Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding. J. Vis. Exp. (96), e52576, doi:10.3791/52576 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Кожа является самым большим органом тела. Это создает барьер между внешней средой и внутренними органами. Кроме того, кожа защищает организм от потери жидкости, воздействия окружающей среды, травм и инфекций и помогает регулировать температуру тела 1. Из-за его открытом месте, кожа часто зависит от механического, термического или химического травмы. Хотя кожа, как правило, способны самовосстановления, несколько местные факторы, такие как инфекции, оксигенации и венозного достаточности может привести к нарушению заживления ран. Заживление ран может быть также препятствуют системных факторов, как ожирение, алкоголизм, курение, лекарства, питание и заболеваний, таких как диабет. 2

Процесс заживления ран можно разделить на три фазы: (I) воспалительной фазы, (II) пролиферативных и (III) фазы ремоделирования. По травма кожи, комплексный сигнал-каскад начинается, что приводит к закрытию раны. 3После травмы, раны кровотечение и сгусток крови формируется. Фибробласты двигаться в сгусток крови и заменить его новой ткани, которая впоследствии перестроенный в течение многих лет.

Современное понимание биологических процессов, лежащих кожного ремонта ограничено. Маленькие животные и свиньи модели были использованы для изучения заживления ран. Тем не менее, эти результаты не могут быть непосредственно переданы для человека из-за различий видоспецифичных. В дополнение к этим моделям в естественных условиях, некоторые аспекты заживления ран могут быть изучены путем имитации раны ситуацию с помощью царапин в пробирке монослойных культур на основе иммортализованных клеточных линий или первичных клеток. 4 Эти царапин модели, являются высоко стандартизованными, но не в достаточной степени отражает Комплекс в естественных физиологии. 5 Кроме двумерных моделей, трехмерные человека эквивалентов кожи были разработаны для дерматологических исследований. Кожная часть из этих моделей GEnerated, используя различные каркасы в том числе decellularized дермы, 6 коллагена гидрогели, 7,8 гликозаминогликанов 9 или синтетических материалов. 10 Используя эти эквиваленты кожи, роль эпителиальных-мезенхимальных взаимодействий 11, реэпителизацию, сотовый перекрестные помехи между фибробластов и кератиноцитов и Влияние различных факторов роста могут быть изучены. Кроме того, эти модели являются полезными, чтобы получить новые знания о том, как фибробласты мигрируют в раненого области и как хемотаксический факторы влияют на регенерацию тканей. 12

Не только поколение самой модели заживления раны является сложной задачей, но и установить максимально стандартизированные рана в модели является проблематичным. Общие методы, чтобы создать раны от царапин тесты, 13 ожоги, 14 ленты истиранию, 15 термическое повреждение, 16 всасывающие волдыри, 17 жидкий азот, 18 лазеров, 19 18 meshers 6 и биопсия удары. 20 Большинство из этих методов имеет те же подводные камни. Травмы, осуществляемые вручную трудно стандартизировать и воспроизводить между многократными испытаниями. Размер, форма и глубина раны варьироваться в зависимости от исследований и тем самым отрицательно повлиять на качество исследовательских данных. Использование лазера для определенного ранения кожи может быть относительно легко стандартизировать, но приводит к тому, имитирующих ран ожога. Тепловая обработка с помощью лазера может привести к денатурации белка, агрегацию тромбоцитов или суда сужение, которое может привести к некротической ткани.

В качестве альтернативного подхода, мы разработали автоматизированную ранения устройство (AWD), которая позволяет нам создавать определенные и точные кожные раны в стерильных условиях. Ранении параметры, такие как глубина и скорость проникновения, а также оборотов буровой головки может регулироваться. В этом исследовании, мы совместили AWD с собственной разработки на полную толщину кожных эквивалентов (футыSE), что можно сравнить с протоколом, опубликованной Gangatirkar и др. 8 дермальный слой кожи эквивалента состоит из человеческих фибробластов кожи (HDF), которые встроены в коллагена I гидрогеля. На кожном слое, кератиноциты эпидермиса человека (НЕК) высевают. В течение двух недель на границе воздух-жидкость НЕК создать эпидермиса, состоящий из нескольких жизненно важных клеточных слоев и рогового слоя. Кроме того, поколения этой модели, это исследование показывает, использование AWD для создания определенным и точным раны в FTSE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: протокол предназначен для производства 24 полной толщины кожных эквивалентов. Человек кожные фибробласты и эпидермальные кератиноциты выделяли из биопсий кожи в соответствии с ранее опубликованной протокола. 21,22 было получено информированное согласие заранее и исследование было одобрено комитетом институциональные этики на человека исследований Юлиуса-Максимилиана университета Вюрцбурга (голосовать 182 / 10).

1. Производство кожного компонента

  1. Растворить коллагена с 0,1% уксусной кислоты до конечной концентрации 6 мг / мл. Для решения нейтрализации гел, смешивание 232,5 мл 2x DMEM, 7,5 мл фетальной телячьей сыворотки, 7,5 мл 3 М HEPES, 2,5 мл хондроитин сульфат (5 мг / мл). Держите гель нейтрализации раствора и раствора коллагена на льду. Рассчитать 500 мкл геля на эквивалент вставки / кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В гель нейтрализации раствора смешивают с двумя частями раствора коллагена препаRe двойном размере коллагена.
  2. Поместите 24 пластины в 24-луночный планшет.
  3. Ресуспендируют дермальные фибробласты человека (HDF) в 10 мл DMEM, центрифуге в течение 5 мин при 270 х г и подсчет клеток. Извлеките необходимое количество HDF (5 х 10 4 клеток на 500 мкл геля коллагена) и центрифуги клеток в течение 5 мин при 270 х г.
  4. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют HDF в 4 мл раствора геля охлаждали нейтрализации, не вызывая пузырьки воздуха. От этого шага убедитесь, что работать как можно быстрее, чтобы избежать преждевременного затвердевания геля коллагена.
  5. Ресуспендируют раствор с 8 мл раствора коллагена.
  6. Возьмите коллагена-Cell-смеси с многоступенчатой ​​пипетки и заполнить быстро 500 мкл смеси в каждой вставки. Инкубируйте гели в течение 20 мин в термостате (37 ° С, 5% СО 2), чтобы желе гели.
  7. Погрузите гели в 2 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) на лункуи инкубировать ее в течение 24 ч в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2).

2. Добавление человека кератиноцитов эпидермиса (НЕК)

  1. Удалить среду после 24 часов. Растворить фибронектина человеческий белок сверхчистой водой до конечной концентрации 50 мкг / мл. Обложка каждого кожных эквивалентную 25 мкл фибронектина решения. Инкубируйте гели в течение 30 мин в термостате (37 ° С, 5% СО 2).
  2. В то же время, ресуспендируют НЕК в 10 мл СРК-2 и установить концентрацию клеток до 1 × 10 6 клеток / мл с КГМ-2 готов + 5% FCS. Семена 1 × 10 5 клеток НЕК на каждый гель. Инкубируйте гели в течение 45 мин в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2), чтобы позволить клеткам прилипать.
  3. Погружать гелей КГМ-2 готового + 5% FCS и культуры их в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2).

3. Культура полной толщины кожных эквивалентов (FTSE)

  1. Культура FTSE в течение 6-7 днейв нисходящем FCS-концентрации (5%, 2%, и 0% FCS). Изменение среды каждые 2-3 дней с последующим низкой концентрации FCS. Для этого полностью удалить носитель и добавить 1,6 мл свежей среды.
  2. На 7-й день, удалить среду полностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к поверхности FTSE кончиком пипетки, делая так.
  3. Поместите каждой вставке в 1 лунку 6-луночного планшета с стерильным пинцетом. Добавить 1,5 мл воздушных перевозок среды на лунку, убедитесь, чтобы не замочить FTSE поверхность. Изменить среду каждые 2-3 дней для дополнительных 14 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: уровень заполнения среды до мениска FTSE.

