Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Denne undersøgelse blev udført med tilladelse fra delstaten Sachsen og Sachsen-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, i henhold til § 8 i den tyske lov om dyrebeskyttelse (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 celleisolering

1.1 Forberedelse af lårben og skinneben

  1. Bedøver musen ved hjælp af en isofluran koncentration på 5% ved fordampning isofluran i en lukket beholder. Når musen har stoppet i 3 sek, udføre cervikal dislokation.
  2. Desinficer bagbenene med ethanol (96%). Fjern hud og muskler og adskille knogler med en steril skalpel.
    1. Start med en lyskebrok hudincision og udvide snittet mod den mediale malleolus og udføre en cirkulær dissektion af huden rundt om den nedre kalv. Fjern huden på benene helt ved skrælning det proximalt.
    2. Tag quadriceps muskel fra lårbenet med en skarp skalpel, fjerne både de forreste peroneusog gastrocnemius muskelgrupper og disarticulate benet ved hofteleddet ved at finde og dissekere ledbånd.
    3. Start fortil og fortsæt omkring leddet ved forsigtigt at dreje benet og transecting ledbånd og dermed disarticulating leddet.
  3. Vask lårben og skinneben med 96% ethanol i mindst 90 sek for at sikre aseptisk cellepræparat. Fortsæt vaskeprocessen med sterilt PBS at skylle resterende ethanol.
    Bemærk: Alle efterfølgende trin skal være sterile for at undgå forurening.

1.2 Høst af knoglemarv

  1. Skær den proximale og distale ende af hvert ben med et par fine saks til at få adgang til de femorale og tibiale aksler. Vær forsigtig med dette skridt, da disse knogler bryde meget let.
  2. Skyl knoglerne med varmt medium (M199 + 10% føtalt kalveserum (FCS), + 1% penicillin / streptomycin). Brug en steril 28-G kanyle, en 1 ml sprøjte og mellem 10-15 ml medium prknogle til skylning.
  3. Hold ben med en fin pincet og skyl en efter en, indtil det bliver halvgennemsigtigt. Anvendelse forsigtigt tryk til enden af ​​sprøjtestemplet for at minimere celle stress.
  4. Filter knoglemarven gennem en 70 um nylon web og filtratet samles. For at udtrække den maksimale mængde knoglemarv, skylles flere gange fra de distale og proksimale ende.
  5. Skyl sigten med PBS, og filtratet samles. Løsne forsigtigt snavs og cellulære konglomerater ved forsigtig omrøring og pipettering.

1.3 Dyrkning

  1. Centrifugeres cellesuspensionen ved 250 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes med ca. 25 ml af medium. Gentag en gang.
  2. Resuspender cellerne i 6 ml medium efter det andet vasketrin. Bland 50 pi af cellen opløsning med 50 pi trypanblåt. Tæl cellerne i et tællekammer under et lysmikroskop. Beregn antal Calen i opløsningen ved hjælp af denne formel:
    Ligning 1
  3. Seed cellerne på 6-brønds ultra-low-fastgørelsesflade plader for at forhindre permanent vedhæftning til bunden af ​​pladen. Brug en koncentration på 10 6 celler pr ml med op til 6 ml per brønd.
  4. Suppler suspensionen med 20 ng / ml M-CSF for at fremme celledifferentiering.
  5. Dyrkning af cellerne i 5 dage ved 37 ° C og 5% carbondioxid og observere dagligt.

1.4 Høst af celler

Bemærk: Disse trin skal udføres på is. Fortsæt med enten 1.4.1 eller 1.4.2 i overensstemmelse hermed.

  1. På dette tidspunkt, at udnytte hele den kultur, herunder differentierede makrofager, der vil overholde kultur plader, selv om de er ultra-low-fastgørelsesflade plader.
    1. Udnytte hele kulturen ved forsigtig pipettering og frigørelse med en opløsning af 4 ° C PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA. Gentag indtil pladerne er fri for resterende klæbende celler - bekræfte under et mikroskop, hvis usikker.
  2. Alternativt kasseres adhærente makrofager ved at høste supernatanten med cellerne i suspension, der overvejende indeholder monocytter.
    1. Høst de ikke-adhærente celler med en opløsning af EDTA-fri PBS og 0,5% BSA. Brug ikke for meget kraft for at undgå løsner mildt vedhængende makrofager.

1.5 FACS-analyse (ekstraudstyr)

Bemærk: Det er muligt at udtømme cellesuspension af CD117 + stem- og progenitorceller ved anvendelse af MACS. Brug producentens protokoller til denne procedure.

  1. Høst cellerne ifølge enten trin 1.4.1 eller 1.4.2.
  2. Centrifuger cellerne ved 250 xg i 10 minutter ved 4 ° C og gentage dette trin igen.
  3. Resuspender mindst 250.000 celler i 300 pi FACS Buffer per probe.
  4. Overfør celle opløsning på en 96-brønds-plade (30 pi per brønd).
  5. Centrifugeres cellesuspensionen ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  6. Fjern supernatanten og tilsæt 25 pi antistof til hver brønd (brug fabrikanten fortynding).
  7. Farv cellerne med antistofferne (efter producentens protokoller for celle fænotypebestemmelse efter trin 1.5.1-1.5.6. Almindeligt anvendte markører for monocyt / makrofag identifikation omfatter CD11b, F4 / 80 (figur 3), CD115 (figur 2), og GR 1.
    Bemærk: For en yderligere beskrivelse af-løsninger, anbefales brug af markører som CD4, CD8a, CD11 c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G og CD192. Cellulære karakteristika blev tidligere beskrevet 12.
  8. Inkubér prober til 20 minutter ved 4 ° C.
  9. Centrifuger prober ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspender med 200 pi FACS buffer. Gentag ther trin to gange.
  10. Overfør prober i FACS rør og udfører FACS-analyse 12.
  11. Udfør FACS-analyse 12 på dag 0, 3 og 5 for at analysere celledifferentiering.

2. haleveneinjektion

2.1 Forberedelse

  1. Varm dyr på en varmeplade ved 37 ° C i ca. 10 min. Observere dyrene under opvarmning til genkende tegn på overophedning.
  2. Opslem monocytter, isoleret i trin 1.1- 1.4, i 150 pi NaCl, og indlæse cellerne i en 1 ml insulinsprøjte med en 30G nål. Let vortexes løsning, før du lægger sprøjten for at sikre alle monocytter injiceres. Altid håndtere celler på is for at undgå varme-medieret fastgørelse og aktivering af monocytter.

2.2 Fastholdelsesudstyr

  1. Undgå at forstyrre andre mus i buret, når du vælger en mus til intravenøs injektion.
  2. Placer musen i fastholdelsesanlæg. Undgå for meget prEssure og være omhyggelig med bagbenene. (Figur 4)
    Bemærk: Du kan også bruge generel anæstesi for at sikre stress fri håndtering af dyrene.
  3. Sørg for, at musen har plads til at trække vejret, før du lukker fastholdelsesanlæg.

2.3 Injection

  1. Desinficer injektionsstedet med desinfektionsmiddel. Spray på halen af ​​musen og lad stå i mindst 1 min.
  2. Stop venøs blodgennemstrømning af halen ved at anvende let tryk på den laterale hale side over injektionsstedet, for bedre synlighed af venerne.
  3. Drej halen 90 grader, før injektion. (Figur 5)
  4. Injicer i en 45 graders vinkel. Sprøjt langsomt og ikke mere end 5 pi per g for at undgå at skade dyr.
  5. Hvis der er en blister, som er et tegn på en mislykket injektion, ophøre omgående, og gentag injektionen mere proximalt.
  6. Stands blødning ved injektionsstedet side ved at anvende blid pressure i ca. 1 min.
  7. Ved afslutningen af ​​proceduren åbner retraktoren og placere musen i sit bur.
  8. Observer musen til 20 min for at sikre, at dyret ikke er blevet skadet ved injektion og brystleje opretholdes. Forlæng tiden for observation, indtil musen genvinder tilstrækkelig bevidsthed. Retur musen til selskab med andre dyr, når det er fuldt tilbagebetalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellen opløsning ekstraheres fra murine knoglemarv består af forskellige celletyper. De vigtigste celletyper er lymfocytter, granulocytter og monocytter. Celletyper kan estimeres ved størrelse og granularitet, der er vist i figur 1 for både native suspensioner og celler høstet efter 5 dages differentiering. Bemærk skiftende cellulære sammensætning under dyrkning. Nøjagtig klassificering af befolkninger skal dog regne med karakteristisk udtryk for cellulære markører.

Den vigtigste markør anvendes til at identificere celler af MPS-systemet er CD115, som fungerer som M-CSF-receptoren og udtrykkes specifikt på monocyt progenitorer, monocytter og makrofager. Det kan derfor ikke bruges til at identificere markante MPS-delmængder, men pålideligt kan skønne den absolutte mængde af celler drevet ind i monocyt / makrofag differentiering. Se Figur 2 for en tidslinje af CD115 ekspressionen i forskelligrentiering.

Løbetiden markør F4 / 80 er nyttig til at skelne juvenile monocytter og modne monocytter og makrofager. Makrofager udviser stærk udtryk for F4 / 80 sammenlignet på ungdomskriminalitet monocyt stamceller, som er negative for markøren. Modne monocytter viser mellemliggende ekspression af F4 / 80. En kombination af CD115 og F4 / 80 markører er således en mulig metode til at kvantificere og overvåge celledifferentiering (se figur 3).

Kombinationen af ​​CD115 og F4 / 80 er tilstrækkelig til rutinemæssig kultur observation og kvalitetskontrol før påføring af cellerne. En mere detaljeret gennemgang af knoglemarv-afledte monocytter på dag 5 i dyrkning bekræfter deres strukturelle og funktionelle egenskaber i konkordans til de af blodmonocytter perifere 12.

Det er vigtigt at fastsætte musen omhyggeligt i fastholdelsesanlæg undgå spændinger på halen. Begræns freedom bevægelighed så meget som muligt uden at inhibere vejrtrækning at lette injektionen.

Figur 1
Figur 1. Venstre panel:. Sammensætning celletyper på dag 1 i kultur Celletyper omfatter lymfocytter, monocytter og granulocytter. Højre panel: Bemærk den skiftende cellulære sammensætning under dyrkning. Cellepopulation omfatter monocytter og makrofager. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Tidslinje for CD115 ekspression under differentiering. Bemærk, at> 95% af alle celler CD115 positive efter 5 dages differentiering, hvilket indikerer, at langt Størstedelen af ​​cellerne er enten monocytter eller makrofager. Klassificeringen kan baseres på cellestørrelse og nøjagtighed, men specifikke cellulære markører er mere pålidelige. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Øget ekspression af monocyt / makrofag modenhed markør F4 / 80 Dag 5:. Bemærk udseendet af en befolkning med mellemliggende F4 / 80 udtryk, som er i overensstemmelse med monocyt fænotype. Dag 7:. Bemærk højre skift i F4 / 80-ekspression i overensstemmelse med makrofag modning Klik her for at se en større udgave af dette tal.

e 4 "src =" / files / ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Mus fastsat i harpiksstopperen for haleveneinjektion. Efter omhyggeligt fastholdende musen, rotere halen 90 grader indtil venerne er synlige på den dorsale side. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Skematisk tværsnit af mus hale. Billedet viser placeringen af fartøjer i mus hale. Arterierne (rød) er placeret på den ventrale og dorsale side, og venerne er på den laterale side af halen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en enkel og omkostningseffektiv metode til at isolere store mængder af murine monocytter fra knoglemarv. I sammenligning med andre protokoller der anvender perifert blod, der opnår monocyttal udbytter 5 af 1,4 x10 6, er vi i stand til at opnå højere udbytter med 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocytter fra en enkelt donor mus.

Når man overvejer udfordringer med denne metode, er det vigtigt at nævne muligheden for forurening, når de arbejder under ikke-sterile betingelser. Hvis skylning og de følgende vasketrin ikke følges korrekt, forurening med bakterier og svampe er sandsynlig. Derudover knoglemarv består af heterogene cellesuspensioner, herunder granulocytter, lymfocytter og erythroide celler. Normalt er disse celler forsvinde mellem dag 2 og 3 af dyrkning på grund af mangel på vækstfaktorer. Efter vækstfaktor drevet differentiering, makrofager er den største kilde til forurening. For at holde than antallet af makrofager lave og for at minimere differentieringen af ​​monocytter til makrofager, brug af ultralave fastgørelsesplader og vasketrinnene nævnt ovenfor, er kritisk.

Det er vanskeligt at identificere en markør, der udelukkende monocyt-specifikke. Interferens mellem markører nødvendiggør brug af mere end en markering, og der er variation i granulering og størrelse af celler i analysen cellesuspensioner. Markørerne og beskrivelser er vist i figur 1-3 er gode alternativer til repræsentative celletyper i kultur. Det kan være vanskeligt at skelne de forskellige celletyper, især efter dag 5. Det er derfor kritisk at anvende andre markører som CD115 og F4 / 80.

I betragtning af ekspansion af knoglemarvsceller under friktion-fri betingelser kan makrofag differentiering forlænges og udifferentierede monocytter kan ophobes. Makrofag differentiering indikerer forurening; Men due deres klæbende natur selv på ultra-lav-tilknytning dyrkningsmetoder overflader, kan de let kasseres mens kun høstes ikke-klæbende celler fra kulturen. I tidligere forsøg 1,3, har forurening af makrofager ikke ført til alvorlige kliniske bivirkninger. Histologisk oparbejdning af organer og muskler fra mus efter celle transplantation viste, at injicerede makrofager assimileret i organer som milt, lever eller lunge. Ligestilling af makrofager i disse organer viste ingen observerbare klinisk effekt i mus. Den molekylære mekanisme udløst af disse makrofager kan være interessante spørgsmål for yderligere undersøgelser.

Monocytter samt makrofager påvirker arteriogenese i perifer arteriel sygdom, især når de anvendes systemisk. Kliniske bivirkninger såsom emboli eller massiv systemisk inflammation kunne ikke observeres selv efter injektion af mere end 2,5 millioner monocytter, men disse celler kan udløse inflammation og potentielt forårsage alvorlige systemiske effekter. I humane studier, kan forventes at have klinisk betydning disse virkninger. Udløsning af arteriogenese kan påvirke tumorvækst eller diabetisk retinopati, og sådanne mulige systemiske virkninger af injicerede-løsninger skal undersøges i fremtidige studier.

Tidligere publikationer 9 beskrive forskellene mellem de karakteristika perifere blod- og knoglemarv-afledte monocytter, der forklarer, hvorfor egenskaberne af monocytter fra knoglemarv kan afvige fra dem, der er isoleret fra perifere blodceller.

Metoden til isolering er af klinisk interesse. Tegning blod i stedet for at udvinde human knoglemarv er mere praktisk i forbindelse med klinisk medicin. Det er vigtigt at passe på dyrenes velfærd og til at anvende analgesi, hvis nødvendigt. Til intravenøs injektion, er det afgørende at øve håndtere både dyret og sprøjten på samme tid. Hvis en enkelt animal undergår flere injektioner, kvaliteten af ​​venerne og huden af ​​halen lide.

Trods disse ulemper, denne metode er meget nyttigt til at studere adfærd og karakteristika af monocytter. Forsøg inden for aterosklerose, immunologi eller betændelse kan drage fordel af denne metode. Kun 30 minutter kræves fra udvinding af knoglemarv til podning af celler på 6-brønds ultra-low-fastgørelsesflade plader. Etiske problemer minimeres, fordi højt udbytte af denne protokol minimerer antallet af dyr, der kræves som celle donorer. Denne nye metode vil være nyttigt for mange undersøgelser med monocytter.

Vi har været fokuseret på terapeutiske forøgelse af sikkerhedsstillelse vækst fartøj via transplantation af monocytter. Den multifaktoriel karakter af denne proces kan forklare, hvorfor enkelt faktor tilgange til forstærkning af arteriogenese har genereret blandede resultater 13,14. Dette har ført til isøgelse af cellebaserede behandlingsformer. Autolog knoglemarvstransplantation afledte stamceller og stamceller er blevet identificeret som potentielle celler til transplantation, men kun moderate kliniske fordele er rapporteret 15. Udover forskning i dosering, isolation metoder, og administrationsveje, er stadig behov for yderligere forskning for at bestemme den optimale celletype. En ulempe ved autolog celletransplantation kunne være deres manglende evne til at aktivere den medfødte og / eller adaptive immunrespons, og begge er kritiske for arteriogenese. Øget lokal inflammation kan repræsentere det bedste incitament til arteriogenese 16.

Intravenøs injektion af monocytter er en fælles metode til celletransplantation i musemodeller, hvis der ønskes systemisk lægemiddeltilførsel. På grund af systemiske effekter, kan bivirkninger forekomme så godt. Sørg for, at venen er målrettet til injektion. Det er almindeligt at forveksle arterier og vener, især når intravenøse stærkt pigmenteret mice. Arteriel injektion kan forårsage emboli, som fører til systemiske problemer i omløb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15, (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391, (2), 72-82 (2006).
  3. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5, (2), 155-169 (2013).
  4. Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103, (7), 2668-2676 (2004).
  5. Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
  6. Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
  7. Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99, (5), 1517-1526 (2002).
  8. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43, (6), 367-371 (1981).
  9. Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359, (1-2), 1-10 (2010).
  10. Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28, (6), 766-772 (2007).
  11. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
  12. Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59, (9), 813-825 (2011).
  13. Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108, (4), 753-761 (2009).
  14. Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55, (1), 17-25 (2009).
  15. Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53, (2), 445-453 (2011).
  16. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3, (2), e000611 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats