TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Biology

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Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51805, doi:10.3791/51805 (2014).

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Abstract

Introduction

clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)의 과정은 소체 1-3에화물을 수집하고 세포막을 조작 clathrin-매개 된 세포 내 이입 기계의 다양한 컴포넌트뿐만 도착 타이밍에 의존한다. CME는 엔도 시토 시스 1의 초기 사이트에서 함께 와서 막 변형 및화물 어댑터 단백질에 의해 시작된다. 이러한 단백질은 clathrin 코팅 피트 (CCP) (4)을 형성 새장 형 구조로 어셈블 외피 단백질 clathrin를 모집. CCP가 완전히 주로 큰 GTPase, dynamin의 작용을 통해 구형, 막 분열로 조립되면, 무료 clathrin 코팅 소포 (CCVS) 5,6를 생성합니다. 이러한 내재화는 구성 요소의 여러 CME 라운드 동안 재사용 될 수 있도록 clathrin 코트의 신속한 분해를 트리거한다.

CME에 관여하는 단백질의 발견 및 특성화는 전통적인 생화학 뿌리되었습니다emical, 유전 및 현미경 기술 4-6,8. 이러한 분석법은 이러한 세포 내 이입 컴포넌트 역할과 상호 작용 지점을 해명 하였다. 인신 매매 기계의 필수 구성 요소를 정의하기위한 매우 유용하지만, 이러한 분석은 매우 CME 구성 요소 나화물 농도의 동적 동작을 캡처 제한됩니다. CME 정의 단계에서 단백질의 모듈 세트의 안무 조립체에 의해 구동되기 때문에 이것은 중요한 제한이 있으며, 개개의 세포 내 이입 이벤트 역학의 작은 변화는 세포 내 이입에 큰 누적 결과를 초래할 수 있기 때문이다. 또한, 최근의 데이터는 개별 CCPS이 과정의 생리적 조절이 높은 공간과 시간적으로 9-14 제약을 시사 조성과 행동 모두 다를 수 있음을 나타냅니다. 각각의 세포 내 이입 이벤트를 시각화 따라서, CME에 관련된 여러 중복 단백질과 방법이 단백질을 제어 할 수 있습니다 B가 이유를 이해하는 것이 필수적입니다Y 생리 학적 신호는화물 국제화를 조절합니다.

여기에서 우리는 살아있는 세포의 개별 CCPS의 역학의 수준에서 CME를 관찰하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)의 사용을 설명합니다. TIRFM는 유리 커버 슬립 셀 (15, 16)의 유체 환경 사이의 굴절율의 차이에 의존한다. 여기 광이 임계각 이상에서 세포쪽으로 이동 될 때, 내부적으로는 커버 슬립 위에 약 100 nm의 연장 조명 얇은 필드를 유지 소멸 파를 생성 반사된다. 이것은이 좁은 필드 내에서만 형광 분자가 흥분 보장합니다. 실제적으로, 이것은 나 세포막 근처 형광 물질의 여기를 허용하고, 셀의 내부 부분으로부터 형광을 최소화한다. 이것은 세포막 공동에서 이벤트를 시각화하는 상당히 높은 신호 대 잡음비 및 z 축 해상도를 제공종래의 표면 형광 또는 공 초점 형광 현미경으로 더 일반적으로 사용되는 모드로 mpared. 우리는 또한 입문 실용 레벨에서 설명하는, 일반적으로 사용되는 이미지 분석 플랫폼의 사용을 분석하고 간단한 형태 학적 특징 및 개별화물 세포 내 이입 이벤트 역학을 정량한다.

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Protocol

찬란의 1 발현은 배양 된 세포에 CME 구성 요소 태그

HEK293 세포는 GPCR 생물학 및 세포 내 이입을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다, 따라서이 프로토콜의 모델로 사용되는 유용한 모델 세포입니다. 과발현과 낮은 세포 독성이없는 균일 한 표현을 제공하는 형질 전환 프로토콜을 사용합니다.