4. Гистологический анализ

  1. Крепление и парафина вложение FTSE
    1. Удалить культуральной среды, передавать вставки в свежих 24-луночные планшеты и исправить ткани путем добавления 1,6 мл 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубировали ткани в течение 2 часов при комнатной температуре. Внимание! Paraformaldehyd является токсичным, манипулировать под вытяжкой. ПереводFTSE к ткани-вложение кассеты. Удалить остатки фиксатор промывкой водой и обезвоживают ткани с использованием концентрации этанола возрастанию.
    2. Разделите эквивалент кожи, вертикальном разрезе в середине. Поместите две части в парафин заполнено металлической основе формы с поверхностей разрезов вниз. Добавить кассету ткани в верхней части пресс-формы в качестве подложки.
    3. Вырезать 3-5 мкм ломтиками и они плавали на водяной бане 40 ° С в течение straitening, установите слайды на подходящих для микроскопа. Тщательно высушите ломтики.
  2. Окрашивание (IHC) гематоксилином и эозином (Н & Е) и иммуногистохимическое
    1. Место скользит в стойке и инкубируют в течение 1 ч при 60 ° С. Убедитесь, что парафин плавится. Пятно регидратации ломтиков с H & E в виде стандартного окрашивания обзора.
    2. Для H & E окрашивания подготовить 4x окрашивания стекла кюветы с ксилол, 3x этанолом 96%, 2x с этанолом 70%, 1x этанолом 50%, 4-кратным деионизированной воды, 1x гематоксилином, 1x HCl-еthanol (13,7 мл 1 М HCl объявления 200 мл 50% этанола), 1x вкладка вода, 1x эозином (1 г эозина в 100 мл деионизированной воды) и 2x 2-пропанола.
    3. Место слайды 10 мин в ксилол I и 10 мин в ксилол II к deparaffinize и увлажняет слайдов. Dip слайды 3 раза в этанол 96% I, 3x в этаноле 96% II, 3x в этаноле 70% и в 3 раза в этаноле 50%. Поверните слайды в деионизированной воде. Чтобы дифференцировать гематоксилин краситель, окуните 2x в HCl-этанол. Промыть в деионизированной воде. Для посинения, место слайды 5 мин на вкладке воды. Для окрашивания эозином, место скользит 1 мин в эозином и мыть после этого в деионизированной воде. Для обезвоживания, погружные скользит 2x в этаноле 70%, 2x в этаноле 96% и поместить их в течение 5 мин в 2-пропаноле I, в течение 5 мин в 2-пропаноле II, 5 мин в ксилоле Я и 5 мин в ксилоле II. После H & E окрашивания ядра клеток окрашиваются в синий, цитоплазмы и внеклеточного матрикса окрашивают в красный цвет.
    4. Для поиска антигена, удалите парафин в ксилоле и увлажняет дольки, окрашивания. Место ломтикив пароварке и готовьте парафина и Регидратированные ломтики в течение 20 мин в подогретые 10 мМ цитрат буфера (рН 6).
    5. Место слайды в стиральной буфера (PBS буфера + 0,5% Polysorbat 20) и кусочки круг с жидким репеллентом слайд-маркером или алмазной иглы.
    6. Поместите слайды в камере влажности. Блок эндогенной пероксидазы, путем добавления 100 мкл 3% раствора перекиси водорода на каждый срез. Внимание! Очень опасными в случае кожу и в глаза. Обращаться с индивидуальной защиты. Вымойте слайды в стиральной буфера.
    7. Применение первичного антитела и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть слайды три раза промывочным буфером. С этого образцы должны храниться в темноте.
    8. Использование биотин-стрептавидин системы обнаружения для обнаружения специфического антигена связывания антитела.
    9. Контрастное ядер с гематоксилином в течение 1 мин. Дегидрировать и смонтировать слайдов.
    10. Образцы изображение, используя обратную микроскопом.
<P CLASS = "jove_title"> 5. Травмы от использования устройства Автоматизированная ранив (AWD)

  1. Подготовка AWD по дезинфекции рабочей зоной с 70% этанола и ультрафиолетового света. Убедитесь, что буровой головки нужного размера (например, 1 мм) прилагается.
  2. Поместите их эквиваленты кожи в специально отведенных местах автоклавного образца несущей пластиной с помощью стерильного пинцета. Поместите образец несущую пластину в гнездо под буровой головки.
  3. Используйте программное обеспечение управления, чтобы задать ранив параметры следующим образом: спина скорость: 15000 оборотов в минуту; Проникновение: 1,5 мм; Привод: 100 Гц. Эти параметры должны быть определены для каждого типа образца индивидуально. Передача ранив параметры в AWD.
  4. Начните ранив процедуру. Снять образец несущую пластину из розетки. Передача раненых FTSE обратно в вставками, используемых для культивирования с использованием стерильного пинцета.
  5. Далее с культурой раненых FTSE в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2) для исследования регенерации. Альternatively, использовать модели для гистологического анализа в любое время.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изолированные HDF и НЕК различаются как по морфологии и экспрессии типичных маркеров. HDF показали типичную морфологию шпинделя-формы, в то время как морфология НЕК может быть описана булыжником морфологии. Клетки характеризуются иммуногистохимического окрашивания (рис 1), прежде чем использовать их для FTSE. HDF являются позитивными для виментина (рис 1А), маркера для фибробластов. Первичная НЕК высоко выразить ранней дифференциации белка цитокератин-14 (рис 1B), но почти не поздно дифференциация кератиноцитов белок цитокератин-10 (рис 1в).

После первичной культуры, мы отдельные клетки из культуры клеток колбы и использовали их для генерации FTSE. В FTSE культивировали в течение 7 дней при submers условия среды (рис 2А) с последующей 14 дней культуры в воздух-жидкость (рис 2б). Во время этого процесса, FЦе договор значительно. В течение 21 дней НЕК разрастаются (рис 2C-E). Изменяя средний уровень таким образом, чтобы поверхность модели подвергается воздействию воздуха и увеличением концентрации кальция, НЕК стимулируются к дифференцировке в многоклеточных эпидермиса, который состоит из нескольких жизненно важных слоев клеток кератиноцитов в различных состояниях дифференцировки и рогового слоя (рис 2E).

Сравнивая гематоксилином и эозином в FTSE (рис 2Е) с родной человеческой кожи (рис 2F), то становится очевидным, что FTSE имитирует гистологического архитектуры кожи. Это может быть дополнительно свидетельствует иммуногистохимического окрашивания (рисунок 3). HDF в коллагена I гидрогеля могут быть окрашены с первичными антителами против виментина (фиг.3А, Е). Кератиноциты образуют эпидермальный слой, состоящий из цитокератина-14 Позитиве клетки (фигура 3В, F) и в конце маркера дифференцировки цитокератин-10 выражается в супра-базальный слои (фиг.3С, G). Кроме того, роговой слой является положительным для Filaggrin (рис 3D, H).

После 21-дневного периода культивирования, AWD был использован для создания кожные раны в FTSE. Как показано на рисунке 4A, AWD построен в виде закрытого ящика-системы для обеспечения стерильных условий. На фиг.4В, схематический чертеж процессе ранении показано. FTSE закреплены на пластине образца несущей. Весь процесс ранения, в том числе от настройки параметров, таких как скорость опускания и оборотов бурильной головки (фиг 4D), а также глубина проникновения контролируется с помощью компьютера. Ранив процедура может быть отслеживают оптически через переднее окно или с помощью камеры высокого разрешения, который записывает все действия во время ранения Процедура. Размер, форма и глубина повреждения раны можно регулировать по отдельности (фиг 4C).

Рисунок 1
Рисунок 1. Характеристика клеток, используемых для строительства полных эквивалентов толщина кожи. Иммуногистохимическое окрашивание первичных фибробластов кожи человека для виментина (А) и эпидермальных кератиноцитов для ранней дифференциации кератин нити цитокератин-14 (B) и нити цитокератина поздно дифференциации -10 (С). Положительное окрашивание показано коричневого цвета. Масштабные полоски показывают 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

6 / 52576fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Изменение условий культивирования и созревания полной толщины кожи эквивалентов. Макроскопические фотографии полной толщины кожи эквиваленты культивировали в течение 7 дней при submers условий (А) и 14 дней на границе раздела воздух-жидкость (B). Сравнение гематоксилином и эозином полного толщины кожных эквивалентов в разных стадиях развития: через 7 дней (С), 14 дней (7 дней в воздух-жидкость, D) и 21 дней (14 дней на границе воздух-жидкость, Е). Гематоксилином и эозином нативного кожи человека (F). Масштабные полоски показывают 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

PG "/>
Рисунок 3. Характеристика полных эквивалентов толщина кожи Сравнение иммуногистохимического окрашивания всей толщине кожных эквивалентов. (- D) и родной коже человека (E - H) для виментина (A, E), цитокератин-14 (B, F), цитокератин-10 (C, G) и филаггрина (D, H). Масштабные полоски показывают 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Автоматическое Ранение устройства для контролируемого ранения на всю толщину кожных эквивалентов. Автоматизирован ранение устройство (AWD) обеспечивает стерильную Conditioнс во время контролируемого процедуры нанесения увечий (A). Подключенного компьютера (CPU) управляет AWD. Полные эквиваленты толщина кожи (ftSEs) размещаются на образец несущей пластиной (SCP), отклонения в морфологии образца уравниваются световой барьер (фунтов), который вызывает процедуру ранения. Форма раны зависит от используемого буровой головки (DH). Диаметр составляет от 1 мм (C, верхняя изображения) до 2 мм (C, ниже изображение). Процедура ранение контролируется и могут быть записаны для документации и управления качеством (D). Гематоксилин и эозином окрашенных сечение полный эквивалент толщины кожи раненого с автоматизированной ранив устройства с помощью 1 мм буровой головки (E). Все масштабные линейки показывают 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В пробирке клеток, как правило, расширены в двумерных клеточных культур, в которых клетки прилипают к пластиковой поверхности. Тем не менее, эти условия культивирования не отражают физиологическое трехмерные условий, в которых клетки растут в естественных условиях. Под трехмерных условиях, клетки могут образовывать природные вложения клетка-клетка и клетка-матрица и мигрировать в трех измерениях. Особенно в кожной заживления ран сходство ситуации в естественных условиях имеет решающее значение для сбора содержательных данных, как миграция клеток и формирование матрицы являются ключевыми элементами заживления ран.

Для того, чтобы имитировать эти условия, разработанные нами FTSE, которые состоят из первичных клеток человека и отражения как на кожу и эпидермальный слой кожи. В течение двух недель культуры на границе раздела воздух-жидкость, НЕК образуют эпидермис, состоящий из нескольких слоев кератиноцитов в различных фазах дифференциации и в роговом слое. Furthermore, кожный слой состоит из HDF, которые встроены в коллагена I гидрогеля. Во время культивирования, HDF реконструировать дермальный компонент, что приводит к значительной усадке моделей (фиг.2В).

Чтобы подготовить воспроизводимые и стандартизированные раны, мы разработали AWD. С компьютерным управлением машина может установить определенные и точные кожные повреждения (рисунок 4). В зависимости от предполагаемого исследований, глубина, форма и размер раны могут быть адаптированы. Тем не менее, из-за технических спецификаций AWD и морфологии FTSE, рекомендуется установить минимальную проникновение 100 мкм воспроизводимости. AWD работает в стерильных условиях в закрытой коробке-системы и все компоненты можно стерилизовать в автоклаве, дезинфицирующими растворами или ультрафиолетового света. В рамках подготовки к ранению процедуры образцы должны быть переданы на тарелку образца носителя. Эта пластина облегчаетТочное положение образцов. Кроме того, сцепление между образцом и пластиной образца несущей достаточно, чтобы образцы на месте во время процедуры ранении. Сама процедура ранение может контролироваться оптически с помощью переднего окна или с помощью камеры высокого разрешения, который записывает все шаги, крупным планом положении. В отличие от других систем, использующих лазеры, чтобы выкопать ткани для создания рану, AWD использует вращающийся бур. Таким образом, тепло не применяется во время процедуры, которая жизненно приработок, чтобы исследовать механические раны. Кроме того, конкретные формы буровой головки обеспечивает существенное удаление из раневого канала. Использование указанных выше ранены процедуры эмпирически определяемых параметров ранив можно регулировать в соответствии с конкретными физиологическими свойствами либо на FTSE или нативных препаратах кожи. Таким образом, любые нежелательные побочные эффекты, такие как непреднамеренного отсоединения эпидермальных слоев могут быть сведены к минимуму и воспроизводимым ранения выполняется с вероятностью успеха90%.

Это исследование показывает, что развитые FTSE частично имитировать ситуацию в естественных условиях кожи точно и, таким образом, могут быть использованы в качестве модели для заживления ран исследований. Хотя важные аспекты процесса заживления ран, таких как эффект сосудистой, сгусток крови и иммунной системы отсутствуют в модели, эпидермальный-мезенхимальных и клетка-матрица взаимодействия воспроизводятся в трехмерной высоко стандартизированной среде. Кроме того, мы могли бы показать, что AWD генерирует стандартные раны в моделях кожи. В сочетании обе технологии могут быть использованы для исследования заживления ран и эффект веществ и препаратов, которые поддерживают процесс заживления. Для того, чтобы более точно имитировать ситуацию в живом организме, FTSE может быть продлен на других клетках, таких как меланоциты, опухолевых клеток кожи или микро-сосудистых эндотелиальных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS PAA L11-003 0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma D8537
Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) Life Technologies 33016-015
Inserts Nunc 140627
6 well plate  Nunc 140685
24 well plate Nunc 142485
Microscope slides R. Langenbrinck 03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-092 89% (445 ml)
Fetal bovine serum Bio & Sell FCS.ADD.0500 10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2 Promocell  C-20111 89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack Promocell  C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine PAA G0001,3010 93% (232.5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-1g 1% (2.5 ml)
Fetal bovine serum Bio & Sell FCS.ADD.0500 3% (7.5 ml)
HEPES Sigma  H3375-1kg 3% (7.5 ml)
Skin model submers medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2 Promocell  C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack Promocell  C-39011
Fetal calf serum Bio & Sell FCS.ADD.0500 5%-2% (25 ml-10 ml) 
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack Promocell  C-39011 adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM) Sigma  C7902-500g 0.62% (3.1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS PD000KIT
Vimentin antibody Abcam ab92547
CK14 antibody Sigma  HPA023040-100µl
CK10 antibody Dako M7002
Filaggrin antibody Abcam ab81468
H&E staining:
Mayer´s Haemalaun AppliChem A0884,2500
Xylol Sigma Aldrich 296325-4X2L
Ethanol Sigma Aldrich 32205-4X2.5L
HCl Sigma Aldrich H1758-500ML
Eosin Sigma Aldrich E4009-5G
2-Propanolol Sigma Aldrich I9516-500ML
Mounting Medium Sigma Aldrich M1289-10ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
  2. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
  3. Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
  4. Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
  5. Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, (3), 372-381 (2006).
  6. Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14, (2), 203-209 (2006).
  7. Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43, (8), 747-756 (1994).
  8. Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2, (1), 178-186 (2007).
  9. Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36, (6), 791-800 (1998).
  10. El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25, (5), 2987-2996 (2004).
  11. Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112, (Pt 12), 1843-1853 (1999).
  12. Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16, (4), 559-567 (2008).
  13. Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99, (4), 197-207 (2007).
  14. Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80, (1), 69-74 (1998).
  15. Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131, (10), 1134-1138 (1995).
  16. Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274, (15), 10372-10381 (1999).
  17. Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15, (1), 9-10 (1950).
  18. El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84, (1), 102-112 (2004).
  19. Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7, (2), 99-110 (2004).
  20. Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10, (7-8), 1006-1017 (2004).
  21. Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81, (1 Suppl), 2s-10s (1983).
  22. Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
  23. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (10), 839-845 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics