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Biology

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Summary

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

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Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

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Abstract

Prototrophic bacterias crecen en M-9 mínimo de sales suplementado con glucosa (M-9) medio, que se utiliza como fuente de carbono y energía. Auxótrofos se pueden generar utilizando un transposome. El comercialmente disponible, Tn 5 transposome -derivado utilizado en este protocolo consiste en un segmento lineal de ADN que contiene un origen de replicación R6K γ, un gen para resistencia a la kanamicina y dos secuencias de mosaico extremos, que sirven como sitios de unión de transposasa. El transposome, siempre como un complejo de proteínas de ADN / transposasa, se introdujo por electroporación en la cepa prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora al azar en el genoma de este host. Los transformantes son réplica en placas sobre agar Luria-Bertani placas que contenían kanamicina, (LB-kan) y en placas de agar M-9 medio que contiene kanamicina (M-9-kan). Los transformantes que crecen en placas de LB-kan pero no en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos. Genómico purificadoADN de un auxótrofo se digiere parcialmente, se ligó y se transformó en un pir + Escherichia coli (E. coli) cepa. El origen de replicación R6Kγ permite que el plásmido se replica en pir + E. cepas de E. coli, y el marcador de resistencia a kanamicina permite la selección del plásmido. Cada transformante posee un nuevo plásmido que contiene el transposón flanqueado por la región cromosómica interrumpido. Secuenciación de Sanger y la Local Alignment Search Tool Básica (BLAST) sugieren una identidad supuesta del gen interrumpido. Hay tres ventajas de utilizar esta estrategia de mutagénesis transposome. En primer lugar, no se basa en la expresión de un gen de transposasa por el anfitrión. En segundo lugar, la transposome se introduce en el host de destino mediante electroporación, en vez de por conjugación o por transducción y por lo tanto es más eficiente. En tercer lugar, el origen de replicación R6Kγ hace que sea fácil de identificar la mutación geno que se recupera parcialmente en un plásmido recombinante. Esta técnica se puede utilizar para investigar los genes implicados en otras características de Enterobacter sp. YSU o de una variedad más amplia de cepas bacterianas.

Introduction

Prototrophic bacterias crecen en M-9 que contenían medio mínimo de sales glucosa (M-9) medio, la conversión de glucosa a través de vías centrales del metabolismo de carbono para generar precursores, tales como aminoácidos, ácidos nucleicos y vitaminas, para la biosíntesis de 1. M-9 medio contiene cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, sodio y fosfato de potasio como un tampón y fuente de fósforo, sulfato de magnesio como una fuente de azufre y glucosa como fuente de carbono y energía. Luria-Bertani (LB) medio es rico en aminoácidos de triptona y en vitaminas y factores de crecimiento a partir de extracto de levadura. Es compatible con el crecimiento de los auxótrofos que no pueden sintetizar aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento necesarios para el crecimiento en medio M-9. Por lo tanto, prototrofos crecerán en LB y medio M-9, mientras que auxótrofos crecerán en medio LB, pero no en medio M-9. Mediante la introducción de mutaciones en una población prototrophic de bacterias y la identificación de genes mutados que causan fenotipos auxotróficas, es possible para obtener una mejor comprensión del metabolismo en una cepa bacteriana.

Mutagénesis de transposón puede ser usado para identificar muchos de los genes necesarios para el crecimiento en glucosa en medio M-9. Los transposones se insertan aleatoriamente en el genoma huésped 2. Mediante la identificación de transformantes transposón en placas de agar LB y réplica en placas sobre placas de ellos M-9 de agar de medio, es posible para la detección de auxótrofos. Genes interrumpidos se identifican a través de rescate de genes. Este estudio utiliza un comercialmente disponible Tn 5 -derivado transposome que se suministra como una solución de un segmento de ADN transposón lineal mixto con la proteína transposasa. El segmento de ADN carece de un gen de la transposasa, pero contiene un gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación γ R6K y dos motivos de mosaico que son secuencias de ADN para la transposasa de unión en cada extremo del segmento de 3,4. Dado que la proteína transposasa se añade directamente al ADN, el segmento de ADN solose define como el transposón, y el complejo de proteínas de ADN / transposasa se define como la transposome. El transposome se transformó por electroporación en un 5 kanamicina sensibles host (Figura 1A). Las colonias que crecen en placas de agar LB que contenían kanamicina (LB-kan) tienen inserciones de transposones (Figura 1B), y réplicas de chapado en transformantes que no crecen en M-9 placas de medio de agar que contiene kanamicina (M-9-kan) son auxótrofos (Figire 1C). El ADN genómico de un mutante es purificado y parcialmente digerido con la endonucleasa de restricción de corte 4-base, BFU CI (Figura 1D). El ADN ligado se transformó en una cepa de Escherichia coli (E. coli) que contiene el gen pir (Figura 1E). Este gen permite que el nuevo plásmido que contiene el transposón y región flanqueante cromosómico del huésped para replicarse en E. coli 6. El gen de resistencia a kanamicina sirve como comomarcador elegible para el nuevo plásmido. Por último, la secuenciación usando cebadores complementarios a cada extremo del transposón y Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análisis de la secuencia resultante se usan para determinar la identidad de los genes interrumpidos.

Esta estrategia de mutagénesis transposome ofrece tres ventajas 3. En primer lugar, ya que la proteína transposasa se une directamente a la transposón, la inserción no depende de la expresión del gen transposasa dentro del huésped. Una vez que el transposón se incorpora en el genoma huésped, la transposasa se degrada, impidiendo el movimiento adicional del transposón. Sin embargo, el movimiento adicional que no se puede evitar si el host posee un 5 Tn elemento transposicional endógeno. En segundo lugar, la introducción de la transposome por electroporación hace que sea posible su uso en una amplia variedad de huéspedes. También elimina la necesidad de introducir el transposón por conjugación bacteriana o por viinfección ral. Ambos procesos requieren la susceptibilidad del huésped. En tercer lugar, la inclusión del gen de resistencia a kanamicina y el origen de replicación R6K γ en el transposome hace que sea más fácil identificar el gen interrumpido. Regiones de tipo transposón interrumpida se pueden almacenar y se secuenciaron como plásmidos, lo que elimina la necesidad de utilizar la reacción en cadena inversa de la polimerasa (PCR) para la identificación de genes.

El protocolo presentado en este video se describe cada paso por transposón mutagénesis de Enterobacter sp. YSU 9 usando un transposome de su introducción en las células bacterianas a la identificación del gen putativo se interrumpió. Además de los protocolos publicados previamente 3,4,10, se presentan métodos detallados para el uso de réplica en placa para detectar auxotrofos. Esta técnica de mutagénesis puede utilizarse para la investigación de otros fenotipos, tales como antibióticos y resistencias de metal, en diferentes tipos de bacterias, por identifying el número mínimo de genes necesarios para el crecimiento en condiciones de cultivo definidos en los estudios de biología sintética, o para la enseñanza de un componente de laboratorio de una genética o curso de fisiología microbiana.

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Protocol

1. La electroporación de células competentes 5,11

  1. Diluir una O / N LB cultura de Enterobacter sp. YSU 1/20 en 50 ml de medio LB fresco y crecer con agitación a 120 rpm y 30 ° C a una OD (600 nm) entre 0,4 y 0,6. Opcionalmente, crecer otras cepas bacterianas a su temperatura de crecimiento óptima.
  2. Chill las células en hielo durante 5 min y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min.
  3. Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 50 ml de agua enfriada con hielo estéril y se centrifuga a 4 ° C y 7000 xg durante 5 min. Repita este paso.
  4. Descartar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen de agua fría de hielo igual al volumen de sedimento de células. Para el almacenamiento a largo plazo, se lavan las células con 10 ml de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, se resuspende en un volumen igual de pellets de hielo frío 10% (v / v) de glicerol, almacenar a -80 ° C, y descongelar en hielo antes de la electroporación.
  5. Añadir 0,5 l de la transposome a 40 l delas células. La solución transposome disponible comercialmente se suministra a una concentración de DNA de 0,33 g / l. Aunque se recomienda 0,33 mg, 0,165 g de ADN es suficiente.
  6. Coloque la mezcla de células / transposome en un hielo frío, 0,2 mm, cubeta de electroporación y toque la mezcla a la parte inferior de la cubeta. Choque de las células a 25 mF, 200 Ω y 2,5 kV. Para asegurarse de que las células permanecen refrigerados, almacenar las cubetas de electroporación en un congelador a -20ºC antes de su uso.
  7. Inmediatamente, añadir 960 l de caldo de filtro esterilizado súper óptima con represión catabólica (SOC) medio. Mezclar pipeteando arriba y abajo y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril.
    NOTA: Las células empiezan a morir después de la descarga, pero la sal en el medio SOC les permite recuperarse. Para economizar, no es necesario añadir transposome o al choque de las células de control negativo. Sólo tiene que añadir 960 l de medio SOC estéril a ella.
  8. Se incuban las células a 30 ° C fo 45-60 min con agitación a 120 rpm. Esto proporciona tiempo para la transposome para recombinarse con el genoma del huésped y por las células para expresar resistencia a la kanamicina.
  9. Corre 100 l de células en una placa de agar LB-kan y se incuba la placa de O / N a 30 ° C. Guarde la mezcla de transformación que queda en el refrigerador a 4 ° C. Corre cantidades adicionales en una fecha posterior hasta 2 semanas después de la electroporación inicial, si es necesario.

2. Gridding de transformantes

  1. Cinta de una rejilla a la tapa de un vacío de 100 x 15 mm plato de petri. Copiar una rejilla de "Un Curso Corto en Genética Bacteriana" 12.
  2. Dibuje una línea en la parte inferior de una placa de agar LB-kan. Utilice un pequeño trozo de cinta para anclar a la tapa de cuadrícula de modo que la rejilla es visible a través del agar. Asegúrese de que la línea en la parte inferior de la placa está alineada con la parte superior, centro de la rejilla. El anclaje de la placa con cinta mantiene que se deslice, lo que permite incluso grillado. La línea facilita la identificación de colonias después de la réplica en placa.
  3. Escoja un único transformante con un palillo de dientes estéril y detectar en el centro de una plaza en la parrilla. Sólo tiene que tocar la colonia y el lugar. No cavar el palillo de dientes en el agar. Para evitar la contaminación de la placa, manejar el palillo de dientes sólo en un extremo.
  4. Detectar otro transformante en una casilla adyacente como en el paso 2.3. Cuando la placa está llena, se incuba O / N a 30 ° C. Este es el plato principal.

3. Réplica galjanoplastia para determinar el fenotipo auxotroph 12

  1. Para cada placa que fue cuadriculada, hacer una pila de tres placas de agar frescas numeradas del uno al tres: una para LB-kan, dos para M-9-kan y tres para LB-kan. Secar las placas al revés, O / N, a 37 ° C antes de su uso.
  2. Dibuje una línea en la parte superior de cada placa como en el paso 2.2.
  3. Limpie la herramienta de réplica en placa con etanol al 70%, colocar un cuadrado de terciopelo estéril en la parte superior de la chapa réplica aol y sujetar la plaza pana abajo. Las manos están llenas de microbios, incluso después de lavarlas. Evitar la introducción de contaminación de microbios por el manejo de la plaza de la pana por los bordes.
  4. Alinear la línea en el plato principal con una línea dibujada en la abrazadera y coloque la placa en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de la plaza de pana. Tenga cuidado de no manchar las bacterias. Retire la placa principal de la plaza de pana.
  5. Alinear la línea trazada en la placa con el número uno de la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa. Retire la placa de número uno.
  6. Deseche la plaza de pana en un vaso de agua y colocar un cuadrado de terciopelo limpio, estéril en la herramienta de réplica en placas como en el paso 3.3. Este paso evita la sobre-inoculación que provoca el crecimiento de avance y resultados falsos positivos.
  7. Alinear lalínea en la placa de número uno con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la nueva plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir las bacterias de la placa de número uno a la plaza de pana. Retire la placa de número uno.
  8. Alinear la línea trazada en la placa número dos con la línea en la pinza y colocarla en la parte superior de la plaza de pana. Aplique una leve presión para transferir la bacteria de la plaza de la pana a la placa de número dos. Retire la placa de número dos.
  9. Repita el paso 3.8 para la placa número tres. La tercera placa es un control para la transferencia completa de la placa maestra a las otras dos placas. Deseche la plaza de pana en un vaso de agua. Para volver a utilizar las plazas de pana, autoclave el vaso que contiene los cuadrados de pana contaminados, lavarlos, secarlos, envolverlos en papel de aluminio y volver a autoclave ellos.
  10. Las placas se incuban a 30 ° CO / N. Las colonias que crecen en ambas placas de agar LB-kan pero no logran crecer en placas M-9-kan se considera que son auxótrofos (
  11. Streak cabo auxotrofos de placa de número uno en una placa de agar LB-kan fresca, e incubar la placa a 30 ° CO / N.
  12. Streak a cabo para el aislamiento de 3 colonias de la placa de racha en el paso 3.11 en una placa de LB-kan fresco. Incubar la placa a 30 ° CO / N. Esto asegura que el mutante está bien aislado. Dividir el plato en tres partes y la racha fuera cada colonia en una sección.
  13. Colonias spot de las colonias con rayas a cabo derivadas de paso 3.12 en una placa de LB-kan fresca para formar una cuadrícula como en los pasos 2.1 a 2.4. Cada mutante está siendo re-probado por triplicado.
  14. Replicar placa de nuevo como en los pasos 3.1 a 3.10 para confirmar el fenotipo auxótrofo.

4. Gen Rescate

  1. Cultivar un 3 ml O / N cultura de una colonia mutante aislado de la etapa 3.13 en medio LB-kan líquido a 30 ° C. Se purifica el ADN genómico a partir de 1 ml de cultivo usando un kit de purificación de ADN genómico disponibles comercialmente.
  2. Configurar una mezcla de 0,025 UEndonucleasa de restricción BFU CI y 14 l de 1 mg / l de ADN genómico en una reacción de 20 l en hielo. Desde BFU CI corta el transposón en doce sitios diferentes, puede ser más eficaz utilizar la endonucleasa de restricción, Bfa I o Hae III, que corta el transposón en dos y tres sitios diferentes, respectivamente.
  3. Incubar la reacción a 37 ° C durante 25 min y después a 80 ° C durante 20 min para inactivar la enzima. Analizar 3 l de la ADN parcialmente digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). A exitosos resultados parciales de digestión en una mancha de por encima de 10 kb hacia abajo a la parte inferior del gel.
  4. Ligar 15 l de ADN genómico parcialmente digerido usando 800 unidades de ADN ligasa de T4 en una reacción de 500 l. Incubar la reacción de O / N a 4 ° C. El volumen de reacción grande maximiza la ligación de fragmentos individuales a sí mismos y minimiza las interacciones entre dos o más fragmentos de ADN.
  5. Precipitate el ADN se ligó mediante la adición de 50 l de acetato de sodio 3 M, pH 5,5, y 1 ml de etanol de 95% y la incubación a -20 ° C durante 20 min.
  6. El ADN de microcentrífuga a 4 ° C y 13.500 xg durante 10 min, se lava el sedimento con etanol al 70%, se seca en un concentrador de vacío centrífuga, y resuspender en 10 l de agua libre de nucleasa. Alternativamente, el ADN puede ser secada al aire a temperatura ambiente durante 15 min.
  7. Utilice 4 l de ADN se volvió a suspender para transformar E. coli cepa pir ECD100D o ECD100D pir116 por electroporación como en la sección 1. El origen de replicación γ R6K requiere una cepa bacteriana con un gen pir a replicar 6. Los resultados cepa pir en los plásmidos de copia bajos, y la cepa pir116 contiene un gen mutante pir que resulta en plásmidos de copias elevados. Cada transformante contiene un nuevo plásmido con el transposón y una región del cromosoma interrumpida (Figura 1E).
  8. Inoculcomió 5 ml de medio LB-kan con una sola colonia, crecer O / N con agitación a 120 rpm y 37 ° C, y purificar ADN plasmídico a partir de la cultura entera O / N utilizando un kit comercial.
  9. 14 l de digerir el plásmido usando la endonucleasa de restricción Xho I. Asegúrese de que el volumen final de la reacción es de 20 l. Esta enzima reconoce un sitio en el centro del transposón en el extremo 5 'del gen de resistencia a kanamicina. Analizar 10 l de la plásmido no digerido y digerido en un gel de agarosa al 0,8% (Figura 3). El plásmido consiste en el ADN del huésped 2 transposón kb además de acompañamiento.

5. Secuenciación de ADN

  1. Secuenciar el plásmido usando un kit de secuenciación disponible comercialmente, cebadores que son homólogas a cada extremo del transposón, y un sistema de análisis de secuenciación capilar. Alternativamente, el plásmido puede ser enviado a una institución fuera para la secuenciación.
  2. Utilice el patrón de peso molecular (escalera de 1 kb) enel gel para estimar el tamaño del plásmido. Luego, estimar el número de nanogramos (ng) de plásmido que se requiere para el 50 fmol.
  3. Medir la concentración del ADN plásmido usando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 nm (A 260) y 280 nm (A 280). Asegúrese de que la longitud del recorrido de la luz a través de la cubeta es de 1 cm. Determinar la concentración multiplicando la absorbancia a 260 nm por 50 ng / l. ADN plásmido de alta calidad tendrá una A 260 / A 280 ratio de entre 1,8 y 2,0.
  4. El volumen de ADN requerida para cada reacción de secuenciación es el número de ng requerido para 50 fmol dividida por la concentración del plásmido. Mezclar el volumen del plásmido requerido con el agua para llevar el volumen total hasta 10 l.
  5. Calentar la mezcla de ADN plásmido / agua a 96 ° C durante 1 min y luego enfriar a RT.
  6. Añadir 8 l de mezcla maestra del equipo de secuenciación y 2 l de 1,6 M de uno de los cebadores de secuenciación.
  7. Folbajo el protocolo del kit de secuenciación para el programa de termociclador y la limpieza de reacción.
  8. Analizar cada muestra usando un sistema de análisis de ADN capilar.
  9. Use un paquete de software disponible en el mercado para ver la secuencia de ADN. Búsqueda de la secuencia "5'-GAGACAG-3 '," que es el último 7 pb del transposón (Figura 4). La secuencia antes del extremo 5 'de este segmento 7 pb pertenece al transposón. La secuencia después del extremo 3 'de este segmento 7 pb pertenece al gen interrumpido.
  10. Determinar la posible función del gen interrumpido con el Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 Básica. Utilice la siguiente link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Pegue la secuencia de la interrupcióngen ed en el cuadro de búsqueda, seleccione "otros" en virtud de la base de datos y haga clic en "BLAST" en la parte inferior de la página. Cuando el resultado aparece, desplácese hacia abajo la página para ver los resultados de la alineación (Figura 5).

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Representative Results

Transformación de Enterobacter sp. YSU por electroporación con el transposome inició la inserción del genoma al azar en el genoma huésped (Figura 1A, B). Un electroporación éxito produjo varios miles de transformantes que crecieron en placas LB-kan. Para obtener 300-400, colonias por placa bien espaciadas, se ha optimizado la cantidad de transformación mezcla de propagación en cada placa de agar LB-kan. Cada transformante contenía al menos una inserción de transposón, pero no estaba claro si un gen importante para el crecimiento en medio M-9 se interrumpió sin cribado mediante réplica en placa. Los transformantes se transfirieron a placas de LB-kan frescas en cuadrículas de 88 y réplica chapada en medio M-9. Nota, para asegurar que el transposón se mantiene en los transformantes, la sección Protocolos recomienda la adición de kanamicina a las M-9 placas de medio. El medio M-9 no fue suplementado con kanamicina en este caso, pero todavía era posible obtener auxótrofos sin ella. En (Figura 1C). Los otros 86 colonias no tenían una interrupción en un gen que se requiere para el crecimiento en M-9 medio mínimo.

Algunas colonias pueden haber sido contaminados con colonias adyacentes durante réplica en placa. Para aislar un mutante como un cultivo puro, que estaba manchado de la placa de LB-kan número uno en el Paso 3.1 sobre una placa de agar LB-kan fresco y se cultivó O / N a 30 ° C. Tres colonias que crecieron fueron sembradas a cabo en una segunda placa LB-kan frescos y cultivados O / N a 30 ° C. Entonces, una colonia que surgió de cada una de las tres colonias fue descubierto en una tercera placa de LB-kan fresco. Réplica chapado de nuevo en un M-9 medi mínimaum placa verificada por triplicado el fenotipo auxotrófico que se observó en la Figura 2. De los 1.760 transformantes transposón seleccionados en un curso de Fisiología Microbiana de 2013, 23 eran auxotrofos.

El gen interrumpido desde un auxótrofo a continuación, se identificó utilizando rescate gen. Una colonia de auxótrofo de la segunda placa de racha anteriormente (paso 3,13) se cultivó O / N en medio LB-kan, y el ADN genómico se purificó a partir del cultivo usando un kit de purificación de ADN genómico. Electroforesis en gel de agarosa mostró que el ADN purificado fue mayor que 10 kb de tamaño (Figura 3, carril 2). Para romper el ADN genómico en fragmentos más pequeños que contenían el transposón y flanqueando interrumpidos regiones de acogida (Figura 1D), se digirió parcialmente con 0.025 unidades de BFU CI durante 25 min a 37 ° C. Esta restricción de endonucleasa de recortes en 5'-GATC-3 'sitios que se producen aproximadamente cada 200 a 500 pares de bases. Aunque hayson doce 5'-GATC-3 sitios 'dentro del transposón, un gran número de fragmentos que contienen el transposón intacto y que flanquean el genoma anfitrión todavía estará presente en el ADN parcialmente digerido. El carril 3 de la Figura 3 muestra digirió parcialmente ADN genómico con una mancha de ADN a partir de por encima de 10 kb, todo el camino hasta la parte inferior del gel por debajo de 0,5 kb. Si el frotis de ADN comienza por debajo de 2 kb, el tamaño del transposón, el ADN ha sido digerido demasiado. Será necesario disminuir la cantidad de enzima añadida, el tiempo de incubación 37 ° C, o ambos. Si no hay frotis y el carril con el ADN digerido es del mismo tamaño que el ADN con el ADN sin digerir, a continuación, no se produjo la digestión. Será necesario aumentar la cantidad de enzima añadido, el tiempo de incubación de 37 ° C o ambos. En lugar de utilizar BFU CI, puede ser posible utilizar las endonucleasas de restricción Hae Bfa I o III, que corta el transposón en dos y tres sitios diferentesrespectivamente. El uso de una de estas enzimas puede aumentar el E. coli pir + transformación rendimiento durante el rescate de genes.

El ADN parcialmente digerido se ligó en una reacción de 500 microlitros. Este aumento de volumen minimiza las interacciones entre otros fragmentos de ADN y maximiza la probabilidad de que cada fragmento se ligó consigo mismo para formar una molécula circular. El ADN ligado se precipitó y se transformó por electroporación en E. coli pir116 ECD100D cepa. La mezcla de transformación se extendió sobre placas de LB-Kan. Las colonias que crecieron contenían un nuevo plásmido que consiste en el transposón y una región del gen de acogida interrumpida (Figura 1E). El número de unidades formadoras de colonias varió de 0 a 2000 por ml de mezcla de transformación. Si la región cromosómica flanqueante codifica una proteína que era tóxico para la E. anfitrión coli, la eficiencia de transformación fue baja o sólo un pequeño segmento de la chromoalgunos se asoció con el nuevo plásmido. El ADN plasmídico se purificó a partir de un cultivo que se inoculó con una sola transformante y se digirió con la endonucleasa de restricción, Xho I, que reconoce un sitio único en el centro del transposón cerca del extremo 5 'del gen de resistencia a kanamicina. Carril 4 en la Figura 3 contenía el plásmido sin digerir y el carril 5 contenía el plásmido digerido. Ya que el ADN plásmido purificado tiende a ser superenrollado, migró a un ritmo más rápido que la misma cadena lineal de ADN digerido. El tamaño correcto de este plásmido fue de 3 kb. Contenía 2 kb del transposón, además de alrededor de 1 kb del gen huésped interrumpido. Si el ADN del huésped de acompañamiento contiene uno o más sitios de reconocimiento Xho I, se observan dos o más bandas de plásmido en el carril con XhoI digerido ADN.

La Figura 4 muestra un resultado de secuenciación para un plásmido que se aisló de un auxótrofo. Después de quitar la shosecuencia transposón rt en negrita, la secuencia de ADN del huésped se presentó para Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) análisis 7,8. Uno de los resultados de BLAST sugirió que la secuencia interrumpida es similar a un subsp Enterobacter cloacae. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) gen para la corismato mutasa, que está implicado en la biosíntesis de L-tirosina y L-fenilalanina (Figura 5) 13. A veces durante la ligación del ADN genómico parcialmente digerido, el transposón lineal se liga a uno o más de otros fragmentos de BFU IC. Esto puede hacer que el BLAST resultados confusos porque la identidad de un gen cambia bruscamente. Por ejemplo, los primeros 41 pares de bases de otra auxótrofo coincidir con un gen de la glutamato deshidrogenasa-5-semialdehído que está implicado en la biosíntesis de prolina 1. Entonces, los próximos 219 pares de bases emparejados a un gen de una subunidad de la reductasa de ribonucleósido-difosfato, seguido de un segmento de par 62 para la base de lípido-A-DISACC quinasa haride. El último segmento de 295 pares de bases corresponde al glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa de nuevo. La presencia de 5'-GATC-3 sitios 'para BFU CI sugirió que dos fragmentos de ADN más pequeños ligaron en el plásmido rescatado. Por lo tanto, la dilución de ADN parcialmente digerido para reacciones de ligación no elimina completamente el fondo causado por la ligación de fragmentos más pequeños. A partir de estos resultados, se concluyó que el transposome insertó en el gen de la glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa porque la secuencia de este gen era inmediatamente adyacente a la transposón. Otros auxótrofos contenían interrupciones en el gen de la cistationina beta liasa implicada en la biosíntesis de metionina; para histidinol deshidrogenasa implicada en la biosíntesis de histidina; para fosfoserina fosfatasa implicada en la serina, glicina, y la biosíntesis de cisteína; y para reductoisomerasa-cetol ácido involucrado en leucina, isoleucina y valina biosíntesis 1.

nt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
Figura 1. transposón mutagénesis. (A) Las células bacterianas que contienen un gen que se requiere para el crecimiento en M-9 que contenían medio mínimo de sales glucosa. La caja M-9 representa un gen auxotrófico. (B) El transposome se introduce en la cepa bacteriana mediante electroporación, y la proteína transposasa unido a cada extremo del mosaico (flechas) se inserta aleatoriamente el transposón en el cromosoma huésped 3,4. Sólo transposón que contiene los transformantes se crecen en placas de medio LB-Kan. (C) Los transformantes son réplica chapada en M-9 medio que contiene glucosa y en medio LB-kan. Los transformantes que no crecen (tachado) en M-9 medio que contiene glucosa son auxótrofos. (D) El ADN genómico se purificó a partir de los auxótrofos y se digirió parcialmente con la cutt 4-baseer, BFU CI, que reconoce el sitio de ADN, 5'-GATC-3 '. (E) El ADN parcialmente digerido se trató con T4 ADN ligasa y se transformó por electroporación en E. coli cepa pir ECD100D para formar un nuevo plásmido que contiene el transposón y el gen cromosómico interrumpida que se requiere para el crecimiento en medio M-9. El gen pir permite fragmentos de ADN circular que contiene el origen de replicación R6K γ en el transposón para servir como un origen de replicación en el nuevo plásmido 6. El gen de resistencia a kanamicina sirve como un marcador seleccionable para el nuevo plásmido. El plásmido se purifica, y una secuencia de pares de bases ~ 500 del gen interrumpido se determina usando cebadores (flechas) que son homólogas a cada extremo del transposón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.


Figura 2. Réplica de la galjanoplastia. (A) Rejilla de transformantes que se transfirieron a una placa de agar LB-kan. (B) Rejilla de las mismas transformantes que se transfirieron a una placa de medio M-9. Auxotrofos crecieron en las placas LB-kan, pero no en los M-9 placas de medio. Estos se identifican por las casillas negras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 3
Figura 3. 0.8% en gel de agarosa Carril 1:. 1 kb escalera. Carril 2: ADN genómico digerido. Carril 3: BFU C I digirió parcialmente ADN genómico. Carril 4: plasma rescatado no digeridaIdentificación. Carril 5: plásmido XhoI digerido rescatado.

Figura 4
Figura 4. La secuencia de ADN parcial de un plásmido. La secuencia en negrita es parte del transposón y no se presentó para el análisis BLAST. El resto de la secuencia es un segmento de los genes rescatados desde el host.

Figura 5
Figura 5. Análisis BLAST 7,8. A partir de la primera base (consulta), el gen interrumpido parece codificar una corismato mutasa Enterobacter cloacae, que está implicado en la biosíntesis de fenilalanina y tirosina.

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Discussion

Transposón mutagénesis usando un transposome es una herramienta eficiente para generar auxotrofos en Enterobacter sp. YSU y otros tipos de bacterias Gram negativas y Gram positivas 3,4. El proceso se inició mediante la introducción del Tn 5 transposome -derivado en el huésped por electroporación. Para identificar colonias con insertos, la cepa no transformada objetivo tenía que ser sensibles a la kanamicina para seleccionar para el marcador de resistencia llevado por el transposón. Algunos anfitriones producen endonucleasas de restricción que degradan el ADN transposón antes de que pueda recombinarse con el genoma del huésped. La adición de un inhibidor de la endonucleasa de restricción a la mezcla de electroporación puede minimizar la degradación y aumentar el rendimiento de transformación 3. Durante la preparación de bacterias competentes de electroporación, era importante para eliminar tanta sal como sea posible para evitar un arco eléctrico o chispa que mata a las bacterias causadas por la presencia de sal. Incluso en la ausencia deun arco eléctrico, las células comenzaron a morir rápidamente después de escandalizarlos. La adición de la sal que contienen el medio de cultivo SOC inmediatamente restauró el equilibrio osmótico, la muerte celular minimizado y una mayor eficiencia de transformación 5. Transformantes resistentes a la kanamicina fueron avistados en una placa LB-kan fresco y réplica chapada en al M-9 mínimo medio de agar. Para evitar el exceso de inoculación que puede causar resultados positivos falsos que la señorita posibles auxótrofos, plazas de pana se cambiaron en el paso 3.6 antes que el resto de las placas fueron inoculadas. Luego, durante la réplica en placa, se aplica suficiente presión para transferir las colonias sin causar manchas o contaminación entre las colonias adyacentes.

Los genes mutados en los auxótrofos se identificaron a través de rescate de genes. El ADN genómico de cada auxótrofo se cortó utilizando una digestión parcial con la frecuencia base de la cortadora BFU-C I. digestiones parciales usando Bfa I o Hae III, que cortó el transposon con menor frecuencia, puede mejorar la eficiencia de transformación transposón. También es posible utilizar una digestión completa con otras endonucleasas de restricción, 6-base-base y 8 cortadores, que carecen de sitios dentro del transposón. El ADN digerido se ligó y se transformó en E. coli cepa pir ECD100D o ECD100D pir116 6. Aunque la E. coli cepa pir116 se transformó por electroporación en el paso 4.8, también es posible utilizar células químicamente competentes. En este caso, toda la transformación debe extenderse para obtener una gran selección de plásmidos rescatados. El gen pir permite el transposón circularizado para replicar como un plásmido de número de copia bajo, y el gen mutante pir116 le permite replicar como un plásmido de copia alto. Bajos rendimientos de transformación usando la cepa pir116 pueden deberse a la expresión de productos génicos tóxicos del host original. La toxicidad puede reducirse mediante el uso de la copia de baja pir puede hacer secuenciación más desafiante.

Secuenciación genómica y secuenciación PCR 10 14 son los métodos alternativos a rescate de genes. El método de secuenciación genómica secuencias de las regiones cromosómicas que flanquean directamente a partir de ADN genómico purificado. Esta estrategia es útil cuando el genoma del organismo objetivo ya ha sido secuenciado. Una vez que la región mutada ha sido identificado por la secuenciación genómica y BLAST, toda la región se puede amplificar por PCR y se clonó para su posterior análisis. El método PCR utiliza dos reacciones de PCR y cuatro cebadores diferentes. Los primeros pares de reacción un cebador homólogo transposón (cebador 1) con un cebador degenerado que contiene un corto de ADN, la secuencia de enlazador (cebador 2). La segunda reacción de PCR es una reacción de PCR anidada, la vinculación otro cebador homóloga transposón (cebador 3) con un cebador de secuencia homóloga enlazador (cebador 4). El sitio de cebado para el cebador 3 essituada en el lado 3 'del sitio de cebado para el cebador 1. A continuación, la amplicand de segunda reacción de PCR se limpia y se secuenció. Este método de secuenciación automatizado amplifica el ADN directamente de las células mutantes, eliminando la necesidad de que tanto la purificación de ADN y el plásmido de rescate genómico.

En lugar de identificar genes implicados en la auxotrofia, la mutagénesis de transposón también se puede utilizar para estudiar otros fenotipos fácilmente ensayadas. Enterobacter sp. YSU es una cepa bacteriana resistente a múltiples metal que es también resistente a 100 mg / ml de ampicilina (datos no publicados). Su concentración inhibitoria mínima (CIM) para HgCl2 es de 70 M, ZnCl2 es de 800 M, AgNO3 es de 80 M y NaAsO 2 es 14 mM 9. Después de la introducción de la transposome en esta cepa y grillado transformantes en placas LB-kan, las colonias pueden ser cuadriculadas réplica chapada en metales medio que contiene en concentraciones inferiores a la CMI de este Bactecepa rial. El rescate y la secuenciación de un gen interrumpido partir de un mutante con una MIC rebajado puede revelar un gen que confiere resistencia a uno de estos metales.

Además de la generación de mutantes, la transposome puede ser utilizado como un vector in vitro o in vivo para identificar genes de ganancia de función, tales como resistencia a antibióticos o metal. Para la estrategia in vitro, el ADN genómico a partir de Enterobacter sp. YSU se digiere con una endonucleasa de restricción que reconoce sitios fuera del transposón. El ADN se ligó y se mezcla con la transposome en un tampón que contiene Mg 2+. Después de la recombinación entre el transposón y fragmentos genómicos aleatorios, E. coli cepa pir ECD100D se transforma con el ADN y se extendió sobre placas que contenían ampicilina o una sal metálica. Las colonias que crecen poseerán un nuevo plásmido que contiene el transposón situado junto al gen de resistencia del huésped. Para la in vivo strategy, Enterobacter sp. YSU se transforma con el transposome. Entonces, toda la reacción de transformación se cultiva en medio líquido LB-kan para seleccionar para una población grande, con inserciones de transposones azar. El ADN genómico se digiere con una endonucleasa de restricción que reconoce sitios fuera de la transposome, se ligó y se transformó en E. coli cepa pir ECD100D. Como en el método in vitro, los transformantes se extienden sobre placas de ampicilina o de metal. Una vez más, el plásmido resultante estará formado por el transposón insertado junto a un gen de resistencia. Estas dos estrategias tendrán éxito sólo si el gen de resistencia objetivo se puede expresar y está activo en el E. coli cepa.

Mutagénesis de transposón puede ser utilizado para identificar el número mínimo de genes de una cepa bacteriana requiere para 15,16 crecimiento. Se requieren dos transposomes contienen sitios loxP y diferentes marcadores de resistencia a antibióticos para esta estrategia icepa bacteriana na con una secuencia de genoma conocido. Después de los dos transposones integran, expresado recombinasa cre cataliza una reacción de recombinación entre los dos sitios loxP, eliminando regiones cromosómicas entre las inserciones de transposones. El conocimiento de la secuencia del genoma permite identificar qué genes son eliminados. La capacidad de crecer demuestra que los genes eliminados no son necesarios para el crecimiento. Esta técnica es mano de obra intensiva, y un genoma mínimo para el crecimiento usando esta estrategia todavía no se ha completado. Sin embargo, un estudio de mutagénesis de transposón automatizado de Pseudomonas aeruginosa usando secuenciación PCR estima que se requieren 300-400 genes para el crecimiento de esta bacteria en medio rico 14. Este estudio no utilizó el sistema de recombinasa loxP / CRE.

Los microbios con genomas mínimos son útiles para la biología sintética 17. Una cepa bacteriana con un mínimo de un genoma es especially útil para eliminar la producción de subproductos no deseados. Por ejemplo, Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) se utiliza para producir el biocombustible, butanol 18. Durante su crecimiento, esta cepa produce butanol al final de su fase de crecimiento exponencial justo antes de que entre en la fase estacionaria. En este punto, se vuelve sensible a butanol y otros productos de fermentación y forma endosporas latentes que dejan de sintetizar producto. Desde transposomes se han utilizado para estudiar Clostridium perfringens 3, puede ser posible utilizar un sistema de recombinasa transposome / loxP / cre similar a construir una cepa de C. acetobutylicum que carece de los genes para los productos de fermentación no deseados y la esporulación, pero contiene genes para una mayor tolerancia butanol. Esta cepa aumentaría el rendimiento del producto con contaminantes mínimos.

En resumen, este artículo de una revista de vídeo ofrece una completa step por descripción paso de los procedimientos utilizados para crear auxótrofos mediante mutagénesis de transposón. Cubre la introducción de la transposome por electroporación, la detección de mutaciones por réplica en placa, el rescate de los genes mutados por técnicas de clonación y la identificación de los genes interrumpidos por secuenciación de ADN. Esta técnica se puede utilizar para la identificación de la función de genes desconocidos o posiblemente para la construcción de una cepa bacteriana que puede ser utilizado en un proceso industrial.

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Disclosures

El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

El autor desea agradecer a todos mis estudiantes de pregrado de Investigación Independiente y todos mis estudiantes de posgrado Fisiología Microbiana que probaron mis ideas de mutagénesis de transposón durante los semestres de primavera 2010-2014. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Youngstown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

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References

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