  1. 멸균 층류 후드에있는 모든 세포 배양을 처리합니다. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 둘 베코의 수정 된 필수 미디어 (DMEM)의 1 ㎖로 12 웰 플레이트의 4 우물을 입력합니다. HEK293 세포의 합류 T25 플라스크에서 4 각 웰에 각각 1시 50분 1:25 1:16 1:10 희석.
    1. 또한, 제조업체의 지침에 따라, 원하는 크기의 멀티 웰 플레이트에 세포를 씨앗. 12 웰 플레이트에 2 × 10 4 세포 - 0.4을 시드. 5 % CO 2 및 95 % 습도 멸균 37 ° C에서 하룻밤 세포를 성장.
      참고 :이 성장 R을 고려오버라이드 조건이 세포주에 따라 달라, 그 형질 이상적 포화 상태 다음날 또는 중복 형질를 행하는 가능성을 보장하기 위해 다수의 웰을 시드하는 것이 바람직 할 수도있다.
  2. 다음 날 아침입니다 잘 ~ 형질에 대한 70 %의 합류 (그림 1B 참조)을 선택합니다. 우물이 상태에 도달하지 않은 경우, 다른 일을 기다립니다.
    주 : 70 % 자랄는 HEK293 세포에 이상적입니다. 세포의 죽음과 독성이 더 드문 드문 결과 아르 세포를 형질. 가난한 식의 오버 합류 세포 결과를 형질.
  3. 제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 (형질 전환 키트) EC 버퍼 60 μl를 추가, 인코딩 플라스미드의 400 ng에서는 GPCR에 및 / 또는 clathrin 기계의 구성 요소 및 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 증강의 2.4 μl를 태그. 2 초 동안 소용돌이 충분한 혼합을 확인하고 하단에있는 액체를 수집하는 2 초 동안 2,000 XG에 미세 원심에서 회전합니다.
  4. 추가제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 6 μL Effectene. 미세 원심에서 2 초 동안 2,000 XG에 2 초 동안 소용돌이, 스핀은 바닥에 액체를 수집합니다. 형질 전환 복합체 미셀의 형성을 할 수 있도록 20 분 동안 기다립니다.
  5. 우물에서 대기음 매체는 형질합니다. 조심스럽게 미셀을 깨는 줄이기 위해 아래로 천천히 형질 전환 시약 혼합물에 10 % FBS와 DMEM의 0.8 mL를 넣고 피펫 팅에 의해 혼합. 측면에서 매우 느리게 우물에 미디어와 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 잘 micropipettor를 사용하는 microcentrifuge 관에 남아있는 형질 전환 혼합물을 추가합니다.
    NOTE : 선택적으로, 세포를 형질 완만보기 및 하부 일시적 발현으로 인한 추가적인 영양분을주고 형질 웰에 10 % FBS DMEM으로의 추가 0.5 ㎖에 추가한다.
  6. 5 시간 동안 37 ° C의 배양기에 세포를 반환합니다.
  7. 형질 전환 혼합물을 함유 대기음 매체. 10 % FBS와 DMEM 1 ㎖로 교체하십시오. 허용세포는 하룻밤 성장.
  8. 다음 날, 이전에 고압 증기 멸균 소독 코팅 된 커버에 세포를 전달합니다.
    1. 각 웰에 1 mM의 EDTA와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 0.5 ML을 추가합니다. 또한, 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 0.5 ML을 사용합니다. 1 분 동안 인큐베이터에 둡니다.
    2. 3 라운드, 6 웰 플레이트의 별도의 우물에 멸균 25mm의 커버 슬립을 놓습니다. 미디어 2 ㎖와 잘 각을 입력합니다. 부드럽게 커버 슬립의 바닥으로부터 세포 성장을 방지하기 위해 잘의 아래쪽으로 밀어 커버 슬립.
    3. 수동으로 우물의 바닥에서 세포를 들어 올릴 때는 잘 교반. 10 % FBS와 DMEM의 1 ㎖를 재현 탁에 추가. 3 커버 슬립 사이에서 균등하게 12 웰 플레이트의 한 우물에서 해제 세포를 배포합니다. 또한, 3 바닥이 유리 접시에 세포를 접시.
  9. 세포 이미징 전에 최소 48 시간 동안 커버 슬립에 성장 할 수 있습니다. 세포가 퍼져 플랫되어 있는지 확인합니다.

2.이미지 CCP 및화물 역학 사용 TIRFM

  1. 제조의 프로토콜에 따라 알렉사 플 루어 단백질 라벨링 키트를 사용하여 알렉사 염료 복합체 M1 항-FLAG 항체. 또한, 사전에 복합 항체를 구입 할 수있다.
  2. (영상 37 ° C에서 10 분 동안 50 mM의 HEPES pH를 7.4와 10 % FBS와 10 % FBS, 또는 옵티-MEM과 미리 예열 Leibovitz 매체의 1 ㎖에 1,000 희석 : 1의 항체와 세포를 미리 배양 중), 세포 표면에 FLAG-태그 GPCR에 레이블을. 같은 GFP와 같은 유전자 인코딩 형광 단백질, 태그로 사용하는 경우 (자세한 내용은 설명을 참조)이 단계를 건너 뜁니다.
  3. 라이브 세포 이미징 챔버에 커버 슬립을 전송합니다. 또한, 유리 바닥 요리, 흡인 항체 - 라벨 용지 예열 영상 매체의 700 μl를 추가합니다.
    1. 한 쌍의 집게를 사용하여 후크에 25 게이지 바늘의 선단을 구부리.
    2. 지배적 인 손에 집게의 쌍을 잡으십시오. OTH의 구부러진 바늘을 잡고어. 아래 유리를 향해 훅 곡선 때까지 바늘을 돌립니다. 이 커버 슬립에 후크 때까지 조심스럽게 6 웰 플레이트의 하단에 아래 바늘, 후크면을 드래그합니다. 이 세포를 분리하는 바와 같이, 커버 슬립의 표면을 손상하지 않도록주의하십시오. 조심스럽게 우물의 바닥에서 커버 슬립을 위로 들어 올립니다. 지원을위한 우물의 벽에 커버 슬립을 균형.
    3. 커버 슬립의 가장자리 근처 잡고 촬상 챔버 커버 슬립 셀 측에 이동하고, 챔버를 조립하는 집게를 사용한다. 예열 영상 매체의 700 μL (또는 적당량)를 추가합니다. 균열이나 파괴 방지하기 위해 압력없이 조심스럽게 커버 슬립을 처리합니다.
  4. 현미경에 챔버를 전송하고 무대 히터 나 밀폐 된 인큐베이터를 사용하여 37 ° C에서 세포의 온도를 유지한다.
  5. 100 배 또는 60 배 TIRF 오일 침지 목표 (이상 1.45 NA 또는)을 사용하여 초점에 세포를 가져와. 종래의 표면 형광 또는 사기꾼의 이미지 셀조명 (즉하지 TIRFM)의 초점 모드는 적절한 구조를 발현하는 세포의 동정을 행 하였다. 세포가 만드는 TIRF 조명의 얇은 심도에서 거의 보이지 초점이 흐려가 어렵다 초점면 세포를 찾을 수 있습니다.
    주 : 일부 시스템은 임계각 상기 레이저의 입사각을 이동시킴으로써, 종래의 표면 형광의 이미지를 TIRFM 동일한 레이저를 사용한다. 중요한 안전을 위해 항상 레이저 빔의 각도를 인식하고, 항상 멀리 관찰자를 직접.
  6. 세포 원형질막 주위의 윤곽이 사라지고 셀의 중심이 나타날 때까지 세포 발현의 저면까지 초점. 이는 μ-오피오이드 수용체 (도 2a 참조)으로 원형질막 지역화화물 단백질 가장 명백하다.
  7. TIRF 영상으로 전환합니다.
    1. 종래의 표면 형광 이미징을위한 동일한 레이저를 사용하는 경우, 입사각을 증가셀의 내부에 포커스 아웃 형광까지 레이저 사라지고 세포 원형질막 주위의 외곽선은 보이지 않는다. (그림 2A와 2B로도 2c 비교)
      주 : TIRFM에서, 초점면을 이동하는 포커스 및 / 또는 희미 밖으로 완전히 이동 이미지를 발생시키고 전반적인 형광 조명의 레벨보다 작은 깊이로 인해 감소한다. 따라서, 다른 방법은 TIRFM 조명으로 전환하는 것은 다음 원형질막까지 초점 다음 형광의 대부분을 상실 할 때까지의 입사각을 증가 시키며, 통상적 / 촛점 표면 형광의 셀의 중심에 제 초점이다.
    2. 일단 TIRFM에서, 여기 레이저는 목표를 다시 반영하고 객관적 위에 표시되지 않습니다 보장합니다. 레이저 스폿을 볼 경우 확인하여이를 확인합니다.
      주 : 종래의 표면 형광 또는 공 초점 모드에서, 레이저 조사는, 대물 위에 표시천정 등.
    3. 선명한 이미지를 얻을 수 초점을 수정. 세포 내 이입 기계의 주요 구성 요소는 같은 clathrin으로, 눈물 점에서 볼 수 있습니다. 미세에 초점을 조정 때문에 눈물 점은 가능한 원형과 같습니다.
      참고 : filopodia 구별 나타날 때까지 막 화 된화물의 경우, 미세 초점을 조정합니다.
    4. 이러한 거울과 TIRF 각도 모든 이미지 매개 변수를 저장하는 취득 프로그램을 사용하십시오. 필요한 모든 파장에 대해이 작업을 수행합니다.
  8. 원하는 모든 세포 내 이입 마커를 발현하는 세포를 찾기 위해 coverslip에 주위를 스캔 : μ-오피오이드 수용체와도 3a에 도시 된 예에서 어댑터 β-arrestin을. 표현하지만 과발현되지 않은 셀을 선택합니다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
  9. 세포가 확인되면 10 분 동안 이미지를 3 초마다 획득. 이러한 조건 하에서 묘화 HEK293 세포에서 CCP의 평균 수명이 ARO 때문에 이것은, CCP의 수명을 포착하기에 충분한싶게 40 초 10 ~ 11. 이 CCP를 관찰하는 약 12​​ ~ 14 프레임을 할 수 있습니다. 예를 들어 영화 하나를 참조하십시오. 이미지 추가 세포에 모든 단계를 반복합니다.

수동 검증에 의해 세포 내 이입 역학의 3 분석

CCP 수명 수동 검증 크게 검출 할 수 CCPS의 수에 의해 제한되지만, 여전히 이미지 검출 아티팩트 글로벌 변화에 의해 검출 물러나지의 정확한 수단에 남아있다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.

  1. ImageJ에있는 파일을 엽니 다. 이미지 인터리브 채널 TIFF 파일의 단일 스택으로 저장됩니다. hyperstacks에 이미지를 변환합니다. Hyperstacks> Hyperstack에 스택> 이미지로 이동합니다. (영상 β-arrestin 및 μ-오피오이드 수용체, 2를 입력하면 예) 획득 채널의 번호를 입력 (TIRFM이 하나의 평면입니다) Z 스택 1을 입력하고, 동영상의 프레임 수 (예 : 10 분 한 프레임마다 3 초 전에서 영화팝업 창에서의 200).
  2. hyperstack 형식은 두 스크롤 막대가있는 창을 산출한다. 시간을 통해 이동하는 채널과 바닥 사이를 이동 상단 막대를 사용하십시오. 수명 정량되는 단백질의 채널로 이동합니다.
  3. 전체 기간이 표시되지 않는 기존 CCPS의 포함을 줄이기 위해 10 또는 영화의 15 프레임으로 이동합니다. 무작위로 선택한 장소 주위에 ROI 상자를 그립니다.
  4. 스폿은 표시 프레임 수를 카운트.
    참고 : 세포 내 이입 이벤트 10,11,16-19의 세 가지 형태 학적 범주의 예는 그림 3B3C를 참조하십시오.

목표 인식으로 세포 내 이입 역학 (4) 분석

목표 인식은 셀의 이미지를 만들 CCPS의 거의 모든 검출을 허용하지만, 때문에 잘못된 구조의 가짜 검출에 오류가 발생하기 쉬운 수 있습니다. 장점과 전자의 단점을 무게 자세한 내용은 설명을 참조하십시오ACH 방법. 맞춤식 알고리즘 등 여러 프로그램은, 객관적 CCPS를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 Imaris, 이미지 분석 소프트웨어를 (자료 참조)를 사용 CCPS의 목적 인식에 대해 설명합니다.

  1. 시작하려면, 이미지 분석 소프트웨어에서 RAW 이미지 파일을 엽니 다. 기본적으로 병합 된 컬러 이미지가 나타납니다. 채널의 밝기를 조정합니다 "화면 조정"창을 사용합니다. 표시되는 색상을 변경하려면 채널의 이름을 클릭합니다. 그 표시를 방지하기 위해 채널 옆의 확인란의 선택을 취소합니다 (그림 4A 참조).
  2. 오렌지 반점이 아이콘을 클릭하여 "관광 명소"를 만듭니다. 그림 (b)를 참조하십시오. 세포의 주위에 관심 (ROI)의 지역을 선택합니다. 도 4c를 참조하십시오. 잘못 밝은 선도 가장자리와 플라크를 감지 영역을 제외 투자 수익 (ROI)을 사용합니다. 별도로 다른 발현 정도와 여러 셀을 분석합니다.
  3. 있습니다 provi하는 스폿의 직경을 측정알고리즘 드 초기 추정. "슬라이스"모드로 전환 한 직경을 측정하는 지점의 북극 끝을 클릭합니다. 그림 4E를 참조하십시오. 형성 후 분열하기 전에, 안정성의 높이에서 CCP를 나타내는 보면 4, 5 라운드 관광 명소에 대해이 작업을 수행합니다. 마이크론의 가장 가까운 열 번째까지의 평균 직경을 계산이 측정 값을 사용합니다.
  4. 관광 명​​소를 감지합니다. "능가"모드로 돌아갑니다. 검출을위한 적절한 채널을 선택합니다. 일반적으로 0.3 또는 0.4 μm의 평균 측정 된 직경을 입력합니다. 명소를 정량화하기 위해 파란색 앞으로 화살표를 클릭합니다. 그림 4E를 참조하십시오. 관광 명​​소의 직경이 과소 평가되는 경우, 형광 가짜 포인트 명소로 식별됩니다. 직경이 너무 크면, 진정한 스포트는 무시 될 것이다. 때 확실 조금 낮은 추정하고, 나중에 잘못된 탐지를 필터링 할 수 있습니다.
  5. 품질에 의해 명소를 필터링합니다. 다시 않고 가능한 많은 스포트를 캡처 필터를 조정지상. 품질 필터는 기본 (20)에 의해 선택된다. 그림 4 층을 참조하십시오.
    1. 적절한 임계 값을 설정하는 가이드로 "품질"곡선을 사용합니다. 곡선이 첫번째 딥에 마우스 왼쪽 버튼으로 필터의 하단 임계 값을 이동합니다. 이 위치는 일반적으로 만 볼 명소에 대한 검색을 정제 이것은 필터를위한 좋은 출발점이 될 것입니다. 그림 4 층을 참조하십시오.
    2. 감지 명소는 구 또는 중앙 픽셀과 영화에 나타납니다. "색상"탭을 사용하여, 쉽게 그들을 볼 수 있도록 대비되는 색으로 반점의 색상을 조정합니다. 각 프레임의 명소를 검토 할 동영상을 스크롤합니다. 목표는 자신의 수명 전체에 대해 가능한 한 많은 스포트를 검출하는 것이다.
    3. 디머 명소를 제거하거나 수동으로 그들이 일생의 과정을 통해 잘 검출되지 않기 때문에, 나중에 연속 트랙으로 연결합니다.
    4. "강도"FIL 밝은 플라크를 제거터, 필요한 경우. 새 필터를 추가하는 녹색 더하기 기호 (+)를 클릭합니다. 그림 4 층을 참조하십시오. 또는 주어진 형광 신호의 관광 명소 필터링 강도 필터를 만듭니다. 임계 값을 설정합니다 (4.5에서 논의 품질 곡선과 유사) 생성 된 강도 곡선을 사용합니다. 밝은 반점을 나타내는 곡선의 극단적 인 왼쪽 끝을 제거하려면 마우스 왼쪽 버튼을 사용합니다.
      주 : 큰 플라크 셀 구조에서 가장 밝은 요소 중에서 보통, 이들은 쉽게 필터를 제외한다.
    5. CCPS 관광 명소로 감지되지 않고 밝은 플라크가 더 이상 검출되는 것을 확인하기 위해 동영상을 스크롤합니다. 그림 3D는 CCPS의 검출 (흰색 범위로 표시) 셀 품질의 필터를 최적화하고, 플라크가 품질에서 제외 하였다를 보여줍니다 필터.
    6. 품질 필터 밝은 셀 가장자리를 줄입니다. 밝은 물체는 여전히 다음 단계에서, 수동으로 제거 할 필요가있다. 푸른 계속화살표입니다.
    7. 편집 명소 화면에서 탈선 명소를 제거합니다. 모드를 "선택"전환합니다. 그 자리에서 클릭합니다. 이 노란색으로 변합니다. "삭제"를 클릭합니다. 알고리즘을 구축 계속 파란색 화살표를 클릭합니다. 그림 4G를 참조하십시오.
  6. 측정 추적합니다. "브라운 운동은."CCP가 모든 지시 운동, 세포막에 걸쳐 최소한의 표류가 발생하지해야하는 트랙을 설정합니다. 이 알고리즘은 그 움직임에 가장 적합하다. 그림 4H를 참조하십시오.
    1. 0.7 μm의 같은 작은 값으로 최대 거리를 설정합니다. 그림 4H를 참조하십시오.
      참고 : 작은 거리를 설정하면 인접한 관광 명소의 연결을 최소화하고 여전히 CCP 또는 세포의 움직임을 통해 셀 지점을 지속적으로 추적 할 수 있습니다.
    2. 이 연속적으로 누락 된 하나의 프레임이있는 경우 계속 트랙을 수 있습니다 1에 최대 간격 크기를 설정합니다. 트랙을 계산하는 파란색 화살표를 클릭합니다. 그림 4H를 참조하십시오.
      참고 : G3 개 이상 원인 다른 트랙의 AP 크기가 잘못 함께 연결합니다.
    3. 에 보는 스위치 트랙 "드래곤 테일."스크롤 검출 품질을 관찰 영화를 통해. 인접한 관광 명소가 연결되는 경우, 0.7 μm의 아래에있는 최대 거리를 감소시킨다. 관광 명​​소가 너무 쉽게 헤어 졌되는 경우, 최대 간격 크기를 증가시킵니다. 트랙을 만들 수있는 파란색 화살표를 클릭합니다. 이것은 필터 트랙 화면으로 이끈다. 그림 4H를 참조하십시오.
  7. 필터 트랙과 데이터 내보내기. 추가 밝은 플라크를 제거하는 "강도"필터를 사용합니다. TIRF 필드를 입력 엔도 좀을 제거하는 "변위"필터를 사용합니다. 더 이상 관광 명소뿐만 아니라 더 이상 변위를해야합니다 있으므로주의하십시오. 프로토콜을 완료하기 위해 녹색 이중 화살표를 클릭합니다. 그림 4I를 참조하십시오.
    1. 필터에 의해 제거 할 수 없습니다 트랙의 오 탐지를 제거하려면 연필 아이콘 편집 트랙 탭을 사용합니다. discont를 확인inuities 또는 false 연결. 이 트랙을 연결하려면 다음 편집 트랙 상자에 "연결"을 클릭, Ctrl 키를 왼쪽 클릭 사용하여 선택합니다. 별도의 관광 명소로 트랙을 분리하려면 트랙을 선택하고 "연결 해제"를 누르십시오. 여러 명소를 선택하려면 Ctrl + 왼쪽 클릭하고 새로운 트랙을 만들 "연결"을 클릭합니다. 방법은, 4.5.7에 기재된 편집 스포트, 동일하다. 그림 4J를 참조하십시오.
    2. 데이터를 내보내려면 통계 탭으로 이동합니다. 선택한 통계를 내보낼 단일 플로피 디스크 아이콘을 클릭합니다. 모든 통계를 내보낼 플로피 디스크의 시리즈처럼 보이는 아이콘을 클릭합니다. "트랙 시간"통계는 세포 내 이입 트랙의 길이가 포함되어 있습니다. 그림 4K를 참조하십시오.

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Representative Results

사용 라이브 셀 TIRF 현미경 우리는 μ-오피오이드 수용체 (MOR)의 세포 내 이입 역학을 녹음 한, G-단백질 결합 수용체 (GPCR)와 세포 내 이입 어댑터 단백질 β-arrestin. β-arrestin 구조체는 일시적으로도 1에 설명 된 프로토콜을 사용하여 안정하게 발현하는 MOR 세포주에 형질 전환하고, 96 시간 후 묘화 하였다. 안정적인 세포주의 MOR은 N-말단의 pH에​​ 민감한 GFP 태그입니다. 이 형광 단백질은 중성 세포 외액에서 형광. 또한, MOR 번만 endocytoses 작용제에 의해 활성화하고, 그렇지 않으면 균일 원형질막을 가로 질러 분산 된 상태로 유지. 희미한 형광으로 채워진 셀에 공 초점 모드 결과에 커버 유리에 앉아 부착 세포막에 초점을 맞추고. 이것은 세포막 만 셀 주위 형광 링으로 볼 셀의 중심에 집중 다르다. 왼쪽 비교그림 2A에서 오른쪽 패널. 잘못된 각도로 기존의 표면 형광 또는 TIRF로 전환 그림 (b)에 나타낸 바와 같이, 동일한 세포에서 명백하기 위해 초점 형광에서 발생합니다. TIRF 각도가 정확하면 세포막이 매우 선명하고 맑고 밝은없고 초점 형광에서 더 이상 화상을 방해. 도 2a 및도 2b에 그림 2C 비교.

MOR은 크게 TIRF 필드 내에 부착 세포막에 있기 때문에 이미지가 명확하고 날카로운. 반면, β-arrestin 아직 세포 내 이입 눈물 점에 모집하지 않는 경우 세포질 풀에 남아, 그리고 그것을 TIRF 필드에 있지 않기 때문에 헷갈리는 초점이 나타납니다. MOR은 작용제에 의해 활성화되면, β-arrestin는 원형질막을 모집하고, 모두 β-arrestin 및 수용체 CCPS (도 3a영화를 1로 재분배된다 , 레드, 오버레이 녹색, MOR에서 β-arrestin)는 노란색입니다.

도 3b에 도시 된 바와 같이, 이러한 클러스터의 수명이 완료 엔도 시토 시스에 대한 세 개의 파라미터를 이용하여 수동으로 정량화 될 수있다. CCPS를 나타내는 점 (또한 그림 3C 참조), 및 해제 "깜박"또는 큰 구조 "를 꼬집어"완전히 사라질 수 있습니다. 후자의 두 가지 조건은 공간적으로 너무 가까이 함께하는 별도의 이벤트로 해결 될 이벤트를 나타냅니다. 그림 4에 설명 된대로 Imaris의 스팟 검출 알고리즘은, CCPS을 정량화하는 것이 유용하다. 그림 3D는 CCPS가 아닌 동적 인 플라크 구조를 제거하는 필터링 한 후, Imaris을 이용하여 검출이다. 겹쳐 흰색 범위에서 검출 지점을 나타낸다. 자신의 전체 수명 감지 할 수없는 주차 장소는 "품질"필터를 제외 하였다.

"> 그림 1
그림 1 : 형질 절차의 흐름도. (A) 먼저, 12 웰 플레이트에 희석 (1시 50분 1:25 1:16 1:10)의 다양한 시드. 세포가 하룻밤 성장하도록 허용합니다. 다음 날, 약 70 %의 합류, 그리고 도시 된 바와 같이 균일하게 분산 잘 찾습니다. 이 형질 전환됩니다 잘합니다. (B)는 microcentrifuge 관에 EC 버퍼의 60 μL와 DNA의 400 NG를 추가합니다. 10 초 동안 소용돌이 튜브의 바닥에 액체를 회전. 증강의 2.4 μl를 추가합니다. 2 초 동안 소용돌이 튜브의 바닥에 액체를 회전. 3 분 동안 실온에서 품어. Effectene의 6 μl를 추가합니다. 2 초 동안 소용돌이 튜브의 바닥에 액체를 회전. 20 분 동안 실온에서 배양한다. (C)를 ​​천천히 형질 감염과 함께 10 % FBS DMEM 0.8 ㎖에 혼합한다. 잘 선택 이전의 셀에 추가합니다. 37 ° C에서 5 시간 동안 세포를 품어. 신선한로 교체10 % FBS와 DMEM.

그림이
그림 2 : TIRFM 필드를 찾기. (A)에 촛점 묘화 원형질막. 왼쪽 패널은 셀의 중심을 중심으로 한 촛점 셀을 도시한다. 세포막은 세포 주위의 "링"으로 여겨진다. 기저 세포막 아래로 초점, 커버 슬립에 인접 셀이 희미한 형광으로 채워되도록합니다. 원형질막 "링"얇은 TIRF 필드에서 표시이어야한다. (B)를 통해 종래의 시료 표면 형광 조명 제조 얕게 TIRF 각도 기저 원형질막. 이것은 존재하는 셀의 위쪽에서 전체 셀 및 초점 형광 중 많은 조명. (C) TIRF에서 원형질막. filopodia에 집중하는 것은이 비행기를 찾는 데 도움이됩니다. 그것이 알부드러운 단일 평면입니다. 스케일 바는 10 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 시각화 및 TIRF의 세포 내 이입 이벤트를 정량화. (A) 전에 엔도 사이토 시스를 유도 작용 물질의 첨가 후 μ-오피오이드 수용체 (MOR) 및 β-arrestin을 표현하는 세포. 작용제는 세포 내 이입 눈물 점에 두 단백질의 재분배가 발생합니다. 스케일 바는 10 μm의입니다. (B) arrestin 역학, 앞에서 설명한 모폴로지와 일치를 시각화하여 볼 수 세포 내 이입 이벤트의 세 가지 유형. "안정", 빠르게 사라집니다 일 정상 신호. 이 CCP가 싹과 TIRF 필드 왼쪽되었음을 나타내는 주요 유형입니다. 깜박 신호를 "깜박임" 낮은 신호에와 때문에 같은 장소에서 두번째 CCP의 어셈블리에 같은 장소에서 다시 나타납니다. 이 CCPS 너무 가까이 서로 별개의 관광 명소로 해결 될 경우, 관상 돌기가 자리를 벗기, "핀치 오프", 하나는 endocytosed됩니다. 상자는 2 × 2 μm의입니다. (C) 단일 이벤트 해상도 MOR의 clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화. MOR 세포 내 이입 이벤트의 주요 분율을 나타내는 두 가지 예는 표시됩니다. 프레임은 3 초마다입니다. 상자가. 2 × 2 μm의입니다 Imaris를 사용하여 개별 세포 내 이입 이벤트 (D) 검출. 화이트 구체 관광 명소로 감지 CCPS을 나타낸다. 스팟 검출 "품질"필터를 사용하여 최적화 하였다. 일생의 전체 감지 할 수없는 주차 장소는 품질 필터를 제외 하였다. 발견되지 않은 것으로 표시됩니다 큰 플라크 구조는 "강도"필터를 사용하여 생략 하였다.ig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : Imaris를 사용하여 세포 내 이입 이벤트의 역학의 목적 인식. (A) 단계 4.1에 기재된 바와 같이 이미지의 디스플레이를 조정하는 데 사용되는 디스플레이 조절 창. (B) "스폿"알고리즘 빌더 열기. 빌더는 아래의 창에 표시됩니다. (C) 명소 알고리즘 빌더의 첫 번째 단계. 필요한 경우 "(시간 이상) 트랙 스포트."확인 ",이자의 세그먼트 만 지역"를 확인합니다. (D) 투자 수익 (ROI) 선택 화면. 자세한 내용은 4.2 단계를 참조하십시오. (E)를 측정 스폿의 직경을 정의하는 데 필요한 여러 개의 창. 패널 대표 : 나비를 사용하여 슬라이스 모드로 능가 전환측정 된 직경은 일반적으로 측정 된 직경을 입력 할 수있는 훨씬 오른쪽에 표시 지점의 북극 끝을 클릭 상단에 gation 바. 참조 단계 4.3-4.4. (F) 4.5-4.5.3에서 설명하는 자리 품질 필터. 4.5.7에 설명 (G) 편집 명소 창. (H) 측정 트랙과 트랙보기 창, 4.6에 설명. (I) 필터 트랙 창은 4.7에 설명. (J) 편집 4.7.1에 설명 창을 ​​추적합니다. 4.7.2에 설명 (K) 데이터 저장 화면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1 .

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Discussion

여기에서 우리는 실시간으로 살아있는 세포에서 개별 CCPS의 수준에서 clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)를 시각화하는 TIRFM의 사용을 설명합니다. CME는 많은 공간적으로 시간적으로 별도의 개별 이벤트의 누적 효과에 의해 매개 신속하고 매우 동적 인 이벤트입니다. 이러한 내재화의 생화학 적 측정과 같은 현재 사용되는 대부분의 분석법, 표면 바이오 티 닐화 또는 리간드 결합, 유동 세포 계측법 또는 내부화 단백질, 또는 단백질의 전자 현미경 지역화의 양을 측정 고정 세포 분석법을 사용하여, 고정 된 시점에서 단백질 지역화의 앙상블 변화를 모니터링 . 이러한 기존 방법은 CME 필요하지만 CME 혹은 다른 동적 막 거래 프로세스 생리 비늘 일치 공간 및 시간 해상도 부족 단백질을 확인하는데 매우 유용왔다. 최근의 증거는 CCPS가 단백질 구성 및 역학 9-1에서 이종 것을 알 수 있듯이이 중요하다2 및 CME 가능성 급속 공간적 이산 방식으로 조절된다. 생균 TIRFM은 살아있는 세포에서 실시간으로 공간적으로 분리 된 단일 CCPS의 수준 CME를 분석 할 수있는 능력을 제공한다.

세포의 건강과 CME의 매개 변수의 철저한 분석이 강력한 분석의 성공적인 응용 프로그램은 두 가지 주요 요인에 의존한다. 태그 단백질과 광독성을 최소화 현미경 기술의 이전, 적절한 표현은 중요하다. 발현 수준 신뢰성있게 추정 할 수있는 관심있는 단백질을 안정하게 발현하는 세포주가 이상적이다. 우리는 N-말단 플래그 에피토프 또는 SPH 중 태그를 21-25로 수용체를 태그. 꼭 필요한 것은 아니지만 수용체 선택적 실험의 시작에서 원형질막 검출 될 수 있기 때문에, 양쪽 표시 시스템은 CME의 TIRFM을 용이하게한다. 바람직한 추가 성분은 또한 세포 내 이입이 일시적으로 안정한 세포주로 형질 감염 될 수있다. TRansfection 프로토콜은 여기에 언급 TIRFM를 사용하여 영상 CME에 최적화되어 있습니다. 첫째, 표현의도 적당한 수준에 맞게 조정됩니다. 불쌍한 표정은 검색에 고출력 레이저를 필요로하고 광독성 및 광표백 모두 위험을 증가시킨다. 이 분석은 내면화 CCPS로 눈물 점의 실종을 기록 때문에, 낮은 신호 광표백는 분석도 불리하다. 우리는 이러한 상황에서, 총 재생 시간 및 / 또는 화상의 주파수가 감소 될 수 있음을 시사한다. 둘째, 세포에 형질 전환 시약의 짧은 배양, 형질 감염 및 실험 및 촬상 전에 커버 슬립으로 형질 감염된 세포의 신선한 통로 사이의 간격은, 모두 묘화 셀 최적 상태에 있는지 확인. 셋째,이 clathrin 구조의 대부분이 CCPS, 및 clathrin 또는 clathrin 플라크없는 평평한 시트되도록. 넷째,이 프로토콜은 쇼를하고있다 형질 CME 구성 요소의 과다 발현을 최소화N CME 역학 20,26을 변경합니다.

낮은 광독성과 촬상의 경우, 최적의 해상도 및 최대 감도 이미징 시스템을 최적화하는 것이 중요하다. 대물과 카메라 검출기 크기의 배율 부족 또는 오버 샘플링 및 빈 배율을 최소화하는 정합되어야한다. 높은 개구 수 (1.45 이상) TIRF의 목적은 가능한 최대 빛을 수집하는 데 사용되어야한다. 우리는 높은 양자 효율, 낮은 노출 시간, 빠른 판독 속도가 전자 승산 전하 결합 소자 카메라로 화상을 취득. 또한, 전지의 상태를 확인하기 위해, 그들은 독립적 인 CO 2 버퍼링 Leibovitz 매체에 묘화되고, 37 ° C로 설정 완전히 밀폐 된 챔버 내에서, 10 % FBS가 보충된다. TIRFM는 고감도에도 최소한의 주변 광을 감지 할 수있는 사용 높은 개구 목적이기 때문에, 무연 밀폐 촬상 환경을 생성하는 것이 중요미세 초점면을 방해 할 수 있습니다 외부 빛과 진동이.

그것은, 온도, 일 도금 후 절대 수명 및 CME의 대부분의 구성 요소의 역학은 크게, 세포 유형에 따라 단백질의 발현 정도가 다릅니다하는 것이 중요하고, 배양 조건 7,10,14,17,20 다른 변화, 25, 27. 이것은이 기술이 분석의 명확한 한계를 사용하여 시간 척도와 다른 그룹 사이에서 관찰 된 분포에 큰 변화에 반영됩니다. 또한, TIRFM에 이미징 셀의 저면에 CCPS는, 상면 (23, 25)에서 다르게 동작하는 것이 가능하다. 정확하게 조직에서 세포 외 기질 성분으로 둘러싸인 '전형적인'셀을 나타내는 어떤면으로는 논쟁의 여지가 있지만,이 기술을 볼 CCP 역학의 해석이 전위차를 고려해야합니다. 분석의 진정한 장점은, 따라서, D의 변화를 비교에 놓여동일한 배양 조건하에 동일한 세포에서의 ynamics CCPS, 이러한 활성화에 응답 등의 GPCR화물 분자의 클러스터를 포함하여 급성 조작 후에. 이 비교하여 CCP 행동의 변화를 유도 할 수있는 그 위에서 언급 한 모든 매개 변수를 통제, 동일한 셀에 대한 변경 사항의 정상화 할 수 있습니다.

수동 검증 및 Imaris 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 대물 인식 : 우리는 일반적으로 세포 내 이입 이벤트의 지속 시간을 분석하여, 상기 수동 및 자동화 된 분석을 사용한다. 그것은 사용자가 셀 수 CCPS의 수에 의해 제한 될 때 수동 검증은 노동 집약적 및 시간 집약적이지만, 그것은 틀림없이 가장 정확한 방법이다. 훈련 된 사람의 눈은 쉽게 세포의 움직임을 통해 CCP를 추적을 계속하고, 모양이나 초점, 정확하게 제외 플라크와 결함이있는 픽셀의 변화 할 수 있습니다. 또한 완료 이브를 나타내는 CCP의 형태 학적 변화를 감지 할 수 있습니다도시 된 바와 같이 NTS는,도 3b 및도 3c이다. 이것은 분석이 이러한 제약 조건 내 가능한 대물 남아 있다는 것은 필수적이다. 이 모든 데이터 세트에서 일관되게 사용되는 특정 기준의 정의가 필요합니다. 또한, 우리는 일반적으로 조건이 이미지를 분석하는 사람에게 알려지지 남아 있도록 이미지 이름이 스크램블되어 이중 맹검 방식으로, 이미지를 분석한다. "스폿"및 "트랙 재생 시간"을 사용하여 자동화 된 검출은, Imaris에서 알고리즘은, 높은 샘플 개수를 생성, 주어진 영화로 세포 내 이입 스폿의 대부분을 검출하는데 사용될 수있다. 매우 복잡한 맞춤형 알고리즘 3,14,23,26,27 등 많은 옵션이 생성되는 동안 가짜 탐지를 피하는 가장 큰 문제가 남아있는 동안, 이러한 방법의 신뢰성은 올바른 세포 내 이입 이벤트를 감지합니다. 예를 들어, Imaris에서, 세포 이동은 플라크 및 밖으로 밝은 리딩 에지​​를 만드는완전히 반점 이루어지는 것으로 밝은 구조물을 검출하는 경향이 있기 때문에 초점의 범위를 쉽게 스폿 검출 알고리즘을 던질 수있다. 선로로 접속되는 이러한 반점을 방지하기 위해, 그들은 모두 제거되어야한다. 연결 명소 나중에 편집 탭을 추적하여 제거 할 수 있지만 같은 플라크와 같은 대형 구조물에없는 단일 탈선 관광 명소는, 탭 편집과 명소 제거 할 수있다. 벗어난 스폿은 지정 필터로 제거 할 수있다. 예를 들어, 그림 3D는 CCP 검출에 플라크를 포함하지 마십시오을 제한하는 데 사용되는 강도 필터를 보여줍니다. 품질 필터는 잘못된 지점을 삭제하는 또 다른 매우 유용한 필터입니다. "품질"은 밝기의 누적 측정이며, 스폿 (20)의 반경 길이의 ¾ 의해 스폿과 가우시안 필터링의 형광 강도를 고려하여 볼 모양입니다. 품질 곡선은 선택한 필터 아래에 발견된다. 이것은 검출 된 스폿의 수 (y)를 도시품질이 일정 값 인 경우 (X). 품질이 낮을수록 관광 명소가 감지되었습니다. 품질 필터가 너무 낮 으면 품질 필터가 너무 높으면 반대로, 단지 밝은 스폿이 검출되고, 가시적 인 형광이없는 경우, 반점이 검출된다. 더 큰 값 (x)를 향해 곡선을 따라하십시오; 검출 된 스폿의 수 (y)는 일반적으로 급격히 떨어질 것이다. 이 시점에 바닥 임계 값을 이동합니다. 이것은 하부 임계치를 배치하는 극소 점이다. TIRF 필드에 잘못된 장소에 다른 주요 참여자는 셀의 주변으로 이동 TIRF 필드를 입력 엔도 좀 있습니다. 이들을 제거하기위한 강력한 기준은 시간이 지남에 따라 스폿의 변위, 즉, 스폿의 이동도이다. 엔도 좀 빠른 브라운 운동이나 지시를 발휘하면서 CCPS는 않는 전 세포의 이동의 일부로서 매우 조금 이동한다. 새로운 알고리즘은 크게 개선하면서, 여전히 세련되고 3,14,23,26,27을 최적화하고있다. 이러한 충족으로hods 수동으로 각 지점에서이를 확인하지 않고, 우리가, 관광 명소의 수백 또는 수천을 분석 할 수있는보다 정교하고 신뢰성이된다. 그러나 현재 우리는이 두 가지 분석은 정확성을 위해 서로를 보완하기 위해 함께 사용하는 것이 좋습니다.

우리가 기술 한 프로토콜은 쉽게화물 엔도 시토 시스에 대한 많은 질문에 대답을 적용 할 수 있습니다. 그것은 CME 컴포넌트와화물​​의 단순한 공동 현지화를 수행하기 위해 사용하고, 특정 자극에 의​​한 세포 내 이입 기계의 특정 구성 요소에 변화를 보여주기 위해 사용될 수있다. 분석은 또한 용이하게화물 및 코팅 성분의 농도를 보여 이산 caveolae 28과 같은 임의의 세포 내 이입 프로세스에 적합한, 특화된 세포 유형에서 이러한 기본적인 공정에 대한 연구 될 수있다. 게놈 편집 20,29,30 주류대로 미래에, 우리는 구성 요소에 태그를위한 바람직한 방법이 될 것이라고 예상하고, 역학과 행동 O 그F 다양한 구성 요소가 더 세련 될 것입니다. 세포 과정에 대한 우리의 이해가 크게 유전자, 단백질 수정 및 interactomes의 식별에 의해 주도 된 점을 감안하면, 우리는 여기에 설명 된 분석은 즉 문의,의 다음 국경 중 하나를 나타냅니다. 이러한 프로세스 및 메커니즘의 시공간 역학의 정의.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate Fisher Scientific  SH3024301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco, by Life Technologies 21600-010
EDTA Free Acid Amresco 0322-500G
Fetal Bovine Serum Gibco, by Life Technologies 10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco, by Life Technologies 21083-027
Opti-MEM Gibco, by Life Technologies
HEPES CellPURE by Fisher Scientific BP2937-100
Effectene Qiagen 301425 Transfection reagent
25 mm coverglass Fisher Scientific 12-545-86
Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 Fisher Scientific 10-126-28
Cell culture 6-well plate Greiner Bio-One, by VWR 82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1 Sigma Aldrich F3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) Sigma Aldrich E7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Life Technologies A20173
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Image analysis software BitPLane http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters Nikon
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti Nikon For adjusting angle of incidence
iXon+ EMCCD camera and adapters Andor

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References

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