Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

Immunology and Infection

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Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).

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Abstract

A fim de estudar a lesão pulmonar aguda humana e pneumonia, é importante para desenvolver modelos animais para imitar várias características patológicas da doença. Aqui nós desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar rato pela injeção intra-traqueal de bactérias Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ou PA). Utilizando este modelo, fomos capazes de mostrar a inflamação pulmonar na fase inicial da lesão. Além disso, alveolar leakiness barreira epitelial foi observada por análise de lavagem broncoalveolar (BAL); e morte celular alveolar foi observada por ensaio de Tunel usando tecido preparado a partir de pulmões lesionados. Numa fase posterior, após lesão, observou-se proliferação de células necessário para o processo de reparação. A lesão foi resolvida 7 dias a partir do início do P. injecção aeruginosa. Este modelo imita o curso seqüencial de inflamação pulmonar, lesão e reparação durante pneumonia. Este modelo animal clinicamente relevante é adequado para estudar patologia, mecanismo de reparação, fepois lesão pulmonar aguda, e também pode ser utilizado para testar potenciais agentes terapêuticos para esta doença.

Introduction

Os pulmões são expostos a agentes patogénicos ambientais e são susceptíveis a inflamação e lesão 1-3. Durante condições patológicas como pneumonia ou Síndrome da Angústia Respiratória Adulto (SARA), patógenos, bem como fatores inflamatórios liberados por leucócitos induzir lesão e morte das células alveolares 1-3. É importante para o desenvolvimento de modelos animais de lesão pulmonar aguda para facilitar o estudo de lesões da patologia, bem como mecanismo de reparação.

Atualmente, a maioria das pessoas usam hiperóxia e bleomicina rato induzida modelos de lesão pulmonar 4. No entanto, os mecanismos de hiperoxia causado um prejuízo não são o mesmo que a maioria das lesões pulmonares comuns que ocorrem durante a pneumonia ou ARDS 5. Bleomicina lesão aguda induzida é raro em um contexto clínico 4. Aqui nós relatamos um modelo de lesão pulmonar mouse usando a injeção intra-traqueal de P. aeruginosa 6,7. Este modelo é clinicamente relevante, e imita a processes que acontecem após pneumonia 8.

Como um patógeno oportunista, nosocomial de indivíduos imunocomprometidos, P. aeruginosa normalmente infecta o trato pulmonar, urinário, queimaduras, feridas, e também causa outras infecções sanguíneas 6. A bactéria liberta virulência fator exotoxina A, multiplicar e desencadear respostas imunes 6. Administração intra-trachael de P. aeruginosa reflecte a situação em exposição humana para as bactérias que causam a pneumonia e a patologia é provável que seja diferente do modelo de lesão pulmonar induzida por vírus da gripe H1N1 recentemente relatado 9. Desde P. aeruginosa é um agente patogénico oportunista, é relativamente seguro de manusear em comparação com alguns dos agentes patogénicos mais virulentas. Aqui utilizou-se a injecção intra-traqueal para administrar as bactérias porque observou-se que este método introduzido mais bactérias na região distal alvéolos do pulmão em comparação comalguns outros procedimentos, tais como a utilização de um cateter através da boca.

Em comparação com outros modelos de lesão pulmonar aguda, o P. aeruginosa modelo descrito é apropriado para o estudo de lesão pulmonar induzida por bactérias e por inflamação excessiva. Ao contrário de outros modelos animais que utilizam P. aeruginosa a indução da sepse 10,11, aqui vamos usar a injeção intra-traqueal destas bactérias para induzir localizada lesão pulmonar aguda.

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Protocol

As experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal e Comitês de Biossegurança Institucional da Universidade de Illinois, em Chicago.

NOTA: Todos os procedimentos que envolvem pseudomonas deve ser realizada com Nível de Biossegurança 2 práticas (BSL2), que incluem mas não estão limitados a: máscara, protecção para os olhos, vestido ou macacão, luvas e duplas. Trabalhar em certificado de Biossegurança Gabinete. Trate instrumentos em contato com bactérias com desinfetante à base de lixívia ou cloro dióxido de carbono. Use uma caixa selada para amostras de transporte.

1. P. aeruginosa Cultura e Crescimento

  1. Loja P. aeruginosa PA103 como um estoque bacteriana em uma tampa de rosca frasco de congelação a -80 ° C.
  2. Colocar o frasco em um rack em uma caixa com 70% de etanol molhada toalhas de papel e levar para o laboratório de Nível de Biossegurança 2 (BSL2).
  3. Streak as bactérias em placas de agar de sangue de ovelha e crescer a 37 ° C durante ~ 15 horas numa incubadora. Em um capuz BSL2, arranhar as bactérias da placa com bactérias loop e ressuspender em 5 ml de PBS.
  4. Armazenar o estoque, a 4 ° C por até 3 meses. No entanto, determinar o título de cada 2 semanas.
  5. Serialmente dilua as bactérias em PBS (geralmente de 1:10 a 1:10 4 7) e para fora da placa de diluição conhecido em placas de agar de sangue de ovelha.
  6. Incubar as placas durante ~ 15 h. Contagem das colónias e calcular unidade formadora de colônia (UFC) para determinar a concentração de bactérias.
  7. Ressuspender as concentrações apropriadas (~ 5 x 10 3 CFU / ul) em 0,5 ml de PBS em 1,5 ml estéreis criotubos com tampa de rosca. Vedar as cryovials e colocá-los em um rack cryovial em toalhas de papel carregado desinfetantes em uma caixa de encaixe da tampa.
  8. Transportar a caixa para BSL2 biotério. Uma vez lá, abra a caixa no armário BSL2.

2. P. aeruginosa instilação

  1. Realize assepticamente cirurgia sobrevivência (luvas estéreis, instrumentos esterilizadose as técnicas assépticas). Use um campo estéril para fornecer uma superfície de trabalho para (autoclavados) instrumentos cirúrgicos estéreis. Esterilizar instrumentos usando um esterilizador quente talão entre cada procedimento instilação traqueal.
  2. Pesar ratinhos antes da anestesia. Anestesiar ratos com cetamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), em 0,1-0,2 ml de PBS por via intraperitoneal (ip). Determinar a eficácia do anestésico por não responsividade ao dedo do pé pitada. Use uma pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
  3. Contenha camundongos em uma placa cirúrgica no gabinete BSL2.
  4. Identificar a área para o corte para baixo. Raspar nesta área e preparar a pele usando alternando álcool e iodo povidona compressas 3 vezes.
  5. Trate a área da incisão, com anestesia local (lidocaína), pois esta anestesia é suficiente para uma pequena cirurgia, como uma incisão na pele para acessar a traqueia.
  6. Adicione uma pequena incisão (aproximadamente 5 mm) na linha média do pescoço, e usar romba forceps para mover suavemente o músculo para o acesso à traquéia. Expor a traquéia por dissecção cirúrgica.
  7. Desenhe solução bactérias dentro de uma seringa descartável 1 ml com agulha 27 G. Para cada rato, administrar 20-30 ul de bactérias na concentração apropriada (até 10 5 CFU cada ratinho).
  8. Insira a agulha na traquéia. Injectar solução lentamente na traqueia.
  9. Assegure-se que os animais suspiros, que normalmente indica que a solução tenha atingido no pulmão.
  10. Fechar a ferida com suturas de monofilamento estéreis (6-0), sob condições assépticas.
  11. Use 0,1 mg / kg de buprenorfina por injecção subcutânea como analgesia no pós-operatório para controle da dor pós-cirúrgica.
  12. Assegure-se que o tempo necessário desde a indução da anestesia inicial à incisão de fecho é inferior a 15 min.
  13. Após a injeção, descarte de seringas e agulhas em um recipiente de risco biológico farelos apropriado.
  14. Trate os instrumentos cirúrgicos com DISI base de dióxido de cloronfectant durante 15 minutos, enxaguar e voltar para o laboratório para esterilização e reutilização quando necessário.
  15. Casa dos ratos individualmente em gaiolas limpas em ambiente quente.
  16. Confira no animal a cada 30 minutos até que ele recobra a consciência e começa a se mover; e, posteriormente, em intervalos de 12 h para os primeiros 3 dias pós-cirurgia.
  17. Manter os ratinhos na instalação de BSL2 animais ao longo da experiência. Certifique-se de que somente o tecido contido na caixa selada deixarem a instalação BSL2 animal. Se os ratinhos expressam qualquer um dos comportamentos moribundos (definida como dificuldade respiratória, letargia, insuficiência de deambulação em resposta à estimulação suave) em qualquer momento do estudo, os ratinhos eutanásia por inalação de CO 2 a partir de uma fonte mineral seguido por deslocamento cervical.
  18. Euthanize o assunto experimental por sangria sob anestesia.
    1. Recolhe tecido pulmonar de ratos submetidos a eutanásia. Realizar esses procedimentos em uma capa BSL2. Se necessário, transferir a amostra usando tubos vedados colocados em um rack em toalhas de papel carregado desinfetantes em uma caixa de tampa snap para posterior processo.

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Representative Results

A partir 24-72 h pós P. injecção aeruginosa, celularidade aumentada foi observada em secções de pulmão (Figura 1A-D). O pulmão começou a se recuperar a partir de 96 horas pós lesão (Figura 1E). Aos 7 dias pós-P. aeruginosa, alvéolos morfologia normal foi restaurado pela maior parte (Figura 1F). Seções usando pulmonares coloração Tunnel preparado em 24 horas pós P. aeruginosa mostrou a morte celular em células em alvéolos (Figura 1G-I). De forma a estudar o processo de reparação neste modelo de lesão, BrdU foi injectada nos ratinhos aos 3 dias pós-P. aeruginosa. Pulmões foram isolados em 5 horas após a injecção de BrdU e processados ​​para coloração de anticorpos BrdU. Como mostrado na Figura 1J e K, aumentou significativamente o número de células BrdU incorporados a 72 hr pós P. administração aeruginosa indicando hiperproliferação.

Para estudar a mudança na barreira pormeability e pós inflamação lesão, lavado bronco-alveolar (LBA) foram coletados em diferentes momentos postar P. injecção aeruginosa. A concentração de proteína no LBA foi significativamente aumentada em 48 horas pós P. aeruginosa injecção (Figura 2A), indicando leakiness barreira epitelial. Os números de células no BAL também aumentou significativamente em 48 horas pós P. aeruginosa injecção (Figura 2B), o que sugere uma resposta inflamatória. Em 4-5 dias após P. aeruginosa injecção, tanto o nível de proteína e o número de células BAL começaram a diminuir sugerindo recuperação (Figura 2A, B). Além disso, lisado de pulmão foram coletadas em diferentes pontos pós P. aeruginosa administração e o nível de proteína inflamatória de macrófagos 2 (MIP2), uma citoquina envolvida na atracção de neutrófilos 12, foi medida por ELISA. Consistente com os resultados da análise de LBA, MIP2 aumen nível significativamente sed em 48 horas pós P. injeção aeruginosa e retornou ao nível basal às 96 h pós P. aeruginosa injecção (Figura 2C). Além disso, as células de BAL foram fixadas em lâminas de vidro e submetidos a coloração de hematologia. Sem P. aeruginosa, havia apenas um pequeno número de monócitos no LBA (Figura 2D). Em contraste, a grande quantidade de neutrófilos estavam presentes no BAL isoladas em 48 horas pós P. aeruginosa injecção (Figura 2E). Por 96 horas pós P. aeruginosa injecção, a composição celular de BAL retornado para o nível de controlo (Figura 2F). Para resumir, os resultados da Figura 2 indicou uma resposta inflamatória neutrofílica aguda juntamente com o aumento da permeabilidade da barreira alvéolo e aumento nas concentrações de citocinas, que são todas as características da lesão pulmonar aguda 13. Em todas as experiências, que a injecção de soro fisiológico foi utilizado como controlo.

ve_content "> Parte dos dados, incluindo H e coloração E, BrdU, TUNEL, análise do LBA e medição de nível MIP2, foram previamente publicados 7. Neste artigo, estudamos o papel de FoxM1, um fator de transcrição, na reparação de lesão alveolar utilizando o modelo de lesão pulmonar P. aeruginosa descrito aqui 7.

A Figura 1
Figura 1. A histologia, morte celular e proliferação em P. aeruginosa rato mediada modelo de lesão pulmonar. Isolamento (AF) de pulmão, de corte e coloração H / E foram realizadas utilizando não P. aeruginosa-injectados (não-PA) pulmões de controlo (A), bem como pulmões em 24 horas (B), 48 horas (C), 72 horas (D), 96 h (E), 7 dias (F) pós P. aeruginosa emjecção (pós-PA). (GI) secções de pulmão foram preparados a partir de pulmões de controlo (G) e 24 h pós-P. aeruginosa injetado pulmões (H, I) e prossiga para o ensaio de TUNEL para detectar a morte celular. Cortes de pulmão foram coradas para o marcador de células epiteliais do pulmão Sp-C (azul), T1α (vermelho) para mostrar a morfologia e também manchado de TUNEL (verde). Setas em (H) indicam células TUNEL positivas. (J, K) BrdU foi injetado na não-P. aeruginosa injetaram em ratos (J) e 72 horas pós P. aeruginosa injetaram em ratos (K) por ip, os pulmões foram preparados em 5 horas após a injecção de BrdU e processados ​​para coloração de anticorpos contra BrdU (coloração verde). Barra de escala = 60 mm para AF, 50 um para G e H, 20 mm para I, e 100 um para J e K. Esta figura foi modificada de Liu 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2
Figura 2. alveolar permeabilidade da barreira e inflamação seguinte em P. aeruginosa dano pulmonar induzido. (A, B) BAL foi recolhido a partir de controlo e P. aeruginosa tratado pulmões. (A) A concentração de proteínas no LBA aumentou em 48 h pós P. injeção aeruginosa e diminuiu em 96 horas, a 5 dias após a P. aeruginosa injeção. (B) o número de células totais no BAL aumentou em 48 h pós P. injeção aeruginosa (B) e nível de controle retornei às 96 h pós P. injeção aeruginosa. (C) MIP-2 foram medidos nosing lisados ​​pulmonares isoladas de ratos controle, bem como ratos em 48 horas e 96 horas pós P. injecção aeruginosa. Os dados foram apresentados em média ± EP, n ≥ 3. (DF) As células foram centrifugadas a partir de BAL e fixados em lâminas de vidro e submetidos a coloração HEMA3. Um pequeno número de monócitos estavam presentes em LBA de ratinhos de controlo (D). Grande quantidade de neutrófilos estavam presentes no BAL isoladas em 48 horas pós P. injecção aeruginosa (E). Por 96 horas pós P. injecção aeruginosa, houve um pequeno número de monócitos no LBA (F). Barra de escala = 10 mm, estes resultados são representativos de pelo menos 5 experiências independentes. Esta figura foi modificada de Liu et al. 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O modelo de lesão pulmonar rato Pseudomonas que descrevemos aqui imita todo o processo de inflamação, lesão pulmonar, reparo e resolução que ocorrem após a lesão pulmonar aguda ou pneumonia. Ele tem vantagens únicas comparando com vários outros modelos de lesão em que é clinicamente relevante e relativamente seguro e fácil de manusear.

O passo crítico no processo é que a solução de injecção de bactérias tem de ser muito lento. Se a injecção for demasiado rápido, os ratinhos são propensas a morrer por estrangulamento. Depois de uma injeção de sucesso, os ratos costumam mostrar vários respira fundo e suspiro, o que ajudará as bactérias partículas entrar no pulmão.

A linhagem que usamos foi PA103 6. Um dos pontos críticos deste modelo é que o título de P. aeruginosa deve ser rigorosamente controlado. Lote de P. aeruginosa de origem diferente poderia mostrar diferentes graus de inflamação e danos, mesmo quandousado ao mesmo CFU. Portanto, recomenda-se que cada novo lote de bactérias ser testados quanto aos seus efeitos causadores (tais como inflamação, proliferação celular, etc.), e, consequentemente, ajustar o número de CFU para ser utilizado. Se a inconsistência dos resultados ocorre por meio de ações bactérias refrigerados, pode-se usar estoque fresco obtido por bactérias que crescem a partir de uma placa nova para cada experimento. Além disso, a fase de crescimento das bactérias e escolha de meios podem também ter um impacto sobre o efeito sobre a resposta do hospedeiro. Portanto, deve-se tomar cuidado para garantir que as inoculações bacterianas ocorrem durante a mesma fase do ciclo de crescimento bacteriano.

Pode haver uma diferença na resposta a P. aeruginosa por diferentes estirpes de ratinhos. A estirpe que foi utilizada uma mistura de C57BL / 6 e FVB / N. O P. adequado aeruginosa título deve ser determinada para diferentes linhagens de camundongos.

Um fator a considerar para este modelo éque o dano das bactérias não se limita a um tipo de célula. Por exemplo, células epiteliais, endoteliais, fibroblastos poderiam todos ter sido danificado. Por isso, este modelo não é adequado para estudar os efeitos do tipo de célula específico lesões pulmonares. As bactérias causam a morte das células do pulmão por estimulação de respostas inflamatórias, bem como através da secreção de toxinas no tecido 6. Bactérias vivas geralmente são apagados do pulmão dentro de 48 horas após a lesão 7,14. Uma alta concentração de bactérias mortas também pode causar danos por indução de respostas inflamatórias 15.

Os mecanismos de lesão pulmonar e reparação são susceptíveis de ser diferentes em resposta a diferentes tipos de lesão pulmonar. Portanto, é importante para comparar vários modelos de lesão. O P. aeruginosa modelo aqui descrito é uma boa adição para os outros modelos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine pharmaceutical grade
27 G needle Fisher 1482648
syringe Fisher 14823434 1 ml
scissors Fine Science tools
forceps Fine Science tools
suture  Fisher 19-037-526
Eye gauge, glove, gown
Biosafety Cabinet
chlorine dioxide based disinfectant Clidox
sheep blood agar plates  Medex supply HL-1160

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References

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