य अपने जीवन काल की सम्पूर्णता के लिए संभव के रूप में कई स्थानों का पता लगा है.
    3. Dimmer धब्बे खत्म या मैन्युअल वे अपने जीवन काल के पाठ्यक्रम के माध्यम से अच्छी तरह से पता चला नहीं कर रहे हैं, पर बाद में निरंतर पटरियों में उन्हें कनेक्ट.
    4. एक "तीव्रता" fil साथ उज्ज्वल सजीले टुकड़े निकालेंआतंकवाद, यदि आवश्यक हो. एक नए फिल्टर जोड़ने के लिए हरी धन चिह्न पर क्लिक करें. चित्रा 4F देखें. में या किसी दिए गए प्रतिदीप्ति संकेतों के धब्बे बाहर फिल्टर करने के लिए एक तीव्रता फ़िल्टर बनाएं. सीमा निर्धारित करने के लिए (4.5 में चर्चा की गुणवत्ता वक्र के अनुरूप) उत्पन्न तीव्रता वक्र, का प्रयोग करें. प्रतिभाशाली स्पॉट का प्रतिनिधित्व करता है कि वक्र के चरम बाईं अंत दूर करने के लिए बाईं माउस बटन का प्रयोग करें.
      नोट: बड़े पट्टिका संरचनाओं सेल में प्रतिभाशाली तत्वों के बीच आम तौर पर कर रहे हैं, और वे आसानी से इस फिल्टर के साथ बाहर रखा गया है.
    5. CCPS धब्बे के रूप में पता चला रहे हैं और प्रतिभाशाली सजीले नहीं रह पाया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्म के माध्यम से स्क्रॉल करें. चित्रा 3 डी CCPS की पहचान (सफेद क्षेत्रों से चिह्नित) जहां एक सेल गुणवत्ता फिल्टर के साथ अनुकूलित किया गया था और सजीले गुणवत्ता के साथ बाहर रखा गया पता चलता है फिल्टर.
    6. गुणवत्ता फिल्टर के साथ उज्ज्वल सेल किनारों कम करें. उज्ज्वल वस्तुओं अभी भी अगले कदम पर, मैन्युअल हटा दिया जाना पड़ सकता है. नीले रंग के साथ जारी रखेंतीर.
    7. संपादित स्पॉट स्क्रीन में न्यायपालिका धब्बों को दूर. मोड "चुनें" में बदलें. मौके पर क्लिक करें. यह पीला हो जाएगा. "हटाएँ" क्लिक करें. कलन विधि का निर्माण जारी रखने के लिए नीले तीर क्लिक करें. चित्रा 4G देखें.
  6. उपाय पटरियों. "ब्राउनियन गति." सीसीपी किसी भी निर्देशित आंदोलन, प्लाज्मा झिल्ली भर में केवल न्यूनतम बहती प्रदर्शन नहीं करना चाहिए करने के लिए पटरियों निर्धारित करें. इस एल्गोरिथ्म कि गति के लिए सबसे उपयुक्त है. चित्रा 4H देखें.
    1. 0.7 माइक्रोन के रूप में इस तरह के एक छोटे मूल्य के लिए अधिकतम दूरी स्थापित करें. चित्रा 4H देखें.
      नोट: एक छोटी दूरी की स्थापना आसन्न स्पॉट का कनेक्शन कम से कम है और अभी भी सीसीपी या सेल आंदोलन के माध्यम से एक सेल स्थान के निरंतर नज़र रखने के लिए अनुमति देता है.
    2. इस उत्तराधिकार में लापता केवल एक फ्रेम अगर वहाँ जारी रखने के लिए एक ट्रैक की अनुमति देता है 1 करने के लिए अधिकतम गैप आकार सेट. पटरियों की गणना करने के लिए नीले तीर क्लिक करें. चित्रा 4H देखें.
      नोट: जीअधिक से अधिक 3 कारणों अलग पटरियों के एपी आकार गलत तरीके से एक साथ जोड़ा जा सके.
    3. को देखने स्विच ट्रैक "ड्रैगन टेल." पत्रिका का पता लगाने की गुणवत्ता को देख फिल्म के माध्यम से. आसन्न स्पॉट जोड़ा जा रहा है, तो 0.7 माइक्रोन से नीचे अधिकतम दूरी कम हो. स्पॉट भी आसानी से टूट किया जा रहा है, तो अधिकतम अंतराल के आकार में वृद्धि. पटरियों बनाने के लिए नीले तीर क्लिक करें. इस फिल्टर पटरियों स्क्रीन की ओर जाता है. चित्रा 4H देखें.
  7. फ़िल्टर पटरियों और निर्यात डेटा. अतिरिक्त उज्ज्वल सजीले टुकड़े को दूर करने के लिए एक "तीव्रता" फिल्टर का प्रयोग करें. TIRF क्षेत्र में प्रवेश कि endosomes दूर करने के लिए एक "विस्थापन" फिल्टर का प्रयोग करें. अब धब्बे के रूप में अच्छी तरह से लंबे समय तक विस्थापन होगा, के रूप में सावधानी बरतें. प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए हरी डबल तीर पर क्लिक करें. चित्रा 4I देखें.
    1. फिल्टर से हटाया नहीं जा सकता है कि पटरियों की झूठी सकारात्मक detections दूर करने के लिए, पेंसिल आइकन के साथ, संपादित पटरियों टैब का उपयोग करें. Discont के लिए जाँच करेंinuities या गलत कनेक्शन. दो पटरियों से कनेक्ट करने के लिए, तो संपादित पटरियों बॉक्स में "कनेक्ट" पर क्लिक करें, Ctrl-बाएँ क्लिक का उपयोग कर उन्हें चुनें. अलग स्थानों में पटरियों डिस्कनेक्ट करने के लिए, एक ट्रैक का चयन करें और "डिस्कनेक्ट" मारा. साथ एकाधिक स्थानों का चयन करें Ctrl + वाम क्लिक करें और एक नया ट्रैक बनाने के लिए "कनेक्ट" पर क्लिक करें. विधि 4.5.7 में वर्णित संपादन स्पॉट, के लिए ही है. चित्रा 4J देखें.
    2. डेटा निर्यात करने के लिए, आंकड़े टैब पर जाएं. चयनित आंकड़ा निर्यात करने के लिए एक फ्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करें. सभी आँकड़े निर्यात करने के लिए फ्लॉपी डिस्क की एक श्रृंखला की तरह लग रहा है कि आइकन पर क्लिक करें. "ट्रैक अवधि" आंकड़ा endocytic पटरियों की लंबाई में शामिल है. चित्रा 4K देखें.

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Representative Results

का प्रयोग रहते सेल TIRF माइक्रोस्कोपी हम μ-opioid रिसेप्टर (MOR) के endocytic गतिशीलता दर्ज की गई है, एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) और उसके endocytic एडाप्टर प्रोटीन β-arrestin. β-arrestin निर्माण क्षणिक चित्रा 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग एक stably व्यक्त MOR सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट, और 96 घंटे बाद उतारी थी. स्थिर सेल लाइन में MOR एन टर्मिनली एक पीएच के प्रति संवेदनशील GFP के साथ चिह्नित है. इस फ्लोरोसेंट प्रोटीन केवल तटस्थ कोशिकी द्रव में fluoresces. इसके अलावा, MOR केवल एक बार एक agonist द्वारा सक्रिय endocytoses, और नहीं तो समान रूप से प्लाज्मा झिल्ली भर में वितरित रहता है. एक मंद प्रतिदीप्ति साथ में भर जाता है कि एक सेल में confocal मोड परिणामों में कवर कांच पर बैठा है कि पक्षपाती प्लाज्मा झिल्ली पर केंद्रित है. यह एक प्लाज्मा झिल्ली केवल सेल के आसपास प्रतिदीप्ति की एक अंगूठी के रूप में देखा जाता है, जहां सेल के केंद्र पर ध्यान केंद्रित से अलग है. बाएं से तुलनाचित्रा 2A में और सही पैनल. एक गलत कोण के साथ पारंपरिक epifluorescence या TIRF को स्विच चित्रा 2B में दिखाया गया है कि एक ही कोशिकाओं में स्पष्ट बनने के लिए ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति से बाहर का कारण बनता है. TIRF कोण सही है जब प्लाज्मा झिल्ली बहुत कुरकुरा, स्पष्ट और उज्ज्वल है और ध्यान प्रतिदीप्ति से बाहर नहीं रह छवि बाधित. आंकड़े 2A और 2 बी को चित्रा -2 की तुलना करें.

MOR काफी हद तक TIRF क्षेत्र के भीतर जो पक्षपाती प्लाज्मा झिल्ली, पर है क्योंकि छवि स्पष्ट और तेज है. इसके विपरीत, β-arrestin अभी तक endocytic puncta के लिए भर्ती नहीं जब एक साइटोसोलिक पूल में रहता है, और यह TIRF क्षेत्र में नहीं है क्योंकि धुंधला और ध्यान से बाहर दिखाई देता है. MOR एक agonist से सक्रिय होता है, β-arrestin प्लाज्मा झिल्ली को भर्ती किया, और दोनों β-arrestin और रिसेप्टर CCPS (चित्रा 3 ए और 1 मूवी को फिर से विभाजित है , लाल, ओवरले में हरे, mor में β-arrestin) पीला है.

चित्रा 3B में दर्शाया के रूप में इन समूहों के जीवन काल पूरा endocytosis के लिए तीन मापदंडों का उपयोग मैन्युअल मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. CCPS denoting स्पॉट (भी चित्रा 3C देखें), पर और बंद "झपकी" या एक बड़ी संरचना "चुटकी" पूरी तरह से गायब हो सकते हैं या तो. बाद के दो स्थितियां स्थानिक भी एक साथ बंद कर रहे हैं अलग घटनाओं के रूप में हल किया जाना है कि घटनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा 4 में उल्लिखित के रूप में Imaris में स्थान का पता लगाने एल्गोरिथ्म, CCPS यों भी उपयोगी है. चित्रा 3 डी CCPS गैर गतिशील पट्टिका संरचनाओं को हटाने के लिए छानने के बाद, Imaris का उपयोग कर पता लगाया अर्थ. मढ़ा सफेद क्षेत्रों का पता चला स्पॉट निरूपित. अपने पूरे जीवन काल के लिए पता नहीं किया जा सकता कि Dimmer धब्बे भी "गुणवत्ता" फिल्टर के साथ बाहर रखा गया है.

"> चित्रा 1
चित्रा 1: अभिकर्मक प्रक्रिया का फ्लो चार्ट. (ए) पहले, एक 12 अच्छी तरह से थाली पर dilutions (1:50, 1:25, 1:16, 1:10) की एक किस्म के बीज. कोशिकाओं रातोंरात विकसित करने की अनुमति. अगले दिन, के बारे में 70% मिला हुआ है, और दर्शाया के रूप में समान रूप से वितरित है कि एक अच्छी तरह से देखो. इस ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा कि अच्छी तरह से है. (बी) एक microcentrifuge ट्यूब में चुनाव आयोग बफर के 60 μl और डीएनए के 400 एनजी जोड़ें. 10 सेकंड के लिए भंवर और ट्यूब के नीचे तरल स्पिन. बढ़ाने के 2.4 μl जोड़ें. 2 सेकंड के लिए भंवर और ट्यूब के नीचे तरल स्पिन. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. Effectene के 6 μl जोड़ें. 2 सेकंड के लिए भंवर और ट्यूब के नीचे तरल स्पिन. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. (सी) धीरे अभिकर्मक के साथ 10% FBS के साथ DMEM के 0.8 मिलीलीटर मिश्रण. अच्छी तरह से चयनित पहले में कोशिकाओं को जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. ताजा साथ बदलें10% FBS के साथ DMEM.

चित्रा 2
चित्रा 2: TIRFM क्षेत्र ढूँढना. (ए) confocal में imaged प्लाज्मा झिल्ली. बाएं पैनल सेल के केंद्र पर ध्यान देने के साथ confocal में कोशिकाओं को दर्शाया गया है. प्लाज्मा झिल्ली केवल सेल के चारों ओर एक "अंगूठी" के रूप में देखा जाता है. बेसल प्लाज्मा झिल्ली के नीचे ध्यान केंद्रित coverslip के निकट सेल एक धुंधला प्रतिदीप्ति साथ में भरे जाने का कारण बनता है. प्लाज्मा झिल्ली "अंगूठी" पतली TIRF क्षेत्र में दिखाई नहीं होना चाहिए. (बी) नमूना के माध्यम से पारंपरिक epifluorescence रोशनी उत्पादन एक shallower TIRF कोण के साथ बेसल प्लाज्मा झिल्ली. यह मौजूद है सेल के ऊपर से पूरे सेल और फोकस प्रतिदीप्ति के बाहर ज्यादा illuminates. (सी) TIRF में प्लाज्मा झिल्ली. Filopodia पर केंद्रित इस विमान को खोजने के लिए मदद करता है. यह है कि नोटिसएक चिकनी एकल विमान. स्केल सलाखों 10 माइक्रोन हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3: Visualizing और TIRF में endocytic घटनाओं बढ़ाता. (क) पहले और endocytosis लाती है कि एक agonist के बाद इसके अलावा μ-opioid रिसेप्टर (MOR) और β-arrestin व्यक्त सेल. एगोनिस्ट endocytic puncta के लिए दोनों प्रोटीन के पुनर्वितरण का कारण बनता है. स्केल बार 10 माइक्रोन है. (बी) arrestin गतिशीलता, पहले वर्णित morphologies साथ संगत visualizing द्वारा देखा endocytic घटनाओं, के तीन प्रकार. "स्थिर", तेजी से गायब हो जाता है कि एक स्थिर संकेत. इस सीसीपी अंकुरित और TIRF क्षेत्र छोड़ दिया है यह दर्शाता है कि मुख्य प्रकार है. , झपकाए एक संकेत है कि "झपकी" एक कम संकेत करने के लिए और कारण एक ही स्थान पर एक दूसरे सीसीपी की विधानसभा के लिए एक ही स्थान पर reappears. दो CCPS भी एक दूसरे के करीब अलग धब्बे के रूप में हल हो जाना हो तो, एक ट्यूबलर प्रक्षेपण एक जगह से आता है, "चुटकी", और एक endocytosed है. बॉक्स 2 एक्स 2 माइक्रोन है. (सी) एकल घटना के प्रस्ताव पर mor के क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis Visualizing. MOR endocytic घटनाओं के प्रमुख अंश का प्रतिनिधित्व करने वाले दो उदाहरण दिखाए जाते हैं. फ्रेम्स हर 3 सेकंड हैं. बॉक्स. 2 एक्स 2 माइक्रोन है Imaris का उपयोग व्यक्तिगत endocytic घटनाओं (डी) जांच. सफेद क्षेत्रों स्पॉट के रूप में पहचान CCPS निरूपित. स्थान का पता लगाने के लिए एक "गुणवत्ता" फिल्टर का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था. अपने जीवन काल की सम्पूर्णता के लिए पता नहीं किया जा सकता कि Dimmer धब्बे भी गुणवत्ता फिल्टर के साथ बाहर रखा गया है. नहीं चल पाता जा रहा है के रूप में दिखाया जाता है कि बड़े पट्टिका संरचनाओं एक "तीव्रता" फिल्टर का उपयोग कर छोड़े गए थे.ig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4: Imaris का उपयोग endocytic घटनाक्रम की गतिशीलता के उद्देश्य मान्यता. (ए) कदम 4.1 में वर्णित के रूप में छवि के प्रदर्शन को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रदर्शन समायोजन खिड़की,. (बी) "स्पॉट" एल्गोरिथ्म बिल्डर खोलना. बिल्डर नीचे खिड़की में प्रदर्शित किया जाता है. (सी) स्पॉट एल्गोरिथ्म बिल्डर का पहला कदम. यदि आवश्यक हो तो "(समय के साथ) ट्रैक स्पॉट." जाँच ", ब्याज की खण्ड केवल एक क्षेत्र" की जाँच करें. (डी) आरओआई चयन स्क्रीन. जानकारी के लिए 4.2 कदम देखें. (ई) एक मापा स्पॉट के व्यास को परिभाषित करने की जरूरत कई खिड़कियां. पैनलों का प्रतिनिधित्व करते हैं: नवी का उपयोग स्लाइस मोड में पार से स्विचमापा व्यास आम तौर पर मापा व्यास दर्ज करने के लिए जहां अब तक दाहिने हाथ की ओर, पर प्रदर्शित जहां एक जगह के ध्रुवीय सिरों पर क्लिक शीर्ष पर gation बार,. देखें कदम 4.3-4.4. (एफ) 4.5-4.5.3 में वर्णित स्थान गुणवत्ता फिल्टर. 4.5.7 में वर्णित (जी) संपादित स्पॉट खिड़की. (एच) उपाय पटरियों और देखने पटरियों विंडोज, 4.6 में वर्णित है. (मैं) फ़िल्टर पटरियों विंडो 4.7 में वर्णित है. (जे) संपादित 4.7.1 में वर्णित खिड़की पटरियों. 4.7.2 में वर्णित (कश्मीर) सहेजें डेटा स्क्रीन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 1 .

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Discussion

यहाँ हम वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत CCPS के स्तर पर क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई) कल्पना करने के लिए TIRFM के उपयोग का वर्णन. सीएमई कई स्थानिक और अस्थायी अलग व्यक्तिगत घटनाओं का संचयी प्रभाव से मध्यस्थता एक तेजी से और अत्यधिक गतिशील घटना है. ऐसे internalization की जैव रासायनिक माप के रूप में वर्तमान में उपयोग किया जाता है कि अधिकांश assays, सतह biotinylation या बाध्यकारी ligand, प्रवाह cytometry या भली भाँति प्रोटीन, या प्रोटीन की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्थानीयकरण की मात्रा को मापने तय कोशिकाओं assays का उपयोग, निश्चित समय बिंदुओं पर प्रोटीन स्थानीयकरण में कलाकारों की टुकड़ी परिवर्तन की निगरानी . इन मौजूदा तरीकों सीएमई के लिए जरूरी हैं, लेकिन सीएमई या अन्य गतिशील झिल्ली तस्करी प्रक्रियाओं के शारीरिक तराजू से मेल खाता है कि स्थानिक और लौकिक संकल्प की कमी है कि प्रोटीन की पहचान करने में बहुत उपयोगी किया गया है. हाल ही में सबूत CCPS उनके प्रोटीन संरचना और गतिशीलता 9-1 में heterogenous हैं कि पता चलता है के रूप में यह महत्वपूर्ण है,2, और सीएमई संभावना तेजी से एक स्थानिक असतत ढंग से नियंत्रित किया जाता है के रूप में. लाइव सेल TIRFM जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में, spatially अलग एकल CCPS के स्तर पर सीएमई का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है.

कोशिकाओं के अच्छे स्वास्थ्य और सीएमई के मापदंडों का गहन विश्लेषण: इस शक्तिशाली परख के सफल आवेदन दो महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर करता है. टैग प्रोटीन और phototoxicity कम से कम माइक्रोस्कोपी तकनीक के पूर्व, उचित अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण हैं. अभिव्यक्ति के स्तर मज़बूती से अनुमान लगाया जा सकता है के रूप में ब्याज की प्रोटीन stably व्यक्त सेल लाइनों, आदर्श होते हैं. हम एन टर्मिनल चिह्नित मिलान या Sph या तो टैग 21-25 के साथ रिसेप्टर्स को टैग करें. सख्ती से आवश्यक नहीं है, जबकि रिसेप्टर्स चुनिंदा प्रयोग के शुरू में प्लाज्मा झिल्ली पर पता लगाया जा सकता है, क्योंकि दोनों लेबलिंग सिस्टम सीएमई का TIRFM की सुविधा. वांछित अतिरिक्त endocytic घटक भी क्षणिक इन स्थिर सेल लाइनों में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. टीआरansfection प्रोटोकॉल यहाँ उल्लेख किया TIRFM का उपयोग इमेजिंग सीएमई के लिए अनुकूलित है. सबसे पहले, यह अभिव्यक्ति की भी और मध्यम स्तर के अनुरूप है. गरीब अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए उच्च शक्ति लेजर जरूरी और phototoxicity और photobleaching दोनों के लिए खतरा बढ़ जाता है. इस परख भली भाँति CCPS रूप puncta के लापता होने के रिकॉर्ड के बाद इसके अलावा, कम संकेतों और photobleaching विश्लेषण करने के लिए भी हानिकारक हैं. हम इन परिस्थितियों में, कुल अवधि और / या इमेजिंग की आवृत्ति कम हो, का सुझाव है कि. दूसरा, कोशिकाओं पर अभिकर्मक अभिकर्मकों की छोटी ऊष्मायन, अभिकर्मक और प्रयोग, और इमेजिंग से पहले coverslips को ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की ताजा बीतने के बीच अंतराल, सभी imaged कोशिकाओं इष्टतम स्वास्थ्य में हैं कि सुनिश्चित करते हैं. तीसरा, इस क्लैथ्रिन संरचनाओं के बहुमत CCPS, और क्लैथ्रिन या क्लैथ्रिन सजीले टुकड़े की नहीं फ्लैट चादरें हैं कि यह सुनिश्चित करता है. चौथा, इस प्रोटोकॉल शो किया गया है जो ट्रांसफ़ेक्ट सीएमई घटकों की अधिक अभिव्यक्ति, कम से कमn सीएमई गतिशीलता 20,26 को बदलने के लिए.

कम phototoxicity साथ इमेजिंग के लिए, यह इष्टतम संकल्प और अधिकतम संवेदनशीलता के लिए इमेजिंग प्रणाली का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. उद्देश्य और कैमरा डिटेक्टर आकार की बढ़ाई के तहत या oversampling और खाली बढ़ाई कम करने के लिए मिलान किया जाना चाहिए. एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (1.45 या ऊपर) TIRF उद्देश्य संभव अधिकतम प्रकाश इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम उच्च मात्रा दक्षता, कम जोखिम बार, और तेजी से readout गति के लिए एक इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज कपल्ड डिवाइस कैमरा के साथ छवियों को प्राप्त. इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए, वे सीओ 2 के स्वतंत्र बफर जो लेबोविट्ज़ मीडिया में imaged हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक पूरी तरह से बंद कक्ष में, 10% FBS के साथ पूरक है. TIRFM अत्यधिक संवेदनशील और यहां तक ​​कि कम से कम परिवेश प्रकाश पता लगा सकता है इस्तेमाल किया उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों है, क्योंकि यह मुक्त एक संलग्न इमेजिंग माहौल बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैठीक फोकल हवाई जहाज़ को बाधित कर सकते हैं कि बाहरी प्रकाश और कंपन से.

यह तापमान, दिन चढ़ाना के बाद पूर्ण जीवन काल और सीएमई का सबसे घटकों की गतिशीलता भारी, सेल प्रकार के आधार पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर बदलती हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है, और संस्कृति की स्थिति 7,10,14,17,20 में अन्य रूपों, 25,27. यह इस तकनीक, इस परख की एक स्पष्ट सीमा का उपयोग कर timescales और विभिन्न समूहों के बीच मनाया वितरण में भारी रूपों में परिलक्षित होता है. इसके अलावा, यह TIRFM में imaged सेल, के नीचे की सतह पर CCPS, ऊपर की सतह 23,25 से अलग ढंग से व्यवहार कि संभव है. सही रूप में एक ऊतक में बाह्य मैट्रिक्स घटकों से घिरा हुआ एक 'विशिष्ट' सेल का प्रतिनिधित्व करता है जो सतह के रूप में यह बहस का मुद्दा है, इस तकनीक के द्वारा देखा सीसीपी गतिशीलता की व्याख्या इस संभावित अंतर पर विचार करने की जरूरत है. परख की असली ताकत है, इसलिए, डी में परिवर्तनों की तुलना में निहित हैसमान संस्कृति शर्तों के तहत एक ही कोशिकाओं में CCPS के ynamics,, इस तरह के सक्रियण के जवाब में GPCRs के रूप में कार्गो अणुओं की क्लस्टरिंग सहित तीव्र जोड़तोड़, के बाद. इस तुलना जिससे सीसीपी व्यवहार में बदलाव को प्रेरित कर सकता है कि उपरोक्त सभी मापदंडों के लिए नियंत्रित करने, एक ही सेल में परिवर्तन को सामान्य बनाने के लिए अनुमति देता है.

पुस्तिका सत्यापन और Imaris छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग उद्देश्य मान्यता: हम आम तौर पर endocytic घटनाओं की अवधि का विश्लेषण करने के लिए, ऊपर वर्णित दोनों मैनुअल और स्वचालित विश्लेषण, रोजगार. यह एक उपयोगकर्ता भरोसा कर सकते हैं CCPS की संख्या से सीमित है के रूप में मैनुअल सत्यापन, श्रम और समय लेने वाला है, लेकिन यह यकीनन उपलब्ध सबसे सटीक तकनीक है. एक प्रशिक्षित मानव आंख आसानी से सेल आंदोलन के माध्यम से एक सीसीपी ट्रैक करने के लिए जारी है, और आकार या ध्यान, सही छोड़कर सजीले और दोषपूर्ण पिक्सल में परिवर्तन कर सकते हैं. यह भी पूरा ईव का संकेत सीसीपी में रूपात्मक परिवर्तन का पता लगाने कर सकते हैंके रूप में दिखाया एनटीएस, चित्रा 3B और 3C है. यह विश्लेषण इन बाधाओं के भीतर के रूप में संभव उद्देश्य रहता है कि, हालांकि, जरूरी है. यह सभी डेटा सेट भर में लगातार इस्तेमाल कर रहे हैं कि विशिष्ट मानदंडों की परिभाषा की आवश्यकता है. इसके अलावा, हम आम तौर पर स्थितियां छवियों का विश्लेषण व्यक्ति को अज्ञात रहना इतना है कि छवि के नाम तले कर रहे हैं, जहां एक डबल अंधा ढंग से छवियों का विश्लेषण. "स्पॉट" और "ट्रैक अवधि" का उपयोग कर स्वचालित पहचान, जैसे Imaris में एल्गोरिदम, एक उच्च नमूना संख्या पैदा करने, एक दी फिल्म में endocytic स्थलों में से अधिकांश का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अत्यधिक जटिल कस्टम बनाया एल्गोरिदम 3,14,23,26,27 सहित कई विकल्प, उत्पन्न किया जा रहा है जबकि नकली का पता लगाने से बचने के लिए सबसे बड़ी चिंता का विषय बनी हुई है, जबकि इन तरीकों की विश्वसनीयता सही endocytic घटनाओं का पता लगाने के लिए. उदाहरण के लिए, Imaris में, सेल आंदोलन सजीले टुकड़े, और से बाहर उज्ज्वल प्रमुख किनारों, बनानेयह पूरी तरह से धब्बे से बना जा रहा है के रूप में उज्ज्वल संरचनाओं का पता लगाने के लिए एक प्रवृत्ति के रूप में फोकस फ्रेम आसानी से, स्थान का पता लगाने एल्गोरिथ्म दूर फेंक कर सकते हैं. एक ट्रैक में जुड़े होने से इन स्थानों को रोकने के क्रम में, वे सब हटा दिया जाना चाहिए. जुड़े स्पॉट बाद में संपादित करें टैब पटरियों का उपयोग कर हटाया जा सकता है, जबकि इस तरह के सजीले टुकड़े के रूप में बड़े ढांचों में नहीं हैं कि एकल न्यायपालिका स्पॉट, टैब संपादित साथ स्पॉट हटाया जा सकता है. न्यायपालिका के धब्बे भी कस्टम फिल्टर के साथ हटाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, चित्रा 3 डी सीसीपी पता लगाने में सजीले टुकड़े सहित बचने को सीमित करने के लिए इस्तेमाल एक तीव्रता फिल्टर से पता चलता है. गुणवत्ता फिल्टर गलत धब्बे हटाने के लिए एक और बहुत उपयोगी फिल्टर है. "गुणवत्ता" चमक के एक संचयी माप है और मौके त्रिज्या 20 की लंबाई के ¾ से हाजिर और गाऊसी छानने के प्रतिदीप्ति तीव्रता लेने के द्वारा पाया आकार. गुणवत्ता वक्र चयनित फिल्टर के नीचे पाया जाता है. यह पता लगाया धब्बे की संख्या (वाई) को दर्शाया गया हैगुणवत्ता एक निश्चित मूल्य है जब (x). गुणवत्ता कम, अधिक स्थानों का पता चला. गुणवत्ता फिल्टर भी कम है, तो गुणवत्ता फिल्टर बहुत अधिक है इसके विपरीत, यदि, सिर्फ छात्रों के धब्बे का पता लगाया जाएगा, नहीं दिखाई प्रतिदीप्ति है, जहां स्पॉट का पता लगाया जाएगा. अधिक से अधिक मूल्यों (एक्स) की ओर वक्र साथ पालन करें; पता चला स्पॉट की संख्या (वाई) आम तौर पर नाटकीय ढंग से छोड़ देंगे. इस बात के लिए नीचे दहलीज पर ले जाएँ. यह नीचे दहलीज स्थान के लिए न्यूनतम बिंदु है. TIRF क्षेत्र में झूठी स्पॉट करने के लिए अन्य प्रमुख योगदानकर्ताओं सेल की परिधि में ले जाएँ और TIRF क्षेत्र में प्रवेश कि endosomes हैं. इन को हटाने के लिए एक मजबूत कसौटी समय के साथ स्पॉट के विस्थापन यानी, स्पॉट की गतिशीलता है. Endosomes तेजी ब्राउनियन या निर्देशित आंदोलन प्रदर्शन करते हुए CCPS, जब तक पूरे सेल के आंदोलन के हिस्से के रूप में बहुत कम चलते हैं. नए एल्गोरिदम, काफी सुधार हुआ है, जबकि अभी भी परिष्कृत और 3,14,23,26,27 अनुकूलित किया जा रहा है. इन मुलाकात के रूप मेंविभागाध्यक्षों स्वयं प्रत्येक बिंदु पर उन्हें सत्यापित करने के लिए बिना, हम, स्पॉट के सैकड़ों या हजारों का विश्लेषण कर सकते हैं और अधिक परिष्कृत और विश्वसनीय हो. वर्तमान में, हालांकि, हम इन दो विश्लेषण सटीकता के लिए एक दूसरे के पूरक के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सुझाव देते हैं.

हम वर्णन किया है प्रोटोकॉल आसानी से कार्गो endocytosis के बारे में कई सवालों के जवाब देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह सीएमई घटकों के साथ cargos के सरल सह स्थानीयकरण प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया, और कारण विशेष उत्तेजनाओं को endocytic मशीनरी के विशिष्ट घटकों पर परिवर्तन को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परख भी आसानी से इस तरह के कार्गो और कोट घटकों के असतत सांद्रता चलता है कि caveolae 28, के रूप में, किसी भी endocytic प्रक्रिया के लिए अनुकूलित, और विशेष प्रकार की कोशिकाओं में इन मौलिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है. जीनोम संपादन 20,29,30 और मुख्यधारा बन जाता है के रूप में भविष्य में, हम यह घटक टैगिंग के लिए पसंदीदा तरीका बन जाएगा आशा करते हैं कि, और गतिशीलता और व्यवहार हे किच विभिन्न घटकों आगे परिष्कृत किया जाएगा. सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ काफी हद तक जीन, प्रोटीन संशोधनों, और interactomes की पहचान के द्वारा संचालित किया गया है कि ध्यान में रखते हुए, हम यहाँ वर्णित परख अर्थात जांच के अगले सीमाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है. इन प्रक्रियाओं और तंत्र के spatiotemporal गतिशीलता की परिभाषा.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate Fisher Scientific  SH3024301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco, by Life Technologies 21600-010
EDTA Free Acid Amresco 0322-500G
Fetal Bovine Serum Gibco, by Life Technologies 10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco, by Life Technologies 21083-027
Opti-MEM Gibco, by Life Technologies
HEPES CellPURE by Fisher Scientific BP2937-100
Effectene Qiagen 301425 Transfection reagent
25 mm coverglass Fisher Scientific 12-545-86
Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 Fisher Scientific 10-126-28
Cell culture 6-well plate Greiner Bio-One, by VWR 82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1 Sigma Aldrich F3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) Sigma Aldrich E7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Life Technologies A20173
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Image analysis software BitPLane http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters Nikon
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti Nikon For adjusting angle of incidence
iXon+ EMCCD camera and adapters Andor

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References

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