Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51805, doi:10.3791/51805 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

El proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME) depende de la llegada oportuna de los muchos componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina para recoger y manipular la carga de la membrana plasmática en las vesículas 1-3. CME es iniciada por proteínas de deformación de la membrana y del adaptador de carga que se unen en sitios nacientes de endocitosis 1. Estas proteínas reclutan la proteína de la cubierta de clatrina, que se ensambla en una estructura en forma de jaula que forma la fosa revestidas de clatrina (CCP) 4. Una vez que el CCP está completamente montado en una forma esférica, la escisión de la membrana, principalmente a través de la acción de la gran GTPasa, dynamin, genera vesículas revestidas de clatrina libres (CCV) 5,6. Esta internalización desencadena un rápido desmontaje de la capa de clatrina, lo que permite a los componentes ser reutilizados para múltiples rondas de CME.

El descubrimiento y caracterización de las proteínas implicadas en CME se ha basado en Bioch tradicional, y las técnicas de microscopía genéticos emical 4-6,8. Estos ensayos han aclarado las funciones y puntos de interacción de estos componentes endocítica. Aunque muy útil para definir los componentes esenciales de la maquinaria de tráfico, estos ensayos son muy limitados en capturar el comportamiento dinámico de los componentes de CME o concentración de carga. Esta es una limitación crítica, ya que CME es impulsada por el conjunto coreografiado de conjuntos de módulos de la proteína en pasos definidos, y puesto que los pequeños cambios en la dinámica de los acontecimientos endocíticas individuales puede tener grandes consecuencias acumulativas sobre la endocitosis. Además, datos recientes indican que los PCC individuales pueden diferir tanto en la composición como en el comportamiento, lo que sugiere que la regulación fisiológica de este proceso es altamente espacial y temporalmente limitado 9-14. Visualización de eventos endocíticas individuales, por lo tanto, es esencial para entender por qué hay múltiples proteínas redundantes involucrados en CME y b cómo podrían controlarse estas proteínasseñales fisiológicas Y para regular la internalización de carga.

Aquí se describe el uso de Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) para observar CME en el nivel de la dinámica de los PCC individuales en las células vivas. TIRFM se basa en la diferencia en el índice de refracción entre el cubreobjetos de vidrio y el entorno fluido de células 15,16. Cuando la luz de excitación se dirige hacia las células en más que el ángulo crítico, se refleja internamente, creando una onda evanescente que mantiene un campo delgada de iluminación que se extiende aproximadamente 100 nm por encima del cubreobjetos. Esto garantiza que sólo las moléculas fluorescentes dentro de este estrecho campo están entusiasmados. Prácticamente, esto permite la excitación de las moléculas fluorescentes en o cerca de la membrana plasmática, y minimiza la fluorescencia de las partes interiores de la célula. Esto proporciona una relación señal-ruido y eje z significativamente mayor resolución para visualizar los eventos en la membrana plasmática, COmpared a los modos más comúnmente usados ​​tales como epifluorescencia convencional o microscopía de fluorescencia confocal. También describimos, en una introducción y nivel práctico, el uso de una plataforma de análisis de imagen comúnmente utilizado para analizar y cuantificar características y dinámica de los acontecimientos endocítica de carga individuales morfológicos simples.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Expresión de marcado con fluorescencia CME Componentes en células cultivadas

HEK293 células son células modelo de utilidad que se han utilizado ampliamente para estudiar la biología GPCR y la endocitosis, y por lo tanto se utilizan como modelos en este protocolo. Usar cualquier protocolo de transfección proporcionar expresión uniforme sin sobreexpresión y baja citotoxicidad.

  1. Manejar todo el cultivo de células en una campana de flujo laminar estéril. Llenar 4 pocillos de una placa de 12 pocillos con 1 ml de medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS). Desde un matraz T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectivamente, en cada uno de los 4 pocillos.
    1. Alternativamente, sembrar las células a una placa de múltiples pocillos de tamaño deseado, según las instrucciones del fabricante. Semillas 0,4-2 x 10 4 células en una placa de 12 pocillos. Cultivar las células durante la noche en un recipiente estéril 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad.
      NOTA: Teniendo en cuenta que el crecimiento rates varían dependiendo de las condiciones y líneas celulares, que podría ser preferible sembrar múltiples pozos para garantizar confluencia ideal para la transfección el día siguiente o la posibilidad de realizar transfecciones por duplicado.
  2. A la mañana siguiente, seleccionar un pozo que es de ~ 70% de confluencia para la transfección (véase la Figura 1B). Si no hay ningún pozo ha alcanzado este estado, esperar un día más.
    NOTA: el 70% de confluencia es ideal para las células HEK293. La transfección de células que son resultados más escasos en la muerte celular y la toxicidad. Transfección de células resultados sobre-confluentes en mala expresión.
  3. Añadir 60 l de tampón CE (del kit de transfección), 400 ng de plásmidos que codifican GPCR marcado y / o componentes de la maquinaria de clatrina, y 2,4 l de potenciadora en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como se describe en el protocolo del fabricante. Vortex durante 2 segundos para asegurar una mezcla suficiente, y girar en una microcentrífuga a 2.000 xg durante 2 segundos para recoger el líquido en la parte inferior.
  4. Añadir6 l Effectene como se describe en el protocolo del fabricante. Vortex durante 2 segundos, y giran a 2.000 xg durante 2 segundos en una microcentrífuga para recoger el líquido en la parte inferior. Espere 20 min para permitir la formación de micelas de complejos de transfección.
  5. Aspirar los medios de comunicación desde el pozo a ser transfectados. Añadir con cuidado 0,8 ml de DMEM con FBS al 10% a la mezcla de reactivo de transfección y mezclar pipeteando arriba y abajo lentamente para reducir romper las micelas. Añadir los medios de comunicación y a la mezcla de transfección bien muy lentamente desde el lado. Añadir cualquier mezcla de transfección restante del tubo de microcentrífuga al pozo utilizando una micropipeta.
    NOTA: Opcionalmente, añadir un extra de 0,5 ml de DMEM con 10% de FBS al pozo transfectadas las células para dar alimento adicional que resulta en más suave de la transfección y expresión transitoria inferior.
  6. Volver a las células a los 37 ° C incubadora durante 5 horas.
  7. Aspirar los medios de comunicación que contienen la mezcla de transfección. Reemplazar con 1 ml de DMEM con 10% de SFB. Permitirque las células crezcan durante la noche.
  8. El día siguiente, pasar las células a cubreobjetos sin revestir, previamente esterilizados en autoclave.
    1. Añadir 0,5 ml de tampón fosfato salino (PBS) con EDTA 1 mM a cada pocillo. Como alternativa, utilice 0.5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Deja en la incubadora durante 1 min.
    2. Coloque la 3 ronda, estériles cubreobjetos de 25 mm en pocillos separados de una placa de 6 pocillos. Llene cada pocillo con 2 ml de los medios de comunicación. Empuje suavemente el cubreobjetos hasta el fondo del pozo para evitar que las células crezcan en la parte inferior del cubreobjetos.
    3. Agitar manualmente el bien para despegar las células de la parte inferior del pozo. Añadir 1 ml de DMEM con 10% de SFB para volver a suspender. Distribuir las células despegadas de 1 pocillo de una placa de 12 pocillos de manera uniforme entre los 3 cubreobjetos. Alternativamente, la placa células en 3 platos con fondo de cristal.
  9. Permitir que las células que crecen en los cubreobjetos durante al menos 48 horas antes de formación de imágenes. Asegúrese de que las células se separan hacia fuera y plana.

2.Imaging CCP y Dinámica de Carga Utilizando TIRFM

  1. Conjugado M1 anticuerpos anti-FLAG con tintes Alexa utilizando kit de etiquetado de proteínas Alexa Fluor acuerdo con el protocolo del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos pre-conjugados pueden ser comprados.
  2. Pre-incubar las células con los anticuerpos en una dilución 1: 1000 en 1 ml de medio de pre-calentado Leibovitz con FBS al 10%, o Opti-MEM con 50 mM HEPES pH 7,4 y 10% de FBS durante 10 min a 37 ° C (formación de imágenes medio), para etiquetar los GPCR marcado con FLAG en la superficie celular. Saltar estos pasos si las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, tales como las buenas prácticas agrarias, se utilizan como etiquetas (véase la discusión para más detalles).
  3. Transferir el portaobjetos a una cámara de imágenes de células vivas. Alternativamente, para los platos de fondo de cristal, aspirado medios anticuerpo etiquetado y añadir 700 l de medio de imágenes pre-calentado.
    1. Use un par de pinzas y doblar la punta de una aguja de calibre 25 en forma de gancho.
    2. Mantenga un par de pinzas en la mano dominante. Sostenga la aguja doblada en el other. Gire la aguja hasta las curvas de gancho hacia abajo hacia el cristal. Arrastrar suavemente el, lado del gancho de la aguja hacia abajo, a través de la parte inferior de una placa de 6 pocillos hasta que se engancha en el cubreobjetos. Tenga cuidado de no rayar la superficie del cubreobjetos, ya que separar las células. Levante suavemente el cubreobjetos desde el fondo del pozo. Equilibrar el cubreobjetos contra la pared del pozo para el apoyo.
    3. Utilice las pinzas para agarrar cerca del borde del cubreobjetos y mover el lado de células cubreobjetos hasta la cámara de formación de imágenes, y montar la cámara. Añadir 700 l (o la cantidad que proceda) del medio de imágenes pre-calentado. Maneje los cubreobjetos con cuidado, sin presión para evitar que se agriete o se rompa.
  4. Transferencia de la cámara en el microscopio y mantener la temperatura de las células a 37 ° C usando un calentador de etapa o una incubadora cerrada.
  5. Traiga células en foco utilizando un objetivo de inmersión 100X o 60X TIRF (1,45 NA o superior). Imagen de las células en epifluorescencia convencional o en contrafocales de los modos de iluminación (es decir, no TIRFM) para identificar células que expresan los constructos apropiados. Fuera de foco células son casi invisibles en la profundidad delgada de iluminación TIRF por lo que es difícil encontrar el plano focal y las células.
    NOTA: Algunos sistemas utilizan los mismos láseres para TIRFM a la imagen en epifluorescencia convencional, moviendo el ángulo de incidencia del láser por encima del ángulo crítico. Como una medida de seguridad importante, siempre tener en cuenta el ángulo del haz de láser, y siempre dirigirlo lejos del observador.
  6. Enfoque hacia abajo a la superficie inferior de una célula que expresa hasta que el contorno de la membrana de plasma alrededor de la célula desaparece y el centro de la célula aparece. Esto es más evidente con una proteína de carga localizada membrana plasmática tal como el receptor μ-opioide (véase la Figura 2A).
  7. Cambie a imágenes TIRF.
    1. Si el uso de los mismos láseres para formación de imágenes en epifluorescencia convencional, aumentar el ángulo de incidencia de laláser hasta que la fluorescencia fuera de foco en el interior de la célula desaparece, y sin contorno de la membrana de plasma alrededor de la celda se ve. (Comparar la Figura 2C a las figuras 2A y 2B)
      NOTA: En TIRFM, moviendo el plano focal hace que la imagen para ir completamente fuera de foco y / o tenue, y los niveles generales de fluorescencia disminuye debido a la menor profundidad de la iluminación. Por lo tanto, un método alternativo para cambiar a la iluminación TIRFM es primero enfoque en el centro de la célula en epifluorescencia confocal / convencional, a continuación, aumentar el ángulo de incidencia hasta que pierde la mayor parte de la fluorescencia y, a continuación, hacia abajo para centrar la membrana plasmática.
    2. Una vez en TIRFM, asegurar el láser de excitación refleja de vuelta a través del objetivo y no es visible por encima del objetivo. Confirme esto comprobando si el punto láser es visible.
      NOTA: En los modos de epifluorescencia o confocal convencionales, la iluminación láser es visible por encima del objetivo,tales como en el techo.
    3. Refine el enfoque para obtener una imagen nítida. Los principales componentes de la maquinaria endocítica, como clatrina, serán visibles en puntos lagrimales. Ajuste el enfoque de bien, así que los puntos lagrimales son tan redondos como sea posible.
      NOTA: Para la carga localizada en la membrana, ajustar el enfoque fino hasta que el filopodios parece distinta.
    4. Utilice un programa de adquisición para guardar todos los parámetros de imagen, como espejos y ángulo TIRF. Haga esto para todas las longitudes de onda necesarias.
  8. Analiza alrededor del cubreobjetos para encontrar células que expresan todos los marcadores endocítica deseados: el receptor μ-opioide y el adaptador de β-arrestina en el ejemplo mostrado en la Figura 3A. Seleccionar las células que están expresando, pero no sobre-expresan. Véase la discusión para más detalles.
  9. Una vez que se identifican las células, adquirir imágenes cada 3 s durante 10 min. Esto es suficiente para capturar el tiempo de vida de un PCC, ya que la vida media de un PCC en HEK293 células fotografiados en estas condiciones es around 40 seg 10-11. Esto permite a unos 12-14 frames para observar el PCCh. Por ejemplo ver películas 1. Repite todos los pasos para células adicionales de imagen.

3. Análisis de Endocítica Dinámica de Verificación Manual

Aunque la verificación manual de los tiempos de vida del PCCh se limita en gran medida por el número de entidades de contrapartida central que pueden ser detectados, todavía sigue siendo un medio preciso para la detección sin inmutarse por los cambios globales en los artefactos de imagen y detección. Véase la discusión para más detalles.

  1. Abra el archivo en ImageJ. Las imágenes se almacenan en una única pila de archivos TIFF con canales intercalados. Convertir imágenes a hyperstacks. Ir a Imagen> Hyperstacks> Stack para HyperStack. Introduce el número de canales adquiridos (es decir, si por imágenes β-arrestina y el receptor μ-opioide, entran 2), introduzca 1 para Z pila (TIRFM es un solo plano), y el número de fotogramas de la película (es decir, a 10 min película en 1 fotograma cada i 3 segs 200) en la ventana emergente.
  2. El formato HyperStack produce una ventana con dos barras de desplazamiento. Utilice la barra superior para moverse a través de los canales y la parte inferior para desplazarse a través del tiempo. Desplácese hasta el canal de la proteína cuya vida útil se ensaya.
  3. Mueva al bastidor 10 o 15 de la película para reducir la inclusión de entidades de contrapartida central preexistentes cuyas duraciones entero no son visibles. Dibuja un cuadro de región en torno a un punto elegido al azar.
  4. Cuente el número de fotogramas de una mancha es visible.
    NOTA: Consulte la Figura 3B y 3C para ejemplos de tres categorías morfológicas de eventos endocíticas 10,11,16-19.

4. Análisis de Endocítica Dinámica de Reconocimiento Objetivo

Reconocimiento objetivo permite la detección de prácticamente todos los PCC fotografiados en una célula, pero puede ser propenso a error debido a la detección falsa de las estructuras erróneas. Véase la discusión para más detalles sopesar las ventajas y desventajas de correométodo ach. Varios programas, incluyendo los algoritmos a medida, se pueden usar para detectar objetivamente los PCC. Este protocolo describe reconocimiento objetivo de los PCC mediante Imaris, un software de análisis de imágenes (ver Materiales).

  1. Para empezar, abra el archivo de imagen RAW en el software de análisis de imágenes. Por defecto, aparece una imagen en color resultante de la fusión. Utilice la ventana "Ajuste de pantalla" para ajustar el brillo de un canal. Haga clic en el nombre de un canal para cambiar el color que se muestra. Desmarque la casilla situada junto al canal para evitar que su indicador (Figura 4A).
  2. Crear "puntos" haciendo clic en el icono con manchas anaranjadas. Véase la Figura 4B. Seleccione una región de interés (ROI) alrededor de la célula. Véase la Figura 4C. Utilice un retorno de la inversión para excluir áreas que detectarán incorrectamente bordes delanteros brillantes y placas. Analizar múltiples células con diferentes niveles de expresión por separado.
  3. Mida el diámetro de un punto a equipamientDe las estimaciones iniciales para el algoritmo. Cambie al modo de "Slice", y haga clic en los extremos polares de un punto para medir su diámetro. Ver Figura 4E. Haga esto durante 4 o 5 puntos redondos que parecen indicativos de un PCC en el apogeo de su estabilidad, después de la formación y antes de la escisión. Utilice estas medidas para calcular el diámetro promedio hasta la décima de micra.
  4. Detectar puntos. Vuelta al modo de "Supera". Seleccione el canal adecuado para la detección. Introduzca el diámetro medido promedio, por lo general 0,3 o 0,4 micras. Haga clic en la flecha de avance azul para cuantificar los Spots. Ver Figura 4E. Si se subestima el diámetro de manchas, puntos falsos de fluorescencia se identificarán como Spots. Si el diámetro es demasiado grande, se pasarán por alto los verdaderos puntos. Cuando no esté seguro, estimar un poco más bajo, y filtrar las detecciones incorrectas más tarde.
  5. Filtra Spots de Calidad. Ajuste el filtro para capturar la mayor cantidad de puntos posible sin respaldosuelo. El filtro de Calidad está seleccionada por defecto 20. Ver Figura 4F.
    1. Utilice la curva de "calidad" como una guía para establecer un umbral apropiado. Mueva el umbral inferior del filtro con el botón izquierdo del ratón para este primer chapuzón en la curva. Este es un buen punto de partida para el filtro, ya que esta posición suele refina la detección de manchas sólo visibles. Ver Figura 4F.
    2. Manchas detectadas aparecen en la película como esferas o centros de píxeles. Uso de la ficha "Colores", ajustar el color de las manchas de un color que contraste para que sea más fácil verlos. Desplácese por la película para revisar los puntos en cada fotograma. El objetivo es detectar la mayor cantidad de puntos posibles para la totalidad de su vida.
    3. Eliminar las manchas de dimmer o manualmente conectarlos en pistas continuas más tarde, ya que no se detectan bien en el transcurso de sus vidas.
    4. Retire las placas brillantes con un fil "Intensidad"ter, si es necesario. Haga clic en el signo más verde para añadir un nuevo filtro. Ver Figura 4F. Crear un filtro de Intensidad para filtrar o reducir Spots de un dado señales de fluorescencia. Utilice la curva generada Intensidad, (análogo a la curva de Calidad discutido en 4.5) para establecer el umbral. Utilice el botón izquierdo del ratón para eliminar el extremo izquierdo de la curva que representa los puntos más brillantes.
      NOTA: Las grandes estructuras de placa suelen estar entre los elementos más brillantes de la célula, y son fácilmente excluidos con este filtro.
    5. Desplácese por la película para asegurarse de que las entidades de contrapartida central se detectan como manchas y las placas más brillantes ya no se detectan. Figura 3D muestra una celda en la detección de los PCC (denotado por esferas blancas) se optimizan con el filtro de la calidad y las placas fueron excluidos con la calidad filtro.
    6. Reducir bordes de células brillantes con el filtro de calidad. Los objetos brillantes todavía pueden necesitar ser retirado manualmente, en el siguiente paso. Continuar con el azulflecha.
    7. Retire Spots aberrantes en la pantalla Spots Edit. Cambie a "Select" de modo. Haga clic en el acto. Es a su vez de color amarillo. Haga clic en "Eliminar". Haga clic en la flecha azul para continuar construyendo el algoritmo. Ver Figura 4G.
  6. Pistas medida. Establecer pistas de "movimiento browniano." El PCCh no debería presentar ningún movimiento dirigido, sólo deriva mínima a través de la membrana plasmática. Este algoritmo es el más apropiado para ese movimiento. Ver Figura 4H.
    1. Establezca la Distancia máxima a un valor pequeño como 0,7 micras. Ver Figura 4H.
      NOTA: Ajuste de una pequeña distancia minimiza la conexión de puntos adyacentes y todavía permite continuar el seguimiento de un sitio celular a través de CCP o el movimiento celular.
    2. Conjunto Max tamaño de hueco a 1. Esto permite una pista para continuar si sólo hay una trama que falta en sucesión. Haga clic en la flecha azul para calcular pistas. Ver Figura 4H.
      NOTA: Gap tamaños de más de 3 causas diferentes pistas para ser incorrectamente unidos entre sí.
    3. Cambiar la visualización de la pista a "Dragon Tail." Desplácese por la película de observación de la calidad de la detección. Si se están conectando puntos adyacentes, disminuir la Distancia máxima por debajo de 0,7 micras. Si Spots se rompen con demasiada facilidad, aumentar el tamaño máximo Gap. Haga clic en la flecha azul para crear pistas. Esto lleva a la pantalla de pistas de filtro. Ver Figura 4H.
  7. Filtro Pistas y exportación de datos. Utilice un filtro de "Intensidad" para eliminar placas brillantes adicionales. Utilice un filtro de "Desplazamiento" para eliminar los endosomas que entran en el campo de TIRF. Tenga cuidado, como manchas más largos tendrán desplazamientos más largos también. Haga clic en la doble flecha verde para completar el protocolo. Ver Figura 4E.
    1. Utilice la ficha Edit Tracks, con el icono del lápiz, para eliminar detecciones de falsos positivos de pistas que no pueden ser destituidos por filtros. Compruebe discontinuities o falsas conexiones. Para conectar dos pistas, selecciónelas mediante Ctrl-Izquierda-clic, a continuación, haga clic en "Connect" en el cuadro Edit Tracks. Para desconectar pistas en lugares separados, seleccione una pista y pulse "Disconnect". Seleccione varios Spots con Ctrl + clic izquierdo y clic en "Conectar" para crear una nueva pista. El método es el mismo para los puntos de edición, descritos en 4.5.7. Ver Figura 4J.
    2. Para exportar datos, vaya a la pestaña de estadísticas. Haga clic en el icono de un solo disco para exportar la estadística seleccionada. Haga clic en el icono que se parece a una serie de disquetes de exportar todas las estadísticas. La estadística de "Track Duración" contiene la longitud de las vías endocítica. Ver Figura 4K.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uso de células vivas TIRF de Microscopía hemos registrado la dinámica endocítica de la μ-opioide-receptor (MOR), un receptor acoplado a proteína G (GPCR) y su endocítica proteína adaptadora β-arrestina. El constructo de β-arrestina se transfectó transitoriamente en una línea celular que expresa de forma estable MOR usando el protocolo descrito en la Figura 1, y la imagen 96 horas más tarde. El MOR en la línea celular estable es N-terminal marcado con una GFP sensible al pH. Esta proteína fluorescente sólo emite fluorescencia en el fluido extracelular neutral. Además, el MOR sólo endocytoses una vez activado por un agonista, y permanece contrario distribuye uniformemente a través de la membrana plasmática. Centrándose en la membrana plasmática adherente que está sentado en la cubierta de vidrio en los resultados de modo confocal en una celda que se llena con una fluorescencia tenue. Esto es diferente de un centrado en el centro de la célula, donde la membrana plasmática sólo se ve como un anillo de la fluorescencia alrededor de la célula. Comparar la izquierday paneles de la derecha en la Figura 2A. El cambio a epifluorescencia convencional o TIRF con un ángulo incorrecto hace que fuera de foco de fluorescencia a ser evidente en las mismas células como se muestra en la Figura 2B. Cuando el ángulo TIRF es correcta la membrana plasmática es muy nítida, clara y brillante y fuera de foco de fluorescencia ya no altera la imagen. Comparar la Figura 2C a las figuras 2A y 2B.

La imagen es clara y nítida porque el MOR es en la membrana plasmática adherente, que es en gran medida dentro del campo TIRF. En contraste, β-arrestina permanece en una piscina citosólica cuando aún no reclutados para puncta endocítica, y aparece nebuloso y fuera de foco, ya que no está en el campo TIRF. Una vez que el MOR es activado por un agonista, β-arrestina es reclutado a la membrana plasmática, y ambos β-arrestina y el receptor de redistribuir a los PCC (Figura 3A y de la película 1 , Β-arrestina en verde, MOR en rojo, superposición es de color amarillo).

Los tiempos de vida de estos grupos se pueden cuantificar manualmente usando los tres parámetros para la endocitosis completado como se muestra en la Figura 3B. Las manchas que denotan los PCC pueden o bien desaparecer por completo (véase también la figura 3C), "blink" y desactivar o "pellizcar" una estructura más grande. Las dos últimas condiciones representan eventos que están espacialmente demasiado cerca juntos para resolver como eventos separados. El algoritmo de detección de puntos en Imaris también es útil para cuantificar los PCC, como se indica en la Figura 4. Figura 3D denota PCC detectó utilizando Imaris, después de la filtración para eliminar las estructuras de placa no dinámicos. Esferas blancas superpuestas denotan manchas detectadas. Dimmer manchas que no pudieron ser detectados para el conjunto de sus vidas también fueron excluidos con el filtro de "Calidad".

"> Figura 1
Figura 1: Diagrama de flujo del procedimiento de transfección. (A) En primer lugar, la semilla de una variedad de diluciones (1:50, 1:25, 01:16, 01:10) en una placa de 12 pocillos. Permitir que las células crezcan durante la noche. Al día siguiente, busque un bien que es de un 70% de confluencia, y uniformemente distribuido, como se muestra. Este es el bien que se transfectaron. (B) Añadir 60 l de tampón CE y 400 ng de ADN en un tubo de microcentrífuga. Vortex durante 10 segundos y centrifugar el líquido al fondo del tubo. Añadir 2,4 l de Enhancer. Vortex durante 2 segundos y girar el líquido al fondo del tubo. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 6 l de Effectene. Vortex durante 2 segundos y girar el líquido al fondo del tubo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. (C) mezclar lentamente 0,8 ml de DMEM con 10% de FBS con la transfección. Añadir a las células en previamente seleccionado también. Se incuban las células durante 5 horas a 37 ° C. Reemplazar con frescosDMEM con 10% de FBS.

Figura 2
Figura 2: Encontrar el campo TIRFM. (A) La membrana plasmática fotografiado en confocal. El panel izquierdo representa células en confocal con un enfoque en el centro de la célula. La membrana plasmática sólo se ve como un "anillo" alrededor de la célula. Centrándose abajo a la membrana plasmática basal, adyacente a la cubreobjetos hace que la célula debe ser rellenado con una fluorescencia tenue. El "anillo" membrana plasmática no debe ser visible en el campo TIRF más delgada. (B) La membrana plasmática basal con un ángulo menos profundo TIRF producir la iluminación de epifluorescencia convencional a través de la muestra. Esta ilumina toda la célula y mucho fuera de foco de fluorescencia desde la parte superior de la celda está presente. (C) La membrana de plasma en TIRF. Centrándose en filopodios ayuda a encontrar este plano. Observe que se trata deun solo plano liso. Las barras de escala son de 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: La visualización y cuantificación de eventos Endocítica en TIRF. (A) Una célula que expresa el μ-opioide-receptor (MOR) y β-arrestina antes y después de la adición de un agonista que induce la endocitosis. El agonista provoca la redistribución de ambas proteínas a puncta endocítica. La barra de escala es de 10 m. (B) Tres tipos de eventos endocíticas, vistos mediante la visualización dinámica arrestina, consistente con morfologías descritas anteriormente. "Estable", una señal constante que desaparece rápidamente. Este es el tipo principal, lo que indica que el PCCh ha brotado y salido del terreno TIRF. "Blink", una señal que parpadea a una señal de baja y vuelve a aparecer en el mismo lugar debido a ensamblaje de un segundo PCC en el mismo lugar. "Pellizque", una proyección tubular sale una mancha, cuando dos entidades de contrapartida central son demasiado cerca unos de otros por resolver como puntos distintos, y uno se endocitosada. El cuadro es de 2 x 2 m. (C) Visualizar la endocitosis mediada por clatrina de MOR en la resolución de un solo evento. Se muestran dos ejemplos que representan la principal fracción de eventos endocíticas MOR. Los marcos son cada 3 s. El cuadro es de 2 x 2 m. (D) La detección de eventos endocíticas individuales utilizando Imaris. Esferas blancas denotan PCC detectados como puntos. Detección de puntos se optimizó el uso de un filtro de "calidad". Dimmer manchas que no podían ser detectados por la totalidad de su vida también fueron excluidos con el filtro de calidad. Estructuras de placas grandes que se muestran como siendo sin ser detectados fueron omitidos usando un filtro de "Intensidad".ig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Objetivo El reconocimiento de la Dinámica de Eventos Endocítica utilizando Imaris. (A) La ventana de ajuste de pantalla, que se utiliza para ajustar la visualización de la imagen como se describe en el Paso 4.1. (B) Apertura de la "Spots" constructor algoritmo. El constructor se muestra en la ventana de abajo. (C) El primer paso de la constructora algoritmo Spots. Compruebe "Puntos de pista (en el tiempo)." Check "Segmento sólo una zona de interés," si es necesario. Pantalla (D) selección ROI. Consulte el paso 4.2 para más detalles. (E) Las múltiples ventanas necesarias para definir el diámetro de un punto medido. Los paneles representan: el cambio de modo de superar a la rebanada con el Navigación Bar en la parte superior, al hacer clic en los extremos polares de un punto, en el que el diámetro medido aparece, normalmente en el extremo derecho, donde para entrar en el diámetro medido. Consulte los pasos 4.3 a 4.4. (F) El filtro de calidad in situ se describe en 4.5-4.5.3. Ventanas puntos (G) Editar descrito en 4.5.7. (H) pistas Medida y visualización de pistas ventanas, que se describe en 4.6. (I) ventana Filtro Tracks describe en 4.7. (J) Editar pistas de la ventana se describe en 4.7.1. pantalla de datos (K) Guardar descrito en 4.7.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí se describe el uso de TIRFM para visualizar la endocitosis mediada por clatrina (CME) a ​​nivel de individuo PCC en las células vivas en tiempo real. CME es un evento rápido y muy dinámico mediada por el efecto acumulativo de muchos eventos espacial y temporalmente separados individuales. La mayoría de los ensayos que se utilizan actualmente, como las mediciones bioquímicas de internalización mediante biotinilación superficie o de unión del ligando, la citometría de flujo o ensayos de células fijas que miden la cantidad de proteínas interiorizadas, o la localización de microscopía electrónica de proteínas, controlar los cambios de conjunto en la localización de proteínas en los puntos fijos de tiempo . Estos métodos existentes han sido muy útiles en la identificación de las proteínas que son necesarias para el CME, pero carecen de la resolución espacial y temporal que coincide con las escalas fisiológicas de CME u otros procesos de tráfico de membrana dinámica. Esto es importante, ya que la evidencia reciente sugiere que los PCC son heterogéneos en su composición de proteínas y la dinámica 1.92, y como CME es probable que regula rápidamente de una manera espacialmente discreta. TIRFM celular en vivo proporciona la capacidad de analizar CME en el nivel de espacialmente separada sola PCC, en tiempo real, en las células vivas.

La aplicación exitosa de este poderoso ensayo se basa en dos factores clave: la buena salud de las células y el análisis exhaustivo de los parámetros de la CME. En el primer caso la expresión, propia de proteínas etiquetadas y técnicas de microscopía minimizando fototoxicidad son críticos. Las líneas celulares que expresan de forma estable las proteínas de interés son ideales, ya que los niveles de expresión pueden ser estimados con fiabilidad. Nos marcamos los receptores, ya sea con epítopo Flag N-terminal o SPH etiquetas 21-25. Aunque no es estrictamente necesario, ambos sistemas de etiquetado facilitan TIRFM de CME porque los receptores pueden detectarse selectivamente en la membrana plasmática en el inicio del experimento. Los componentes adicionales deseados endocítica también pueden ser transfectadas transitoriamente en estas líneas celulares estables. El trprotocolo ansfection señalar aquí está optimizado para imágenes CME usando TIRFM. En primer lugar, está adaptado para incluso y moderados niveles de expresión. Poor expresión requiere mayor potencia del láser para la detección y aumenta el riesgo tanto para la fototoxicidad y photobleaching. Además, dado que este ensayo registra la desaparición de puntos lagrimales como PCC internalizadas, las señales de baja y photobleaching también son perjudiciales para el análisis. Sugerimos que, en estas circunstancias, la duración total y / o la frecuencia de imagen se reducirá. En segundo lugar, el corto de incubación de los reactivos de transfección en las células, el intervalo entre la transfección y el experimento, y el paso fresco de células transfectadas para cubreobjetos antes de formación de imágenes, todo asegurar que las células son fotografiadas en una salud óptima. En tercer lugar, esto asegura que la mayoría de las estructuras de clatrina son PCC, y las hojas no planas de clatrina o placas de clatrina. En cuarto lugar, este protocolo minimiza la sobre-expresión de los componentes de CME transfectadas, que ha sido mostrarn para alterar la dinámica de CME 20,26.

Para imágenes con una baja fototoxicidad, es importante para optimizar el sistema de formación de imágenes para la resolución óptima y máxima sensibilidad. El aumento del objetivo y el tamaño del detector de la cámara debe ser ajustado para minimizar ampliación sub o sobremuestreo y vacío. Una apertura numérica alta (1,45 o superior) TIRF objetivo se deben usar para recoger el máximo de luz posible. Adquirimos imágenes con una cámara de dispositivo de carga acoplada de electrones multiplicando para alta eficiencia cuántica, los tiempos de exposición bajos, y velocidades de lectura rápida. Además, para asegurar la salud de las células, que son imágenes en los medios de Leibovitz, que está tamponada independiente de CO 2, y se complementa con 10% de FBS, en una cámara completamente cerrado ajustado a 37 ° C. Debido TIRFM es muy sensible y los objetivos de gran apertura numérica utilizados pueden detectar la luz ambiente aunque sea mínima, es fundamental para crear un entorno de imagen adjunta librede la luz y las vibraciones externas que pueden perturbar el plano focal bien.

Es importante tener en cuenta que los tiempos de vida absolutos y la dinámica de la mayoría de los componentes de la CME varían en gran medida dependiendo de los tipos de células, los niveles de expresión de las proteínas, la temperatura, días después de la siembra, y otras variaciones en las condiciones de cultivo 7,10,14,17,20, 25,27. Esto se refleja en las enormes variaciones en los plazos y con las distribuciones observadas entre los diferentes grupos que utilizan esta técnica, una clara limitación de este ensayo. Además, es posible que los PCC sobre la superficie inferior de la célula, fotografiado en TIRFM, se comportan de manera diferente desde la superficie superior 23,25. Si bien es discutible en cuanto a que la superficie representa con precisión una célula "típica" rodeado de los componentes de la matriz extracelular en un tejido, las interpretaciones de la dinámica del PCCh visto por esta técnica deben tener en cuenta esta diferencia de potencial. La verdadera fuerza del ensayo, por lo tanto, se encuentra en la comparación de los cambios en dynamics de PCC, en las mismas células bajo condiciones de cultivo idénticas, después de manipulaciones agudas, incluyendo la agrupación de moléculas de carga tales como GPCRs en respuesta a la activación. Esta comparación permite la normalización de los cambios en la misma célula, controlando de este modo para todos los parámetros mencionados anteriormente que pueden inducir variaciones en el comportamiento CCP.

Normalmente empleamos ambos análisis manuales y automatizados, que se describen más arriba, para analizar la duración de los eventos de endocitosis: la verificación manual y reconocimiento objetivo utilizando el software de análisis de imágenes Imaris. Verificación manual es en mano de obra y que requiere mucho tiempo, ya que está limitado por el número de entidades de contrapartida central un usuario puede contar, pero podría decirse que es la técnica más precisa disponible. Un ojo humano entrenado puede seguir fácilmente el seguimiento de un CCP a través del movimiento celular, y cambios en la forma o enfoque, excluyendo precisión placas y los píxeles defectuosos. También puede detectar los cambios morfológicos en el PCCh indicativo de víspera completadonts, ​​como se muestra es la figura 3B y 3C. Es imperativo, sin embargo, que el análisis sigue siendo objetivo como sea posible dentro de estas limitaciones. Esto requiere la definición de los criterios específicos que se utilizan constantemente en todos los conjuntos de datos. Además, por lo general analiza imágenes de una manera doble ciego, donde están codificados los nombres de las imágenes por lo que siguen siendo desconocidos para la persona analizando las imágenes de las condiciones. Detección automatizada, por ejemplo, utilizando los "puntos" y "Duración Track" algoritmos en Imaris, se puede utilizar para detectar la mayoría de los lugares endocítica en una película dada, la generación de un alto número de muestra. Mientras que muchas opciones, incluyendo algoritmos medida altamente complejas 3,14,23,26,27, se están generando, la fiabilidad de estos métodos para detectar eventos endocíticas correctos, evitando la detección de espurios sigue siendo la mayor preocupación. Por ejemplo, en Imaris, movimiento celular creando bordes delanteros brillantes, placas, y fuera demarcos de enfoque puede tirar fácilmente de la algoritmo de detección de puntos, ya que tiene una tendencia a detectar estructuras brillantes como compuesto completamente de manchas. A fin de evitar estos puntos se conecten en una pista, todos ellos deben ser removidos. Spots aberrantes individuales que no están en grandes estructuras tales como las placas se pueden eliminar con la pestaña Editar Spots, mientras Spots conectados pueden retirarse más tarde usando la pestaña Editar pistas. Los puntos aberrantes también pueden eliminarse con filtros personalizados. Por ejemplo, la figura 3D muestra un filtro de intensidad utilizada para limitar evitar incluyendo placas en la detección de CCP. El filtro de calidad es otro filtro muy útil para eliminar manchas erróneas. "Calidad" es una medición acumulativa de brillo y forma encontrada tomando la intensidad de fluorescencia de la mancha y filtrado gaussiano por ¾ de la longitud del radio punto 20. La curva de la Calidad se encuentra por debajo de los filtros seleccionados. Se representa el número de manchas (y) detectadocuando la calidad es un cierto valor (x). Cuanto menor sea la calidad, más los puntos detectados. Si el filtro de calidad es demasiado bajo, manchas serán detectados donde no hay fluorescencia visible, a la inversa, si el filtro de calidad es demasiado alta, se detectarán sólo los puntos más brillantes. Siga a lo largo de la curva hacia mayores valores (x); el número de manchas detectadas (y) típicamente se reducirá drásticamente. Mueva el umbral inferior a este punto. Este es el punto mínimo para colocar el umbral inferior. Otros contribuyentes importantes a los puntos falsos en el campo TIRF son endosomas que se mueven a la periferia de la célula y entran en el campo de TIRF. Un criterio robusto para la eliminación de estos es la movilidad de los puntos, es decir, el desplazamiento de los puntos en el tiempo. PCC mueven muy poco menos que como parte del movimiento de toda la célula, mientras que los endosomas exhiben movimiento Browniano o dirigida rápido. Algoritmos más nuevos, mientras que mejoró significativamente, todavía se están perfeccionando y optimizados 3,14,23,26,27. A medida que estos cumplancapachos se vuelven más sofisticados y confiables, podemos analizar cientos o miles de lugares, sin tener que verificar manualmente en cada punto. Actualmente, sin embargo, se sugiere que estos dos análisis pueden utilizar juntos para complementarse entre sí para mayor exactitud.

El protocolo que hemos descrito se puede adaptar fácilmente para responder a muchas preguntas acerca de la endocitosis de carga. Se puede utilizar para realizar sencilla co-localización de cargas con componentes de CME, y se utiliza para mostrar los cambios en los componentes específicos de la maquinaria endocítica debido a estímulos particulares. El ensayo también puede ser fácilmente adaptado para cualquier proceso endocítica, tales como caveolae 28, que muestran las concentraciones de los componentes discretos de carga y de la capa, y para el estudio de estos procesos fundamentales en tipos de células especializadas. En el futuro, como la edición del genoma se hace más convencional 20,29,30, anticipamos que se convertirá en el método preferido para el marcado de los componentes, y que la dinámica y el comportamiento odiversos componentes f se perfeccionarán aún más. Teniendo en cuenta que nuestra comprensión de los procesos celulares ha sido impulsada en gran parte por la identificación de los genes, las modificaciones de las proteínas, y interactomes, el ensayo se describió aquí representa una de las próximas fronteras de la investigación, a saber. la definición de la dinámica espacio-temporal de estos procesos y mecanismos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate Fisher Scientific  SH3024301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco, by Life Technologies 21600-010
EDTA Free Acid Amresco 0322-500G
Fetal Bovine Serum Gibco, by Life Technologies 10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco, by Life Technologies 21083-027
Opti-MEM Gibco, by Life Technologies
HEPES CellPURE by Fisher Scientific BP2937-100
Effectene Qiagen 301425 Transfection reagent
25 mm coverglass Fisher Scientific 12-545-86
Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 Fisher Scientific 10-126-28
Cell culture 6-well plate Greiner Bio-One, by VWR 82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1 Sigma Aldrich F3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) Sigma Aldrich E7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Life Technologies A20173
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Image analysis software BitPLane http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters Nikon
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti Nikon For adjusting angle of incidence
iXon+ EMCCD camera and adapters Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123, (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9, (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289, (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351, (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374, (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121, (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272, (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123, (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127, (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24, (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20, (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7, (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89, (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4, (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118, (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16, (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291, (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13, (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6, (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7, (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21, (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12, (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26, (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326, (5959), 1509-1512 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics