İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge
Published 12/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wagner, M., Koester, H., Deffge, C., Weinert, S., Lauf, J., Francke, A., et al. Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes. J. Vis. Exp. (94), e52347, doi:10.3791/52347 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Bu çalışmada hayvansal koruma (24D-9168,11-1 / 2008-24) Alman Yasanın 8. göre, Saksonya ve Saksonya Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle Devlet izni ile yapıldı.

1 Hücre İzolasyonu

Femur ve Tibia 1.1 Hazırlık

  1. Kapalı bin izofluran vaporizing bir% 5 izofluran konsantrasyonu kullanılarak fare anestezisi. Fare 3 saniye hareket durduktan sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin.
  2. Etanol (% 96) ile arka bacaklarda dezenfekte. Cilt ve kasları çıkarın ve steril bir bisturi ile kemikleri ayırın.
    1. Inguinal cilt kesi ile başlayın, ve medial malleol doğru kesi uzatmak ve alt baldır çevresindeki deri dairesel bir diseksiyon. Proksimale soyma tamamen bacaklar cilt çıkarın.
    2. Keskin bir bisturi ile femur kuadriseps kas ayırın, ön Peroneus de kaldırabilirsinizve gastroknemius kas gruplarını bulma ve ligament diseksiyon ile kalça eklemi de bacak dezartikülasyon.
    3. Öne başlayın ve dikkatle böylece eklem disarticulating, bacak dönen ve ligament transecting ile ortak etrafında devam.
  3. Aseptik hazırlanmasını sağlamak için 90 sn arasında, en az% 96 etanol ile femur ve tibia yıkayın. Etanol kalan durulayın steril PBS ile yıkama işlemini devam edin.
    Not: Tüm takip eden aşamalar kirlenmesini önlemek için steril olmak zorundadır.

Kemik İliği 1.2 Hasat

  1. Femoral ve tibial milleri erişmek için ince bir makas her kemiğin proksimal ve distal ucu kesilir. Bu kemikler çok kolay kırılabilir, çünkü bu adımı dikkatli olun.
  2. Sıcak ortam ile kemik yıkayın (M199 +% 10 fetal dana serumu (FCS), +% 1 Penisilin / Streptomisin). Bir steril 28 G iğne, bir 1 ml şırınga ve 10-15 mi medya başına arasında kullanındurulama için kemik.
  3. Ince forseps ile kemik tutun ve yarı-saydam olana kadar teker teker yıkayın. Dikkatle hücre stresi en aza indirmek için, enjektör pistonunun ucuna baskı uygulanır.
  4. 70 mikron naylon web üzerinden kemik iliği Filtre ve süzüntü toplamak. Kemik iliği, azami miktarda çıkarmak için, uzak ve yakın uçlarında tekrar tekrar yıkayın.
  5. PBS ile elek durulayın ve süzüntü toplamak. Dikkatle enkaz ve nazik karıştırma ve pipetleme hücresel holdingleri yerinden.

1.3 Yetiştirme

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve orta yaklaşık 25 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Kez tekrarlayın.
  2. Ikinci yıkama aşamasından sonra, ortam, 6 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tripan mavisi 50 ul hücre çözeltisinin 50 ul karıştırın. Bir ışık mikroskobu altında bir sayım odasında hücreleri sayın. C sayısını hesaplayınBu formül kullanılarak çözelti içinde arşın:
    Denklem 1
  3. Plakasının tabanına kadar kalıcı yapışmasını önlemek için bir 6-çukurlu ultra-düşük-bağlantı yüzeyi tabakalarına hücreleri Tohum. Oyuk başına en fazla 6 ml, ml başına 10 6 hücre konsantrasyonuna kullanın.
  4. Hücre farklılaşmasını teşvik etmek için 20 ng / ml M-CSF ile bir süspansiyon Supplement.
  5. Kültür, 37 ° C de 5 gün süre ile hücre ve% 5 karbon dioksit ve hergün incelenmiştir.

Hücreler 1.4 Hasat

Not: Bu aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Buna göre 1.4.1 veya 1.4.2 ya devam edin.

  1. Bu noktada, ultra-düşük-bağlantı yüzeyi plakalardır bile, kültür plakalarına yapışacak farklı makrofajlar dahil olmak üzere, tüm kültür hasat edilir.
    1. Nazik pipetleme tüm kültür Hasat ve 4 ° C PB çözeltisi ile ayırmaS,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA. Emin eğer mikroskop altında teyit - plakaları yapışık hücrelerin kalan net kadar tekrarlayın.
  2. Seçenek olarak ise, esas olarak monositler içeren süspansiyon hücreleri ile süpernatant hasat etmek suretiyle yapışkan makrofajlar atın.
    1. Bir EDTA içermeyen PBS çözeltisi ve% 0.5 BSA ile yıkanarak yapışmayan hücreler hasat edilir. Hafif yapışık makrofajlar yerinden oynatmamaya önlemek için çok fazla kuvvet uygulamayın.

1.5 FACS-Analiz (İsteğe bağlı)

Not: MACS kullanılarak CD117 + stem- ve projenitör hücrelerin hücre süspansiyonu tüketmek için mümkündür. Bu prosedür üretici protokollerini kullanın.

  1. Ya 1.4.1 veya 1.4.2 adımları göre hücreleri Hasat.
  2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj hücreleri ve yine bu adımı tekrarlayın.
  3. FACS b 300 ul süspanse en az 250.000 hücreprob başına uffer.
  4. 96 oyuklu bir plaka (kuyu başına 30 ul) üzerine hücre çözeltisi aktarın.
  5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
  6. Süpernatantı ve her bir kuyu (kullanım üreticisi seyreltme) antikor 25 ul ekleyin.
  7. Adımdan sonra hücre feno üretici protokolleri takiben antikor ile (hücreler 1.5.1-1.5.6. Monosit / makrofaj tanımlanması için yaygın olarak kullanılan belirteçler CD11b, F4 / 80 (Şekil 3), CD115 içerir leke (Şekil 2), ve GR- 1.
    Not: Hücre çözümleri ilişkin ayrıntılı bilgi için, CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, LY6C, Ly6G ve CD192 gibi belirteçlerin kullanılması tavsiye edilir. Hücresel özellikleri önceden 12 tarif edilmiştir.
  8. 4 ° C'de 20 dakika için sondalar inkübe edin.
  9. Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de problar ve FACS tamponu içinde 200 ul süspansiyon haline getirin. Tekrar inciiki adım olduğunu.
  10. FACS tüpler içine sondaları aktarın ve FACS analizi 12 gerçekleştirin.
  11. Hücre farklılaşmasını analiz için 0, 3 ve 5, FACS analizi 12 yapın.

2. Kuyruk Ven Enjeksiyon

2.1 Hazırlık

  1. Yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir ısıtma plakası üzerinde hayvanlar ısıtın. Aşırı ısınma işaretleri tanımak ısınırken hayvanları gözlemlemek.
  2. NaCI 150 ul, adım 1.1- 1.4 izole monositler, süspanse edin ve bir 30G iğne ile 1 ml insülin şırınga içine hücreleri yükleyin. Hafif tüm monositler enjekte sağlamak için şırınga yüklemeden önce çözüm vorteks. Her zaman ısı aracılı eki ve monositlerin aktivasyonunu önlemek için buz üzerinde hücreleri ele.

2.2 frenleyici

  1. Damardan enjeksiyon için bir fare seçerken kafes Diğer fareler rahatsız kaçının.
  2. Süzgeç içine fare yerleştirin. Çok pr kaçınınessure arka bacaklarda dikkatli olmak ve. (Şekil 4)
    Not: Alternatif olarak, hayvanların stres ücretsiz kullanımını garanti etmek için genel anestezi kullanın.
  3. Fare koruyucularını kapatmadan önce nefes için yer olduğundan emin olun.

2.3 Enjeksiyon

  1. Dezenfeksiyon maddesi ile enjeksiyon yerinde dezenfekte edin. Fare kuyruğu Sprey ve en az 1 dakika bekletin.
  2. Damarların daha iyi görüş için, enjeksiyon yerinde yukarıdaki yan kuyruk tarafına hafif basınç uygulayarak kuyruk venöz kan akışını durdurun.
  3. Enjeksiyon öncesinde, kuyruk 90 derece çevirin. (Şekil 5)
  4. 45 derecelik bir açıyla enjekte. Yavaş yavaş enjekte ve g başına en fazla 5 ul zarar hayvanlar önlemek için.
  5. Başarısız bir enjeksiyon bir işaretidir bir kabarcık, varsa, derhal bırakın ve daha proksimal enjeksiyonunu tekrarlamak.
  6. Nazik p uygulayarak enjeksiyon tarafında kanama durdurmayaklaşık 1 dakika boyunca basıncını kontrol edin.
  7. Prosedürün sonunda, toplayıcı açmak ve kafeste fare koyun.
  8. 20 dk hayvan enjeksiyonu zarar değildi ve sternum yatma muhafaza edilmesini sağlamak için fareyi gözlemleyin. Fare yeterli bilince kavuşur kadar gözlem süresini uzatın. Tam kurtarıldı sonra diğer hayvanların şirkete fare dönün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

fare kemik iliğinden elde edilen hücre çözeltisi çeşitli hücre tiplerinin oluşur. ana hücre tipi lenfositler, granülositler ve monositlerdir. Hücre tipi farklılaşma 5 gün sonra hasat hem doğal süspansiyonlar ve hücreler için Şekil 1 'de gösterilen boyutta ve ayrıntı ile tahmin edilebilir. Yetiştirilmesi sırasında değişen hücresel bileşim edin. Ancak, nüfusun doğru sınıflandırma hücresel belirteçlerin ayırt edici ifadesi güvenmek gerekir.

MPS-Sisteminin hücreleri tanımlamak için kullanılan en önemli işaretleyici M-CSF reseptörü olarak işlev görür ve özellikle monosit progenitörleri, monositler ve makrofajlar üzerinde ifade edilir CD115 vardır. Bu nedenle, farklı bir MPS-alt küme tanımlamak için kullanılabilir olmayabilir, ama güvenli bir monosit / makrofaj farklılaşması sürülen hücrelerinin mutlak miktarı tahmin edilebilir. Farklı sırasında CD115 ifade zaman çizelgesi için Şekil 2'ye bakınızayırt edilmesi.

vade işaretleyici F4 / 80 çocuk monositler, olgun monositler, makrofajlar ve ayırt etmek için yararlıdır. Makrofajlar işaretleyici için negatif monosit atalarıdır, yavru göre F4 / 80 güçlü ifadesini göstermektedir. Olgun monositler F4 / 80 ara ifadesini göstermektedir. CD115 ve F4 / 80 belirteçlerin bir kombinasyon, bu nedenle hücre farklılaşmasını (bakınız Şekil 3) ve niceleme izlenmesi için uygun bir yöntemi temsil eder.

CD115 ve F4 / 80 kombinasyonu önce hücrelerin uygulaması, rutin kültürü gözlem ve kalite kontrolü için yeterlidir. Yetiştirme 5 gün kemik iliği kaynaklı monosit daha ayrıntılı bir incelenmesi, periferal kan monositlerinden 12 kişilerce uyumlu olarak, yapısal ve işlevsel özelliklere teyit etmektedir.

Bu kuyruk üzerindeki gerilimi kaçınarak, süzgeç dikkatle fareyi düzeltmek için önemlidir. Freedo sınırlaenjeksiyon kolaylaştırmak için solunum inhibe etmeden mümkün olduğu kadar hareket m.

Şekil 1,
Şekil 1. Sol panel:. Kültürde gün 1 hücre tiplerinin bir bileşim hücre tipleri lenfositler, monositler ve granülositler içerir. Sağ paneli: ekimi sırasında değişen hücresel kompozisyon unutmayın. Hücre nüfus monositler ve makrofajlar içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Farklılaşma sırasında CD115 ifade Şekil 2. Timeline. Bütün hücrelerin bu>% 95 Not geniş olduğunu belirten farklılaşma 5 gün sonra pozitif CD115 vardır hücrelerin çoğunluğu, monositler veya makrofajlar ya da bulunmaktadır. Sınıflandırma hücre boyutu ve ayrıntı, ancak spesifik hücresel belirteçler daha güvenilir dayalı olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
. Monosit / makrofaj vade işaretleyici F4 / 80 Gün 5 ifadesi artırılması Şekil 3.: monosit fenotip ile tutarlı ara F4 / 80 ifadesi, bir nüfusun görünümünü unutmayın. 7. Gün:. Makrofaj olgunlaşma ile tutarlı F4 / 80 ifadesi, sağ-shift Not Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

e 4 "src =" / files / ftp_upload / 52.347 / 52347fig4highres.jpg "/>
Şekil 4. Fare, sonra dikkatlice fareyi frenleyici. Kuyruk ven enjeksiyon için süzgeç sabit venler dorsal tarafında görünür kadar kuyruk 90 derece döndürün. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Fare kuyruğu Şekil 5. şematik kesit. Resim fare kuyruğu içinde damarların yerini göstermektedir. arterler (kırmızı) ventral ve dorsal tarafında bulunan ve damarlar kuyruğun yan tarafında olan. bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kemik iliğinden sıçangil monosit büyük miktarda izole etmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem tarif eder. Monosit verimleri 5 x10 6 1.4 elde periferik kan kullanan diğer protokoller ile karşılaştırıldığında, biz tek bir donör fare 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monositlerin yüksek verim elde edebiliyoruz.

Bu yöntemle zorlukları göz önüne alındığında, bu steril olmayan koşullarda çalışırken kontaminasyon potansiyeli söz önemlidir. Durulama ve sonraki yıkama adımları, uygun bir şekilde, ardından bakteriler ve mantarlar tarafından kirlenme değilse olasıdır. Buna ek olarak, kemik iliği granülositler, lenfositler ve eritroid hücreleri dahil olmak üzere heterojen hücre süspansiyonları, oluşur. Normal olarak, bu hücreler, büyüme faktörleri eksikliği 2. günde ve yetiştirme 3 arasında kaybolur. Büyüme faktörü tahrik farklılaşma sonra, makrofajlar kontaminasyon önemli kaynağıdır. T tutmak içinve makrofajlar monositlerin farklılaşmasını en aza indirmek için, ultra düşük bağlanma plakalarının kullanımı ve yukarıda sözü edilen yıkama adımları kritik olan düşük makrofajların O sayısı.

Bu özel olarak monosit spesifik olan bir işareti tespit etmek güçtür. Işaretlerin arasındaki girişim birden fazla marker kullanımını gerektirir, ve değişkenliği hücre süspansiyonları analiz boyu ve hücre boyutu vardır. belirteçler ve Şekil 1-3 de gösterilen açıklamaları kültür temsili hücre tipleri için iyi alternatiflerdir. Bu gün 5. Bu nedenle CD115 ve F4 / 80 gibi diğer belirteçleri kullanmak için kritik özellikle sonra, çeşitli hücre tiplerini ayırt etmek zor olabilir.

Yapışma içermeyen koşullar altında kemik iliği hücrelerinin genişlemesini göz önüne alındığında, makrofaj farklılaştırma uzatılabilir ve farklılaşmamış monositler birikebilir. Makrofaj farklılaşması kirlenmesini ifade eder; Bununla birlikte, duSadece kültürden yapışkan olmayan hücreler hasat sırasında da ultra-düşük bağlanma yetiştirme yüzeyler üzerinde yapışkan tipte e, kolayca çıkartılabilir. Önceki deneylerde 1,3 yılında, makrofajlar tarafından kirlenme ciddi klinik yan etkilere yol açmamıştır. Organ ve hücre transplantasyonu sonrası farelerin kaslarının histolojik tetkik enjekte makrofajlar dalak, karaciğer veya akciğer gibi organlarda asimile olduğunu gösterdi. Bu organlarda makrofajların asimilasyon farelerde herhangi bir görünür klinik etkiler göstermiştir. Bu makrofajlar tarafından tetiklenen moleküler mekanizma ileri tetkikler için ilginç sorular olabilir.

Sistemik uygulandığında Monositler yanı sıra makrofajlar, özellikle, periferik arter hastalığı arteriogenesis etkileyebilir. Böyle emboli veya kitlesel sistemik inflamasyon gibi klinik yan etkiler daha fazla 2.5 milyon monositlerin enjeksiyonundan sonra gözlenen olamazdı, ama bu hücreler iltihap ve po tetikleyebilirtentially ciddi sistemik etkilere neden olabilir. İnsan çalışmalarda, bu etkilerin klinik öneme sahip muhtemeldir. arteriogenesis tetiklenmesi tümör büyümesini veya diyabetik retinopati ve gelecekteki çalışmalarda araştırılmalıdır enjekte hücre çözümleri gibi olası sistemik etkileri etkileyebilir.

Önceki yayınlar kemik iliğinden monositlerin özellikleri periferik kan hücrelerinden izole farklılık neden açıklamak periferik kan-ve kemik iliği kökenli monosit, özellikleri arasındaki farkları açıklar 9.

izolasyon yöntemi de klinik ilgi çekmektedir. Kan Çizim yerine insan kemik iliği açılan klinik tıp bağlamında daha pratiktir. Bu hayvanların refahı sonra bakmak ve gerekirse analjezi uygulamak önemlidir. Intravenöz enjeksiyonları için, hayvan ve aynı zamanda enjektör iki taşıma uygulama için çok önemlidir. Tek bir ani Eğermal çoklu enjeksiyon geçiyor, damarlar kalitesi ve kuyruk cilt acı.

Bu dezavantajlara rağmen, bu yöntem, davranış ve monositlerin özelliklerini incelemek için çok yararlıdır. Ateroskleroz, immünoloji ve enflamasyon alanına deneyler bu yöntem yararlanabilir. Sadece 30 dakika ila 6-çukurlu ultra-düşük-bağlantı yüzeyi tabakalarına hücre ekimi için, kemik iliğinin çıkartılmasından gerekmektedir. Bu protokolün yüksek verim hücre vericisi olarak gerekli hayvan sayısını en aza indirir, çünkü etik kaygılar, minimize edilir. Bu yeni yöntem, monositler içeren birçok çalışma için yararlı olacaktır.

Biz monositlerin nakli yoluyla kollateral damar büyüme terapötik büyütme üzerine odaklanmıştır. Tek faktör arteriogenesis güçlendirme oluşturulan karışık sonuçlar 13,14 yaklaşımlar neden bu sürecin çok faktörlü doğası açıklayabilir. Bu in yol açtıhücre bazlı terapiler araştır-. Otolog kemik iliğinden elde edilen kök ve projenitör hücre transplantasyonu için potansiyel hücreler olarak tespit edilmiştir, ancak sadece orta klinik yararlar 15 bildirilmiştir. Doz, izolasyon yöntemleri ve yönetim yolları üzerinde araştırmalar yanında, daha fazla araştırma hala optimum hücre türünü belirlemek için gereklidir. Otolog hücre transplantasyonu bir dezavantajı doğuştan ve / veya edinilmiş bağışıklık yanıtı etkinleştirmek için kendi yetersizlik olabilir, hem de arteriogenesis için kritik öneme sahiptir. Yerel inflamasyonu artırılması arteriogenesis 16 en iyi uyaran temsil edebilir.

Sistemik ilaç verme isteniyorsa monositlerin damardan enjeksiyon fare modellerinde içinde hücre transplantasyonu için ortak bir yöntemdir. Çünkü sistemik etkileri, yan etkileri de oluşabilir. Ven enjeksiyon için hedeflenen emin olun. Özellikle yoğun pigmentli mikrofon enjekte arterler ve venler, şaşırtmak için ortakör. Arter enjeksiyon dolaşımda sistemik sorunlara yol emboli neden olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well-ultra-low-attachment plate Corning Incorporated, NY, USA 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile
8- 12 week old, male, balb/c mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine GE Healthcare, Freiburg, Germany Fraction V, pH 7.0
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 28G, 30G
CD115 eBioscience, San Diego, USA 12-1152
CD11b eBioscience, San Diego, USA 53-0112
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany With cap, steril
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%  Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80 AbD Serotec, Düsseldorf, Germany MCA497APC
FACS buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3
FACS device Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA BD FACS Canto II
FACS tubes     Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1 eBioscience, San Diego, USA 53-5931
Heating plate  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Incu safe
Isofluran Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Mechanical shaker IKA, Staufen, Germany ms2 minishaker
Medium 199 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria Warm in 37 °C water bath before use
Micro test tubes Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Monocyte wash buffer  Manufactured by our group with single components PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer Various
NaCl Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany pH 7.4, sterile
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µl/100µl/200µl/1,000µl
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 1 ml Omnifix® -F insuline syringe
Tubes with cap Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany 15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany Julabo SW22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15, (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391, (2), 72-82 (2006).
  3. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5, (2), 155-169 (2013).
  4. Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103, (7), 2668-2676 (2004).
  5. Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
  6. Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
  7. Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99, (5), 1517-1526 (2002).
  8. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43, (6), 367-371 (1981).
  9. Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359, (1-2), 1-10 (2010).
  10. Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28, (6), 766-772 (2007).
  11. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
  12. Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59, (9), 813-825 (2011).
  13. Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108, (4), 753-761 (2009).
  14. Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55, (1), 17-25 (2009).
  15. Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53, (2), 445-453 (2011).
  16. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3, (2), e000611 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats