एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक मात्रात्मक recombinase पोलीमरेज़ प्रवर्धन परख के विकास

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Crannell, Z. A., Rohrman, B., Richards-Kortum, R. Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control. J. Vis. Exp. (97), e52620, doi:10.3791/52620 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

मात्रात्मक न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन पर्यावरण, खाद्य जनित, और जल जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए और साथ ही नैदानिक ​​निदान के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) एचआईवी -1 वायरल लोड परीक्षण, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों का पता लगाने, और कई अन्य जीवों 1 के लिए स्क्रीनिंग के लिए जैसे न्यूक्लिक एसिड, की, संवेदनशील विशिष्ट, और मात्रात्मक का पता लगाने के लिए स्वर्ण मानक तरीका है - 3। वास्तविक समय qPCR के दौरान, प्राइमरों चक्र में रोगजनक डीएनए बढ़ाना, और एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रत्येक चक्र में नमूने में परिलक्षित डीएनए की राशि के लिए आनुपातिक है कि उत्पन्न होता है। रोगजनक डीएनए के एक अज्ञात एकाग्रता युक्त एक नमूना मानक नमूनों की प्रारंभिक डीएनए एकाग्रता और फ्लोरोसेंट संकेत एक निश्चित सीमा तक पहुँच जाता है, जिस पर समय (यानी, चक्र दहलीज, या सी टी) से संबंधित है कि एक मानक वक्र का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

4 विकसित किया गया है। इन प्लेटफार्मों आम तौर पर तेजी से परिणाम उपलब्ध कराने और कम खर्चीला है, सरल उपकरणों के साथ पूरा किया जा सकता है, जो एक कम, एकल तापमान, पर न्यूक्लिक एसिड बढ़ाना। , बिंदु का ध्यान अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से आकर्षक है मिनट में डीएनए amplifies जो जन प्रतिनिधि कानून, एक कम प्रवर्धन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) की आवश्यकता है, और दोष 5,6 की उपस्थिति में सक्रिय रहता है। 12 - जन प्रतिनिधि कानून assays के biothreat एजेंटों 7 के खाद्य विश्लेषण, रोगज़नक़ का पता लगाने, कैंसर की दवा स्क्रीनिंग, और पता लगाने सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए जन प्रतिनिधि कानून के उपयोग 13,14 सीमित किया गया है।

पिछले काम में, यह थानेदार थाWN कि वास्तविक समय मात्रात्मक जन प्रतिनिधि कानून (qRPA) 15 संभव है। इधर, एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल एक मानक वक्र, qPCR का उपयोग कर मात्रा का ठहराव के अनुरूप है कि एक विधि का उपयोग कर अज्ञात नमूने यों के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक जन प्रतिनिधि कानून का उपयोग करने के लिए प्रदान की जाती है। इस प्रोटोकॉल ठीक से कार्य कर रहा है प्रणाली सुनिश्चित करने के लिए एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) विकसित करने के लिए, साथ ही साथ एक सबूत की अवधारणा के रूप में एचआईवी -1 डीएनए का पता लगाने के लिए एक थर्मल cycler पर एक जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें। प्रशिक्षण डेटा का उपयोग कर एक मानक वक्र के निर्माण के लिए एक थर्मल cycler या माइक्रोस्कोप और डेटा विश्लेषण का उपयोग कर डेटा संग्रह भी विस्तृत है। अंत में, एक कस्टम स्क्रिप्ट के साथ मानक वक्र का उपयोग अज्ञात नमूने बढ़ाता के लिए विधि का प्रदर्शन किया जाता है। इस qRPA तकनीक अज्ञात सांद्रता के साथ नमूनों की मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है और पारंपरिक वास्तविक समय qPCR पर कई फायदे हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. कार्यक्रम वास्तविक समय qRPA प्रतिक्रियाओं के लिए थर्मल cycler

  1. थर्मल cycler सॉफ्टवेयर में एक नए प्रोटोकॉल बनाएँ।
    1. 1 मिनट के लिए 39 डिग्री सेल्सियस: एक पूर्व ऊष्मायन कदम डालें।
    2. एक दूसरा कदम जोड़ें: 39 डिग्री सेल्सियस के एक थाली पढ़ें द्वारा पीछा 20 सेकंड के लिए।
    3. अंत में, एक दूसरे कदम को दोहराता है कि 59 से अधिक बार के लिए जाना "" डालें।
    4. प्रोटोकॉल को बचाओ।
  2. सॉफ्टवेयर की 'थाली संपादक "टैब में एक नई प्लेट बनाएँ। जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रियाओं के स्थानों के लिए इसी थाली पर कुओं का चयन करें (यहाँ, उपयोग कुओं ए 1, ए 4-ए 8, बी 1, और बी 4-बी 8)।
    नोट: यह डेटा विश्लेषण एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है के रूप में कुओं (जैसे, "मानक", "एनटीसी") का नमूना प्रकार, निर्दिष्ट किया जाता है कि क्या महत्वपूर्ण नहीं है।
    1. केवल एचआईवी -1 डीएनए युक्त प्रयोगों के लिए, सभी कुओं के लिए "हेक्स" फ्लोरोफोरे का चयन करें। एचआईवी -1 डीएनए और एक आंतरिक सकारात्मक सह युक्त प्रयोगों के लिएntrol, "हेक्स" और सभी कुओं के लिए "परिवार" fluorophores दोनों का चयन करें। थाली को बचाओ।

2. एचआईवी -1 qRPA प्रयोगों के लिए तैयार

  1. QPCR के लिए के रूप में नामित pipettes, पिपेट टिप्स, vortexer, और मिनी अपकेंद्रित्र, जिसमें एक नामित पूर्व प्रवर्धन कार्यक्षेत्र में जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रियाओं इकट्ठे। जन प्रतिनिधि कानून के परिमाण के रूप में ज्यादा के रूप में दस आदेश से डीएनए की एक एक प्रति बढ़ाना कर सकते हैं (नहीं दिखाया डेटा), संभाल और एक नामित के बाद प्रवर्धन क्षेत्र में पद-प्रवर्धित डीएनए उत्पादों युक्त ट्यूबों के निपटान के।
    1. सभी पूर्व प्रवर्धन अभिकर्मकों और बाद प्रवर्धन उत्पादों के बीच संपर्क को रोकने के। पहले और सभी प्रयोगों के बाद पूर्व प्रवर्धन कार्यस्थान और 50% ब्लीच के साथ उपकरण स्प्रे। अतिरिक्त ब्लीच दूर पोंछने के लिए एक कागज तौलिया का उपयोग करें।
  2. क्रय आगे प्राइमर अनुक्रम 5'-TGG सीएजी जैसे टीसीए टीटीसी एसीए एटीटी TTA एएए GAA ने आग जी 3 'और प्राइमर अनुक्रम 5'-सीसीसी GAA AAT TTT GAA TTT टीटीजी TAA टीटी रिवर्सवाणिज्यिक डीएनए synthesizers से टी GTT TTT जी 3 '। जांच अनुक्रम 5'- टी जी सी बुनना बुनना जीटीसी टीएसी जैसे TCT टीटीसी सीसीसी खरीद [सिमा / हेक्स] जीसी [THF] सी [डीटी BHQ1] GTA सीसीसी सीसीसी AAT सीसीसी सी -3 'वाणिज्यिक स्रोतों से। का उपयोग करने से पहले 10 माइक्रोन की एकाग्रता में aliquots में 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी प्राइमरों और जांच स्टोर।
    नोट: qRPA परख एक अद्वितीय एचआईवी -1 अनुक्रम amplifies। इस सबूत की अवधारणा परख के लिए, सटन एट अल। लक्ष्य अनुक्रम 16 में शामिल है जिसके द्वारा वर्णित प्लाज्मिड pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr का उपयोग करें। QRPA प्रयोगों के लिए, प्लाज्मिड 8.0 पीएच में 10 मिमी Tris, 0.1 मिमी EDTA युक्त बफर में μl प्रति 1, 10, 10 2, 10, 3 और 10 चार प्रतियां युक्त aliquots में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत गया था, और एक एनजी / μl मानव जीनोमिक वाहक डीएनए (360,486)। इस वाहक डीएनए एकाग्रता एचआईवी -1 निदान 17 के लिए इस्तेमाल वाणिज्यिक सीरम डीएनए निष्कर्षण किट से प्राप्त डीएनए एकाग्रता के बराबर है। इन एचआईवी -1qRPA प्रतिक्रियाओं में टेम्पलेट्स एक मानक वक्र का निर्माण करने के रूप में dilutions के लिए इस्तेमाल किया गया।

3. एक एचआईवी -1 qRPA स्टैंडर्ड वक्र इकट्ठा

  1. कदम 2.1.1 में वर्णित के रूप में qRPA प्रतिक्रियाओं कोडांतरण से पहले, पूर्व प्रवर्धन कार्यक्षेत्र तैयार करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण में एक 96 अच्छी तरह से ठंड ब्लॉक रखें।
  2. 12 प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों तैयार:
    1. मैग्नीशियम एसीटेट, पुनर्जलीकरण बफर, और पूर्व प्रवर्धन कार्यक्षेत्र के लिए 12 जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रिया छर्रों ले जाएँ।
    2. मैग्नीशियम एसीटेट और कमरे के तापमान पर पुनर्जलीकरण बफर गला लें।
    3. विभाज्य एक microcentrifuge ट्यूब मैग्नीशियम एसीटेट की 32.5 μl (प्रतिक्रिया प्रति 2.5 μl)।
    4. एक 13x मास्टर मिश्रण तैयार करें। मास्टर मिश्रण के लिए एक अलग microcentrifuge ट्यूब पुनर्जलीकरण बफर के 383.5 μl (प्रतिक्रिया प्रति 29.5 μl) जोड़ें। मास्टर मिश्रण को nuclease मुफ्त पानी की 41.6 μl (प्रतिक्रिया प्रति 3.2 μl) जोड़ें। मास्टर मिश्रण भंवर।
    5. मैग्नीशियम aceta लौटें-20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए ते और पुनर्जलीकरण बफर।
    6. Photobleaching को कम करने के लिए अत्यधिक प्रकाश जोखिम से बचने, पूर्व प्रवर्धन क्षेत्र के लिए फ्रिज में से प्राइमर और जांच aliquots के हटो।
    7. आगे 10 माइक्रोन से प्रत्येक 27.3 μl जोड़ें और मास्टर मिश्रण करने के लिए प्राइमरों (प्रतिक्रिया प्रति प्राइमर प्रति 2.1 μl) रिवर्स।
    8. मास्टर मिश्रण को 10 माइक्रोन हेक्स लेबल एचआईवी -1 डीएनए जांच के 7.8 μl (प्रतिक्रिया प्रति 0.6 μl) जोड़ें।
    9. प्राइमरों लौटें और भंडारण करने के लिए जांच।
  3. धारा 1.2 में वर्णित थाली लेआउट मिलान, 2 कम वृद्धि 8 अच्छी तरह से पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स के 5 अभी तक सही ट्यूबों में से प्रत्येक में अब तक छोड़ दिया ट्यूबों के प्रत्येक और एक एंजाइम गोली में एक एंजाइम गोली जगह है।
  4. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब के लिए एक नया विंदुक टिप का उपयोग कर और गोली पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक कि धीरे टिप के साथ मास्टर मिश्रण और गोली क्रियाशीलता, एक एंजाइम गोली युक्त प्रत्येक ट्यूब मास्टर मिश्रण के 37.5 μl जोड़ें। बुलबुला formati को रोकने के लिए धीरे हलचलपर, और प्रतिक्रिया मात्रा के किसी भी हानि को रोकने के लिए ध्यान से टिप को हटा दें।
  5. सभी एंजाइम छर्रों मास्टर मिश्रण के साथ rehydrated किया गया है के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से 96 अच्छी तरह से ठंड ब्लॉक निकालते हैं। मास्टर मिश्रण ठंडा करने के लिए ठंड ब्लॉक में पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स रखें।
  6. मास्टर मिश्रण को ठंडा किया जाता है, धारा 1 में वर्णित प्रोटोकॉल और थाली के साथ थर्मल cycler सॉफ्टवेयर लोड।
  7. पीसीआर ट्यूब की तुलना में थोड़ा व्यापक होने का स्पष्ट प्लास्टिक सूक्ष्म सील चिपकने के दो स्ट्रिप्स में कटौती, और दो फ्लैट पीसीआर ट्यूब पट्टी पलकों निकालते हैं।
  8. (Microliter प्रति एचआईवी -1 प्लाज्मिड 0, 1, 10, 1, 10 2, 10, 3 या 10 4 प्रतियां युक्त) भंडारण से छह टेम्पलेट aliquots के निकालते हैं।
  9. उस टेम्पलेट एकाग्रता के लिए नामित ट्यूबों के लिए प्रत्येक टेम्पलेट के 10 μl जोड़ें। धीरे मास्टर मिश्रण और टेम्पलेट मिश्रण करने के लिए टिप के साथ समाधान सरगर्मी, प्रत्येक ट्यूब के लिए एक नया विंदुक टिप का उपयोग करें। मीटर करने के लिए सही स्थान पर टेम्पलेट जोड़ने के लिए सुनिश्चित करेंधारा 1.2 में वर्णित थाली लेआउट atch।
  10. Microcentrifuge के लिए एक पीसीआर ट्यूब पट्टी अनुकूलक जगह में है कि सुनिश्चित करें।
  11. एक qRPA प्रतिक्रिया युक्त ट्यूब पर रखा जाएगा कि प्रत्येक ट्यूब ढक्कन में मैग्नीशियम एसीटेट के 2.5 μl बांटना।
  12. धीरे वे पूरी तरह से सील नहीं कर रहे हैं और हटाया जा सकता है कि इस तरह की पीसीआर ट्यूबों के शीर्ष पर lids जगह है। मैग्नीशियम एसीटेट पलकों का पालन करना और ऊपर से स्पष्ट रूप से दिखाई जाएगी।
  13. पीसीआर ट्यूब धारक के प्रत्येक पक्ष में lids के साथ प्रत्येक पीसीआर ट्यूब पट्टी डालें। जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रिया की शुरुआत, lids के बाहर और जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रिया में मैग्नीशियम एसीटेट स्पिन करने के लिए minifuge का ढक्कन बंद कर दें। सभी बुलबुले समाप्त हो जाते हैं और सभी तरल प्रत्येक ट्यूब (लगभग 10 सेकंड) के तल में एकत्र किया जाता है जब तक अपकेंद्रित्र।
  14. जल्दी पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स को हटाने और qRPA प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए ठंड ब्लॉक करने के लिए उन्हें वापस।
  15. ध्यान से एयरोसोल गठन को रोकने के लिए पलकों को हटाने और कटौती के साथ प्रत्येक पीसीआर ट्यूब पट्टी सीलस्पष्ट सूक्ष्म मुहर फिल्म के टुकड़े।
  16. जल्दी थर्मल cycler के लिए चलने के लिए और प्लेट लेआउट (कुओं में A1-बी 8) मिलान स्थानों में थर्मल cycler में दो पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स लोड। , थर्मल cycler का ढक्कन बंद "शुरू भागो," क्लिक करें और प्रयोग के लिए एक फ़ाइल नाम नामित।
    नोट: निर्माता ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद नमूना आंदोलनकारी की सिफारिश की है हालांकि, इस कदम से इस विशेष परख के लिए आवश्यक नहीं है और हटाया जा सकता है।
  17. रन पूरा हो गया है के बाद, कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा प्रदर्शित करने के लिए "सेटिंग्स," "आधारभूत स्थापना," "कोई आधारभूत घटाव" का चयन करें। चयन करके एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा निर्यात "निर्यात", "एक्सेल में सभी डाटा शीट में निर्यात करें।" फाइल परिशिष्ट के साथ "मात्रा प्रवर्धन परिणाम" कच्चे वास्तविक समय प्रतिदीप्ति डेटा युक्त बनाया जाएगा।

4. एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण का विकास

  1. लक्ष्य नमूने में पाया जाने की संभावना नहीं है कि एक प्रजाति से एक डीएनए अनुक्रम का चयन करें। अनुक्रम लक्ष्य अनुक्रम की उस पीढ़ी के पक्ष में है, ताकि लक्ष्य amplicon से अधिक समय की जरूरत है।
    नोट: इस जीव रक्त में पाया जाने की संभावना नहीं है और एक अन्य परियोजना से प्रयोगशाला में उपलब्ध था, क्योंकि इस परख, क्रिप्टोस्पोरिडियम parvum, एक आंत्र परजीवी के लिए, आईपीसी अनुक्रम की पीढ़ी के लिए टेम्पलेट के रूप में सेवा करने के लिए चुना गया था। आईपीसी दृश्य उत्पन्न करने के लिए, निकालने और सी से डीएनए को शुद्ध parvum oocysts के रूप में कहीं 18 में वर्णित है।
  2. आगे खरीद (5'-TGG सीएजी जैसे टीसीए टीटीसी एसीए एटीटी TTA एएए GAA ने आग जी / एटीसी TAA GGA AGG कैग कैग जीसी 3 ') और रिवर्स (5'- सीसीसी GAA AAT TTT GAA TTT टीटीजी TAA TTT GTT TTT जी / टी जी सी TGG AGT एटीटी CAA से GGC अता -3 ') वाणिज्यिक स्रोतों से प्राइमरों। इस परख में इस्तेमाल आईपीसी पीसीआर प्राइमरों चित्र 1 में दिखाया गया है और भारतीय दंड संहिता टेम्पलेट विकास के लिए स्वतंत्र है कि एक क्षेत्र को शामिल कर रहे हैंएनए (जैसे, चित्रा 1 में बैंगनी सी parvum,) लक्ष्य जीव के लिए स्वतंत्र है कि और एक क्षेत्र (जैसे, एचआईवी -1, चित्रा 1 में नीला)।
  3. प्राइमरों और आईपीसी टेम्पलेट डीएनए का उपयोग करते हुए पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
    1. पोलीमर्स को छोड़कर निर्माता के निर्देशों के अनुसार Phusion उच्च फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ किट अभिकर्मकों का उपयोग कर 50 μl पीसीआर प्रतिक्रियाओं, इकट्ठे। डीएनए टेम्पलेट और Phusion बफर HF की 2 μl का प्रयोग करें।
    2. 98 डिग्री सेल्सियस, 62 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, और 72 डिग्री पर 30 सेकंड में 15 सेकंड के 40 चक्रों के बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के द्वारा पीछा 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म शुरू, के बाद प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए Phusion पोलीमर्स जोड़ें 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार के साथ सी। थर्मल साइकिल के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पकड़।
    3. एक 2% TAE agarose जेल पर जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नमूनों का विश्लेषण, और फिर से निकालने और microcentrifuge प्रोटोकॉल के साथ शामिल के अनुसार QIAquick जेल निकालना किट का उपयोग डीएनए को शुद्धकिट।
  4. QRPA का उपयोग कर बढ़ाना करने की क्षमता के लिए भारतीय दंड संहिता के उम्मीदवारों स्क्रीन।
    1. धारा 3 में वर्णित के रूप में भारतीय दंड संहिता (5'-AGG टैग टीजीए CAA से GAA ने अता एसीए अता कैग GAC [परिवार] टी [THF] टी [डीटी BHQ1 के लिए विशिष्ट एचआईवी -1 प्राइमरों, एक परिवार लेबल जांच का उपयोग, qRPA प्रतिक्रियाओं को तैयार ] 0 की GGT TTT GTA एटीटी GGA ए -3 '), और कुल, 10, 10 2, 10 3, दो प्रतियों में सभी सांद्रता का परीक्षण प्रतिक्रिया प्रति प्रत्येक आईपीसी के उम्मीदवार के 10 4, या 10 5 प्रतियां।
    2. सबसे लगातार amplifies और सबसे कम सीमा-की-खोज की है कि आईपीसी उम्मीदवार चुनें।
  5. आईपीसी डीएनए के इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एचआईवी -1 और आईपीसी सह बढ़ाना।
    1. पुनर्जलीकरण बफर के 29.5 μl, आगे प्राइमर [10 माइक्रोन] के जन प्रतिनिधि कानून के 2.1 μl, जन प्रतिनिधि कानून के 2.1 μl प्राइमर [10 माइक्रोन], रिवर्स एचआईवी -1 हेक्स के 0.6 μl: धारा 3 के लिए इसी प्रकार, प्रत्येक 50 μl प्रतिक्रिया में निम्नलिखित गठबंधन -labeled जांच [10 माइक्रोन], 10 μlएचआईवी -1 अलग सांद्रता में डीएनए, मैग्नीशियम एसीटेट के 2.5 μl, और एक एंजाइम गोली की। इसके बजाय आईपीसी परिवार लेबल जांच [10 माइक्रोन] के 0.6 μl, और आईपीसी डीएनए के 2.6 μl जोड़ने के लिए, कदम 3.2.4 में किया गया था के रूप में nuclease मुफ्त पानी की 3.2 μl जोड़ने का। QRPA अकेले आईपीसी डीएनए (प्रतिदीप्ति संकेत पीढ़ी की राशि के साथ नमूने द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति द्वारा उत्पन्न तुलना में अधिक है, जहां सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित लोद के साथ किया जाता है जब सीमा-की-खोज (लोद) है कि भारतीय दंड संहिता की एकाग्रता का प्रयोग करें कोई लक्ष्य डीएनए)।
    2. धारा 1.1 में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग नमूने सेते हैं।
    3. आईपीसी हर नमूने में बढ़ाना नहीं करता है, उच्च परिमाण के एक आईपीसी एकाग्रता एक आदेश के साथ प्रयोग दोहराए जाने पर विचार करें। एचआईवी -1 परख के लिए भारतीय दंड संहिता डीएनए के इष्टतम एकाग्रता 10,000 प्रतियां / μl है। या तो आईपीसी या एचआईवी -1 डीएनए प्रवर्धन अगर वहाँ नमूने वैध माना जाता है, जबकि आदर्श रूप से आईपीसी के लिए पहचाने जाने प्रवर्धन दर्शातीहर प्रतिक्रिया।

5. कई प्रयोगों से एक मानक वक्र बिल्डिंग

  1. धारा 3.13 के रूप में वर्णित प्रत्येक प्रयोग एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम को निर्यात किया गया है के लिए डेटा सुनिश्चित करें।
  2. ओपन और स्क्रिप्ट "JoVE_qRPA_standard_curve.m" चलाते हैं। सभी आदानों स्वचालित रूप से कमांड विंडो में कहा जाए। स्क्रिप्ट की पहल की है, के बाद उपयोगकर्ता स्वत: "डेटा फ़ाइलों की संख्या" को नामित करने के लिए कहा जाता है मानक वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया।
  3. कमांड विंडो में, फाइलों की संख्या दर्ज मानक वक्र और प्रेस का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा टाइप करें।
  4. कमांड विंडो में नमूनों की संख्या और (प्रत्येक प्रविष्टि के बाद Enter दबाने) प्रत्येक प्रशिक्षण फ़ाइल में प्रतिकृति की संख्या लिखें।
    नोट: धारा 1.2 में वर्णित थाली लेआउट में, विभिन्न सांद्रता के साथ छह नमूने और प्रत्येक नमूने की दो प्रतिकृति) थे।
  5. कमांड विंडो निम्नतम डी.एन. में टाइप करेंमें प्रवेश (log10 प्रतियों में) मानक वक्र बनाने के लिए और प्रेस करने के लिए इस्तेमाल एक एकाग्रता (धारा 1.2 में वर्णित थाली लेआउट के लिए, सबसे कम टेम्पलेट एकाग्रता '1' log10 प्रतियां है)।
  6. कमांड विंडो में लिखें (log10 प्रतियों में) प्रत्येक मानक के बीच एकाग्रता में अंतर तो प्रेस दर्ज करें (धारा 1.2 में वर्णित थाली लेआउट के लिए, एकाग्रता अंतराल '1' log10 प्रतियां है)।
  7. के लिए प्रेरित किया जा रहा है, कमांड विंडो में "ढलान दहलीज" टाइप करें और एंटर दबाएं।
  8. कमांड विंडो में, ", संख्या (जेड) सकारात्मक दहलीज के लिए पृष्ठभूमि के ऊपर मानक विचलन" टाइप करें और फिर Enter दबाएं। 1-5 Z श्रेणी के लिए विशिष्ट मूल्यों।
  9. निर्दिष्ट करें डेटा थर्मल cycler ('1') का उपयोग कर एकत्र किया गया था कि क्या, * झगड़ा माइक्रोस्कोप छवियों ('2'), या * संख्या '1', 'दो लिखकर .jpg माइक्रोस्कोप छवियों (' 3 '),' या '3' और पीressing दर्ज करें।
  10. एक नए आईपीसी सीमा निर्धारित करने के लिए या कहा जाए, तो क्रमशः ',' एन 'या' वाई 'टाइप करके दहलीज के लिए एक डिफ़ॉल्ट मान का उपयोग करने के लिए चुनें।
  11. अगला, मानक वक्र का निर्माण किया जाता स्प्रेडशीट फ़ाइलों में से प्रत्येक का चयन करें।
    नोट: स्क्रिप्ट तो स्वत: हेक्स और परिवार प्रतिदीप्ति डेटा आयात करेगा; प्रत्येक प्रतिक्रिया (प्रतिदीप्ति संकेतों हेक्स या परिवार चैनलों के लिए थ्रेसहोल्ड पार हो गई है, चाहे आईई) मान्य था कि क्या यह निर्धारित; एक घातीय, रैखिक के लिए आर 2 गुणांक निर्धारित करते हैं, और दूसरे क्रम बहुपद फिट; भूखंड मानक वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल हर नमूने के लिए "चक्र दहलीज बनाम log10 प्रतियां"; और फिर इनपुट मानकों के सभी फिर से दर्ज करने के लिए उपयोगकर्ता की आवश्यकता के बिना सत्यापन के प्रयोगों के लिए मानक वक्र के पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक चर युक्त एक स्प्रेडशीट फ़ाइल बनाएँ।

6. परख मान्यकरण और प्रयोग अज्ञात नमूनों की मात्रा का ठहरावस्टैंडर्ड वक्र

  1. ज्ञात सांद्रता के साथ नमूने का उपयोग करके परख की सटीक और सटीकता का अनुमान है या अज्ञात सांद्रता के साथ नमूने यों के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए स्क्रिप्ट "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" का प्रयोग करें।
    नोट: पहले प्रकाशित अनुसंधान एक घातीय फिट सर्वश्रेष्ठ आर चुकता गुणांक 18 झुकेंगे पता चला है कि क्योंकि यह स्क्रिप्ट मानक वक्र के लिए एक घातीय फिट का इस्तेमाल करता। फिट का एक अलग प्रकार वांछित है, तो स्क्रिप्ट तदनुसार संशोधित किया जा सकता है।
    1. ओपन और स्क्रिप्ट "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" चलाते हैं। स्क्रिप्ट की पहल की है, के बाद उपयोगकर्ता स्वचालित रूप से कमांड विंडो में सभी सूचनाओं में प्रवेश करने के लिए कहा जाता है।
    2. दर्ज '1' नाम से जाना जाता नमूना सांद्रता के साथ एक मानक वक्र का उपयोग कर एक परख के लिए मान्य है या दर्ज करने के लिए '2' अज्ञात नमूने यों की।
    3. जब संकेत दिया है, या तो एक बचाया मानक वक्र का चयन करें या वें दर्ज करके एक नया निर्माणस्वचालित रूप से कमांड विंडो में मांगा है कि ई जानकारी (धारा 5 से "JoVE_qRPA_standard_curve.m" स्क्रिप्ट के लिए आवश्यक है कि एक ही जानकारी)।
    4. प्रयोगों की संख्या लिखें (यानी, स्प्रेडशीट फ़ाइलें) की मान्यता / मात्रा का ठहराव के लिए विश्लेषण करने के लिए।

एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और एक गर्म चिप का उपयोग कर डेटा संग्रह के लिए 7. तैयारी

  1. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी जगह में एक चरण में हीटर और एक-चैनल प्रेसिजन उच्च स्थिरता तापमान नियंत्रक है सुनिश्चित करें।
  2. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सुनिश्चित करें उत्तेजित और प्रत्येक फ्लोरोफोरे से प्रतिदीप्ति एकत्र करने के लिए एक फिल्टर घन है। उत्तेजित और एक GFP फिल्टर (उत्तेजना बीपी 470/40 एनएम, उत्सर्जन बीपी 520/50 एनएम) के माध्यम से आईपीसी डीएनए प्रवर्धन के दौरान उत्पन्न परिवार प्रतिदीप्ति इकट्ठा। उत्तेजित और एक हेक्स फिल्टर (उत्तेजना बीपी 530/30 एनएम, उत्सर्जन बीपी 575/40 एनएम) के माध्यम से एचआईवी -1 डीएनए प्रवर्धन के दौरान उत्पन्न हेक्स प्रतिदीप्ति इकट्ठा।
  3. थर्मल cycler पर डेटा संग्रह को दोहराने के लिए एक स्वचालित एल्गोरिथ्म बनाने के लिए माइक्रोस्कोप स्क्रिप्ट संपादन सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
    1. सबसे पहले शटर बंद करने के लिए एक "सेटिंग" कदम डालें। अगले 60 सेकंड के लिए जोखिम स्थापित करने के लिए एक "जोखिम" कदम जोड़ें। 1 मिनट पूर्व ऊष्मायन अवधि को लागू करता है जो 60 सेकंड में देरी, अमल करने के लिए एक "तस्वीर" डालें। GFP फिल्टर करने के लिए काम कर रहे समूह को बदलने के लिए एक "सेटिंग" कदम जोड़ें। 200 मिसे के लिए जोखिम समायोजित करने के लिए एक और "जोखिम" कदम डालें। GFP या हेक्स फिल्टर क्यूब्स का उपयोग करते समय जोखिम 200 मिसे के लिए सेट कर दिया जाएगा।
    2. "जोखिम" कदम के बाद, एक "तस्वीर" जोड़ सकते हैं और छवि ले जाया जाएगा, जिसके साथ कैमरा निर्दिष्ट करें। एक प्रयोक्ता परिभाषित अस्थायी फ़ोल्डर में छवि को बचाने के लिए शटर और एक "छवि सहेजें" कदम बंद करने के लिए एक और "सेटिंग" कदम का प्रयोग करें।
    3. एक और "सेटिंग" कदम और वें का उपयोग कर हेक्स फिल्टर घन के लिए अगला स्विचएन, "तस्वीर" 200 मिसे, एक पर एक "जोखिम" जोड़ सकते हैं और एक "सहेजें छवि" कदम है।
    4. , बजाय 60 (करीब शटर के 20 सेकंड की एक शुरुआती देरी के साथ इस प्रक्रिया को 59 बार दोहराएँ 20 सेकंड, GFP फिल्टर घन के लिए स्विच, 200 मिसे के लिए सेट जोखिम इंतजार, तस्वीर, करीब शटर, हेक्स फिल्टर घन के लिए स्विच, सेट जोखिम, को बचाने के 200 मिसे के लिए,) स्नैप।
  4. QRPA प्रतिक्रियाओं का आयोजन करेगा कि एक चिप बनाएँ।
    1. माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रयोगों के लिए, फ़ाइल JoVE_qRPA_base.ai 100% बिजली, 10% की गति सेट करने के लिए एक लेजर कटर का उपयोग 1/8 "मोटी काले एक्रिलिक के एक पत्र से एक 40 x 15 मिमी आयताकार आधार कटौती करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
    2. अच्छी तरह से 1.5 मिमी मोटी स्पष्ट एक्रिलिक के एक पत्र से एक 5 मिमी व्यास परिपत्र छेद में कटौती के साथ एक 10 x 10 मिमी वर्ग से मिलकर प्रतिक्रिया में कटौती करने के लिए फ़ाइल JoVE_qRPA_well.ai का प्रयोग करें।
    3. Superglue जेल का उपयोग कर एक एकल आधार के लिए तीन कुओं अप करने के लिए संलग्न।
    4. सूखी रातोंरात।

8. डेटा संग्रह और analyबहन एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग

  1. स्वचालित डेटा संग्रह स्क्रिप्ट JoVE_AxioVision_Script.ziscript लोड करके डेटा संग्रह के लिए माइक्रोस्कोप तैयार करें।
    1. 48 डिग्री सेल्सियस के लिए मंच हीटर सेट और के बारे में 20 मिनट के लिए मंच हीटर पर प्रतिक्रिया चिप पहले से गरम। 48 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना अच्छी तरह से प्रतिक्रिया में 39 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखता है (डेटा) नहीं दिखाया।
    2. एक 10X, 0.45 एनए उद्देश्य का उपयोग, प्रतिक्रिया अच्छी तरह से जगह में GFP फिल्टर की अंदरूनी किनारे के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित। एक्रिलिक के किनारों लेजर काटने के बाद autofluorescent कर रहे हैं और आसानी से देखे जा सकते हैं। सभी डेटा एकत्र कर रहे हैं जब तक ध्यान केंद्रित करने के बाद, खुर्दबीन मंच की ऊंचाई को समायोजित नहीं है।
  2. कदम 4.5.1 में वर्णित के रूप में एक नामित पूर्व प्रवर्धन कार्यक्षेत्र में qRPA मास्टर मिश्रण इकट्ठा। प्रत्येक नमूना के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब में एक एंजाइम गोली, मास्टर मिश्रण है, और एचआईवी -1 डीएनए टेम्पलेट मिश्रण। पहले reactio मैग्नीशियम एसीटेट के 2.5 μl जोड़ेंn और संक्षेप में भंवर।
  3. जल्दी प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के लिए qRPA नमूना युक्त microcentrifuge ट्यूब परिवहन।
    1. ध्यान से अच्छी तरह से बुलबुले बनाने के बिना प्रतिक्रिया में जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रिया के 30 μl विंदुक। वाष्पीकरण को रोकने के लिए जन प्रतिनिधि कानून की प्रतिक्रिया पर पीसीआर ग्रेड खनिज तेल की एक बूंद रखें।
    2. अच्छी तरह से केवल केंद्र, नहीं ऑटो फ्लोरोसेंट एक्रिलिक किनारों के किसी भी छवि को ख्याल रख रही है, माइक्रोस्कोप उद्देश्य के नीचे अच्छी तरह से सीधे स्थिति। अच्छी तरह से तैनात है, के बाद स्क्रिप्ट परिवार फिल्टर घन और हेक्स फिल्टर घन हर 20 सेकंड का उपयोग कर एक छवि का उपयोग करते हुए एक जेपीईजी छवि उत्पन्न 7. स्वचालित स्क्रिप्ट चलाएँ।
  4. स्क्रिप्ट पूरी होने के बाद, अतिरिक्त नमूने चलाने से पहले अस्थायी भंडारण फ़ोल्डर के बाहर इन छवियों को हस्तांतरण।
    1. दो फ़ोल्डर बनाएँ: 1 प्रत्येक फ्लोरोफोरे (यानी, 'हेक्स' और 'परिवार') के लिए। एक ही मूल फ़ोल्डर में दोनों फ़ोल्डर स्टोर। प्रत्येक फ्लोरोफोरे मेंफ़ोल्डर, नमूना (जैसे, 0, 10, आदि) में मौजूद डीएनए प्रतियों की संख्या के साथ लेबल एक फोल्डर बना।
    2. 'हेक्स' फ़ोल्डर में इसी सबफ़ोल्डर में उपसर्ग 'हेक्स' के साथ सभी फ़ाइलों को हस्तांतरण। 'परिवार' फ़ोल्डर में इसी सबफ़ोल्डर में उपसर्ग 'GFP' के साथ सभी फ़ाइलों को हस्तांतरण।
  5. 0, 10, 10, 2 10 4 10 3, और 10 5 एचआईवी -1 डीएनए प्रतियों के साथ qRPA प्रतिक्रियाओं के लिए दोहराएँ धारा 8.2-8.4।
  6. एक प्रयोग में सभी qRPA नमूने के लिए डेटा इकट्ठा करने के बाद, स्क्रिप्ट से जब पूछा, "। JoVE_real_time_intensity_to_excel.m" स्क्रिप्ट लोड बदले में subfolders में प्रत्येक एकाग्रता के लिए छवियों होते हैं जो दो फ्लोरोफोरे फ़ोल्डरों, जिसमें मूल फ़ोल्डर का चयन करें।
    नोट: स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से हेक्स प्रतिदीप्ति डेटा एक पत्रक वियतनाम में सहेजा जाएगा, जिसमें मूल निर्देशिका में एक स्प्रेडशीट फ़ाइल उत्पन्न होगाएड 'हेक्स', और परिवार प्रतिदीप्ति डेटा 'परिवार' नाम की एक चादर में सहेजा जाएगा। प्रत्येक शीट में, चक्र संख्या कॉलम बी में सूचीबद्ध है, और टेम्पलेट की सांद्रता बढ़ाने के लिए वास्तविक समय प्रतिदीप्ति डेटा कॉलम आदि सी, डी, में दिए गए हैं। प्रत्येक वास्तविक समय प्रतिदीप्ति दत्त उस समय बिंदु पर कब्जा कर लिया छवि की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता है।
  7. कोशिकाओं बी 2 साजिश करने के लिए स्प्रेडशीट कार्यक्रम में डिफ़ॉल्ट तितर बितर साजिश समारोह का उपयोग करें: 'हेक्स' और 'परिवार' चादरों की H61 वास्तविक समय प्रतिदीप्ति कल्पना और आंकड़े 2A, 2 बी, 3 ए, और 3 बी में उन लोगों के लिए इसी तरह के भूखंडों उत्पन्न करने के लिए।
    नोट: कदम 8.6 में उत्पन्न स्प्रेडशीट भी लिपियों "JoVE_qRPA_standard_curve.m" और "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

लक्ष्य के साथ qRPA प्रयोगों में आईपीसी के रूप में सेवा करने के लिए एक दृश्य के चयन से पहले (एचआईवी -1) डीएनए, आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) के उम्मीदवारों उत्पन्न कर रहे हैं और एचआईवी -1 डीएनए उपस्थित बिना qRPA प्रतिक्रियाओं में बढ़ाना करने की क्षमता के लिए जांच की। आईपीसी उम्मीदवारों लक्ष्य (एचआईवी -1) बाहर प्रतिस्पर्धा एचआईवी -1 amplicon के गठन से आईपीसी के गठन को रोकने के लिए डीएनए की तुलना में अब कर रहे हैं। 2A चित्रा, दो सी की पीढ़ी में दिखाया गया है parvum आईपीसी उम्मीदवारों जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर 415 और 435 बी पी बैंड की उपस्थिति द्वारा सत्यापित किया गया था। 10 4 और 10 5 प्रतियां की कुल (चित्रा -2) मौजूद थे जब लंबे समय तक उम्मीदवार लगातार परिलक्षित करते हुए qRPA प्रतिक्रियाओं में, कम आईपीसी उम्मीदवार, छोटी प्रवर्धन (चित्रा 2 बी) का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, अब उम्मीदवार एचआईवी -1 qRPA प्रयोगों के लिए भारतीय दंड संहिता होने के लिए चुना गया था।

वास्तविक समय qRPA अकेले हित के लक्ष्य का उपयोग कर या का उपयोग किया जा सकता हैलक्ष्य और आईपीसी दोनों। चित्रा 3 एचआईवी -1 डीएनए और सी का उपयोग कर दोनों थर्मल cycler पर एक प्रयोग से पता चलता है parvum आईपीसी। इस प्रयोग में, आईपीसी डीएनए के 2.6 एक्स 10 4 प्रतियां एचआईवी -1 लक्ष्य डीएनए का पता लगाने की सीमा को प्रभावित करने से बचने के लिए, प्रत्येक प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए भारतीय दंड विधान की सीमा के करीब एक एकाग्रता के लिए जोड़ा गया था। वास्तविक समय एचआईवी -1 डीएनए पीढ़ी के लिए इसी हेक्स प्रतिदीप्ति डेटा को प्रदर्शित करता है जो चित्रा 3 ए, में प्रदर्शन के रूप में, पता लगाने योग्य प्रवर्धन शुरू होता है, जिस पर समय प्रारंभिक लक्ष्य एकाग्रता के विपरीत आनुपातिक है। इस प्रकार, प्रवर्धन एचआईवी -1 डीएनए की कम मात्रा के लिए पहले एचआईवी -1 डीएनए की उच्च सांद्रता के लिए और बाद में स्पष्ट है। शुरू करने आईपीसी एकाग्रता सभी नमूनों में ही है क्योंकि टी दौरान आईपीसी डीएनए पीढ़ी के लिए इसी परिवार प्रतिदीप्ति डेटा को प्रदर्शित करता है जो 3B चित्रा, के रूप में दिखाया इसके विपरीत, भारतीय दंड विधान के डीएनए का पता लगाने योग्य प्रवर्धन, पर लगभग एक ही समय शुरू होता हैएक ही प्रयोग वह। भारतीय दंड विधान से प्रतिदीप्ति पीढ़ी की दर की वजह से प्रवर्धन के दौरान प्रतियोगिता के लिए एचआईवी -1 डीएनए की एकाग्रता के विपरीत आनुपातिक है।

QRPA प्रतिक्रियाओं के साथ एक क्षेत्र प्रचलित प्रतिदीप्ति पाठक को विकसित करने के लक्ष्य के साथ qRPA प्रयोगों एक मंच हीटर और एक-चैनल प्रेसिजन उच्च स्थिरता तापमान नियंत्रक के साथ एक ईमानदार प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर प्रदर्शन किया जा सकता है। चित्रा -4 ए और 4 बी प्रदर्शन हेक्स और परिवार प्रतिदीप्ति डेटा एकत्र एक खुर्दबीन पर। लेजर कट चिप्स का उपयोग कर खुर्दबीन पर एकत्र आंकड़ों आधारभूत प्रतिदीप्ति और photobleaching के कारण हो सकता है कि crests और troughs में मामूली परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करता है। हालांकि, स्क्रिप्ट प्रारंभिक प्रवर्धन के बाद हुई है प्रतिदीप्ति में आधारभूत प्रतिदीप्ति या परिवर्तनशीलता से अप्रभावित है जो प्रारंभिक प्रवर्धन अवधि के दौरान प्रतिदीप्ति के परिवर्तन की दर का उपयोग कर चक्र दहलीज निर्धारित करता है। फाई के रूप में देखाgure 4C, इस प्रयोग से बनाया मानक वक्र 0.990 के एक अनुसंधान दो गुणांक है। उल्लेखनीय है कि भारतीय दंड संहिता केवल एचआईवी -1 डीएनए की कम मात्रा के लिए परिलक्षित होता है। इस व्यवहार थर्मल cycler पर प्रदर्शन प्रयोगों से भिन्न है, सभी नमूनों को अभी भी इस पद्धति का उपयोग वैध के रूप में वर्गीकृत किया जाता है।

नाम से जाना जाता लक्ष्य सांद्रता का उपयोग कर कई प्रयोगों से डेटा तो परख प्रदर्शन का आकलन या अज्ञात सांद्रता के साथ नमूने यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक मानक वक्र, के निर्माण के लिए संकलित किया जा सकता है। 5 स्क्रिप्ट का उपयोग कर उत्पन्न पांच प्रयोगों और एक घातीय मानक वक्र से डेटा से पता चलता है पहचाने जाने प्रवर्धन शुरू किया, जिस पर समय के लिए प्रारंभिक एचआईवी -1 लक्ष्य एकाग्रता से संबंधित "JoVE_qRPA_standard_curve.m"। 5 चित्रा एक मानक वक्र का निर्माण करने के लिए 5 अलग प्रयोगों, प्रत्येक टेम्पलेट एकाग्रता में प्रत्येक युक्त दो qRPA प्रतिक्रियाओं का इस्तेमाल किया। घातीय कि नोटफिट 0.959 के एक उच्च आर 2 गुणांक है। मानक वक्र तो स्क्रिप्ट "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" स्क्रिप्ट। तालिका 1 चित्रा 5 में मानक वक्र का उपयोग 5 अतिरिक्त प्रयोगों के लिए मात्रा का ठहराव परिणामों से पता चलता का उपयोग परख सत्यापन के लिए जाना जाता है सांद्रता के साथ अतिरिक्त नमूनों की सांद्रता भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ध्यान दें कि एल्गोरिथ्म सही ढंग से नकारात्मक रूप में नहीं, लक्ष्य-नियंत्रण के नमूने में से 10 से बाहर के रूप में सकारात्मक और 9 एचआईवी -1 डीएनए युक्त सभी नमूनों में वर्गीकृत। इसके अलावा, औसत भविष्यवाणी की एकाग्रता सही एकाग्रता की भयावहता और भविष्यवाणी की सांद्रता के लिए मानक विचलन के एक आदेश कम से कम 0.5 LOG10 (प्रतिक्रिया प्रति प्रतियां) किया गया था के भीतर था।

चित्र 1
चित्रा 1:। मात्रात्मक जन प्रतिनिधि कानून डीएनए लक्ष्य की ब्लॉक आरेख QRPएक परख ("जन प्रतिनिधि कानून आगे 'और' जन प्रतिनिधि कानून रिवर्स") बाँध प्राइमरों के लिए जो समान दृश्यों से घिरे दो डीएनए दृश्यों amplifies। प्रवर्धित दृश्यों "एचआईवी -1 जांच" और 2) एक आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण अनुक्रम ("भारतीय दंड संहिता (सी parvum)") के साथ पता चला है कि 1) एचआईवी -1 जीनोम ("एचआईवी -1" के भीतर एक दृश्य) कर रहे हैं "। भारतीय दंड विधान की जांच के साथ" पता चला है कि प्रत्येक प्रतिक्रिया में शामिल आईपीसी सी के पूरक एक क्षेत्र शामिल है कि एक टेम्पलेट और प्राइमरों ("आगे पीसीआर" और "पीसीआर रिवर्स") के रूप में क्रिप्टोस्पोरिडियम parvum जीनोम का उपयोग करते हुए पीसीआर के माध्यम से उत्पन्न किया गया parvum (बैंगनी) और एचआईवी -1 (नीला) के पूरक एक क्षेत्र। मूल रूप से एनालिटिकल कैमिस्ट्री 2014 में प्रकाशित चित्र, अनुमति 9 के साथ यहाँ reprinted।

चित्र 2
चित्र 2: (ए) के दो आईपीसी उम्मीदवारों ('फॉरवर्ड शॉर्ट' और 'फॉरवर्ड लांग') और एक ज्ञात पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण अनुक्रम पीसीआर का उपयोग कर उत्पन्न और 415 बीपी और 435 बीपी बैंड दिखाई दे रहे थे, जहां एक agarose जेल, पर कल्पना थे । 10 4 और 10 5 प्रतियां की कुल मौजूद थे जब (सी) अब आईपीसी उम्मीदवार लगातार परिलक्षित करते हुए (बी) कम आईपीसी उम्मीदवार, वास्तविक समय जन प्रतिनिधि कानून के दौरान थोड़ा प्रवर्धन का प्रदर्शन किया। मूल रूप से यहां की अनुमति 9 के साथ reprinted एनालिटिकल कैमिस्ट्री 2014 में प्रकाशित चित्रा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सह-amp के दौरान उत्पन्न विशिष्ट कच्चे प्रतिदीप्ति डेटाएक थर्मल cycler पर एचआईवी -1 डीएनए और भारतीय दंड संहिता की lification। एचआईवी -1, पता लगाने योग्य प्रवर्धन की शुरुआत के लिए (ए), हेक्स प्रतिदीप्ति में एक स्पष्ट वृद्धि से दिखाया गया है, एचआईवी -1 डीएनए की उच्च सांद्रता के लिए पहले होता है। भारतीय दंड संहिता, परिवार प्रतिदीप्ति में एक स्पष्ट वृद्धि से दिखाया पता लगाने योग्य प्रवर्धन, की शुरुआत के लिए (बी), की परवाह किए बिना एचआईवी -1 डीएनए एकाग्रता की लगभग एक ही समय होता है। हालांकि, परिवार प्रतिदीप्ति पीढ़ी की दर की वजह से प्रतिस्पर्धा करने के लिए एचआईवी -1 डीएनए वर्तमान की राशि के विपरीत आनुपातिक है। मूल रूप से एनालिटिकल कैमिस्ट्री 2014 में प्रकाशित चित्र, अनुमति 9 के साथ यहाँ reprinted।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक खुर्दबीन पर एचआईवी -1 डीएनए और भारतीय दंड संहिता की सह-प्रवर्धन के दौरान उत्पन्न विशिष्ट कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा (ए) टी पर डेटा उत्पन्न करने के लिए भी इसी तरह।वह थर्मल cycler, हेक्स प्रतिदीप्ति में एक स्पष्ट वृद्धि से दिखाया गया है detectable एचआईवी -1 प्रवर्धन की शुरुआत, एचआईवी -1 डीएनए की उच्च सांद्रता के लिए पहले होता है। परिवार प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाए गए माइक्रोस्कोप पर (बी) आईपीसी प्रवर्धन, उच्च एचआईवी -1 डीएनए सांद्रता के साथ नमूनों में कम एचआईवी -1 डीएनए सांद्रता के लिए स्पष्ट नहीं है लेकिन हमेशा स्पष्ट है। (सी) एक मानक वक्र एक उच्च अनुसंधान दो गुणांक कि पैदावार JoVE_standard_curve.m लिपियों का उपयोग कर बनाया जा सकता है।

चित्रा 5
चित्रा 5:। एचआईवी -1 के लिए विशिष्ट मानक वक्र JoVE_standard_curve.m स्क्रिप्ट का उपयोग करना, कच्चे हेक्स प्रतिदीप्ति डेटा एचआईवी -1 प्रवर्धन के दौरान उत्पन्न अज्ञात के एचआईवी -1 डीएनए एकाग्रता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक मानक वक्र, निर्माण करने के लिए कार्रवाई की है नमूने हैं। इस मानक वक्र (जेड = 1) 5 experim से डेटा का उपयोग कर उत्पन्न किया गयापिता, जिसमें छह सांद्रता प्रत्येक एकाग्रता में दो प्रतिकृति का उपयोग कर परीक्षण किया गया। सभी सांद्रता log10 प्रतियों में दिया जाता है। मूल रूप से एनालिटिकल कैमिस्ट्री 2014 में प्रकाशित चित्र, अनुमति 9 के साथ यहाँ reprinted।

चित्रा 6
चित्रा 6:। एल्गोरिथ्म tunability एल्गोरिथ्म के मानकों को एडजस्ट अज्ञात नमूनों की एकाग्रता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल मानक वक्र बदल जाता है। JoVE_validation_and_quantification.m स्क्रिप्ट Z = 1 (लाल) और जेड = 5 (नीला) का उपयोग कर अज्ञात नमूनों की एकाग्रता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सभी सांद्रता log10 प्रतियों में दिया जाता है। भविष्यवाणियों कम डीएनए सांद्रता के लिए अधिक सटीक हैं जब Z = 1; भविष्यवाणियों एल्गोरिथ्म मापदंडों को समायोजित करके Z = 5. qRPA मानक वक्र नैदानिक ​​जरूरतों के हिसाब से देखते जा सकता है जब उच्च डीएनए सांद्रता के लिए अधिक सटीक हैं। आकृतिमूल रूप से, एनालिटिकल कैमिस्ट्री 2014 में प्रकाशित अनुमति 9 के साथ यहाँ reprinted।

नमूना एकाग्रता औसत अनुमानित एकाग्रता मानक विचलन सकारात्मक रूप में पहचाने गए नमूनों का प्रतिशत
कोई लक्ष्य नियंत्रण 0.1 0.3 10%
1 0.9 0.1 100%
2 2.2 0.5 100%
3 3 0.1 100%
4 3.7 0.1 100%
5 4.2 0.2 100%

तालिका 1: एचआईवी -1 qRPA परख सत्यापन standa का उपयोग करना।चित्रा 4 में आरडी वक्र, JoVE_validation_and_quantification.m स्क्रिप्ट 5 अतिरिक्त प्रयोगों के लिए नमूनों की (log10 प्रतियों में) सांद्रता भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मूल रूप से एनालिटिकल कैमिस्ट्री 2014 में प्रकाशित टेबल, अनुमति 9 के साथ यहाँ reprinted।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

जब प्रेरित MATLAB के कलन विधि का उपयोग सार्थक मात्रा का ठहराव डेटा प्राप्त करने के क्रम में, उपयोगकर्ता उपयुक्त इनपुट मूल्यों का चयन करना होगा। धारा 5 और 6 में प्रत्येक स्क्रिप्ट की शुरुआत के बाद, सभी इनपुट चर स्वचालित रूप से कमांड विंडो में अनुरोध कर रहे हैं और outputs स्वचालित रूप से उत्पन्न कर रहे हैं। धारा 5.7 में उपयोगकर्ता एक ढलान दहलीज चुनने के लिए कहा जाता है। ढलान दहलीज के मूल्य फिट के सहसंबंध गुणांक (आर 2) के वर्ग को प्रभावित करता है। एक थर्मल cycler से निर्यात कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा का उपयोग करते समय, 2.0 और 5.0 के बीच मूल्यों को एक उच्च अनुसंधान दो गुणांक उपज के लिए करते हैं। धारा 5.8 में उपयोगकर्ता सकारात्मक सीमा निर्धारित करने के लिए पृष्ठभूमि से ऊपर मानक विचलन की संख्या को नामित करना चाहिए। सकारात्मक या नकारात्मक रूप में एक नमूना स्कोर करने के लिए, स्क्रिप्ट स्वतः THERMA से निर्यात कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए अधिकतम और न्यूनतम प्रतिदीप्ति के बीच अंतर Δ नमूना निर्धारित करता हैएल cycler। यह सब कोई लक्ष्य नियंत्रण के नमूने के लिए औसत अंतर Δ पृष्ठभूमि और मानक विचलन σ पृष्ठभूमि खरीदते हैं। Δ नमूना Δ पृष्ठभूमि के ऊपर σ पृष्ठभूमि × Z की तुलना में अधिक है अगर एक नमूना सकारात्मक माना जाता है। धारा 5.10 में उपयोगकर्ता डिफ़ॉल्ट सीमा का उपयोग करें या एक नया सीमा निर्धारित करने के लिए कि क्या निर्णय लेता है। उपयोगकर्ता एक नया सीमा निर्धारित करने के लिए चाहता है, प्रयोगात्मक किसी भी एचआईवी -1 डीएनए वर्तमान के बिना तीन प्रयोगों से युक्त 12 जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन से नई दहलीज निर्धारित करते हैं। इन प्रयोगों प्लस 3 मानक विचलन से प्रतिदीप्ति तीव्रता में औसत वृद्धि पर सीमा निर्धारित। धारा 6 पूरा करने के बाद, स्क्रिप्ट JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m स्वचालित रूप से (log10 प्रतियों में) प्रत्येक qRPA प्रतिक्रिया के लिए अनुमानित डीएनए एकाग्रता देता है। स्क्रिप्ट कोई एचआईवी -1 डीएनए नमूने में मौजूद था कि निर्धारित करता है, तो अनुमान के अनुसार एकाग्रता या तो "पूर्वोत्तर के रूप में सूचीबद्ध किया गया हैआंतरिक सकारात्मक नियंत्रण के लिए फ्लोरोसेंट संकेत आधार पर कि क्या अवैध एचआईवी के लिए gative "या", "(σ पृष्ठभूमि + Δ पृष्ठभूमि × Z) दहलीज पार हो गई। उपयोगकर्ता जाना जाता नमूना सांद्रता के साथ मानक वक्र मान्य किया जाता है, तो स्क्रिप्ट भी 1 टेबल के समान एक अतिरिक्त तालिका में वापस आ जाएगी।

सही मात्रा का ठहराव प्रदान करता है कि एक वास्तविक समय जन प्रतिनिधि कानून परख विकसित करने के लिए आदेश में, प्रयोगात्मक स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, मानक वक्र और सत्यापन प्रयोगों दोनों के लिए एक ही किताब और जांच aliquots का उपयोग करें। इसके अलावा प्रयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर और जांच aliquots के भंडारण के बजाय -20 डिग्री सेल्सियस से फ्रीज पिघलना चक्र से बचें। मानक वक्र और सत्यापन के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल टेम्पलेट aliquots के एक ही तरीके से जमा हो जाती है। एक ही बहुत से जन प्रतिनिधि कानून एंजाइम छर्रों और अभिकर्मकों निर्माता की सिफारिशों के अनुसार किया जाता है। अन्त में, becaजन प्रतिनिधि कानून ठीक प्रवर्धन की दर को नियंत्रित करने के लिए सही 'चक्र' का अभाव है, का उपयोग उपयोगकर्ता चरणों का मानकीकरण बिल्कुल जरूरी है। प्रतिक्रियाओं कोडांतरण है, तो उपयोगकर्ता हमेशा हर कदम पर लगभग समय का एक ही राशि खर्च, उसी क्रम में एक ही कदम का पालन करना चाहिए। प्रतिक्रियाओं हमेशा एक नया विंदुक टिप के साथ धीरे मिश्रित किया जाना चाहिए, और बुलबुले हमेशा समाप्त किया जाना चाहिए। प्रवर्धन से पहले, प्रतिक्रियाओं एक लगातार तापमान पर आयोजित किया जाना चाहिए, और थर्मल cycler या माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर हमेशा मात्रा का ठहराव को प्रभावित कर सकता है कि उप इष्टतम तापमान पर किसी भी प्रवर्धन से बचने के लिए प्रतिक्रियाओं लोड करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए। प्रारंभिक प्रतिक्रिया की स्थिति में किसी भी बदलाव प्रयोगात्मक परिणामों में विसंगति पैदा हो सकती है।

डेटा एकत्र करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, तो अतिरिक्त चर प्रतिदीप्ति तीव्रता में भिन्नता को कम करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। सभी प्रतिक्रियाओं चरण गरम पर एक ही क्षेत्र में रखा गया है, और microsco किया जाना चाहिएपीई हर नमूना के लिए अच्छी तरह से एक ही क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए। इन प्रथाओं का पालन कर रहे हैं, भले ही एक खुर्दबीन पर एकत्र प्रतिदीप्ति डेटा के कारण स्वाभाविक रूप से उत्तेजना प्रकाश को दोहराया जोखिम से उत्पन्न जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रियाओं, प्रतिक्रिया कक्षों के भीतर बुलबुला गठन, या photobleaching के दौरान फार्म कि स्थानीय चमकीले धब्बों को परिवर्तनशीलता प्रदर्शन कर सकते हैं। इन चर के प्रभाव आधारभूत परिवर्तनशीलता, चोटियों, और troughs का प्रदर्शन जो माइक्रोस्कोप (आंकड़े -4 ए और 4 बी) पर एकत्र प्रतिदीप्ति डेटा, में स्पष्ट है। इन सुविधाओं थर्मल cycler (आंकड़े 3 ए और 3 बी) पर एकत्र प्रतिदीप्ति डेटा से अनुपस्थित रहे हैं। अंत में, माइक्रोस्कोप पर डेटा संग्रह केवल सबूत की सिद्धांत उद्देश्यों के लिए है और अंतिम परख अधिक सटीक ज्यामिति और इन चर कि कम से कम सॉफ्टवेयर नियंत्रण के साथ एक क्षेत्र प्रचलित प्रतिदीप्ति पाठक पर लागू किया जाएगा।

एक अन्य महत्वपूर्णqRPA परख विकास की प्रक्रिया के पहलू डाटा प्रोसेसिंग में निरंतरता है। विधियों खंड में वर्णित प्रोटोकॉल एक थर्मल cycler या माइक्रोस्कोप से एकत्र (एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में संग्रहीत) कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा की प्रक्रिया करने के लिए स्क्रिप्ट का उपयोग करता है। मानक वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल सभी प्रयोगों हूबहू स्वरूपित किया जाना चाहिए। डेटा एकत्र करने के लिए एक थर्मल cycler उपयोग करते समय, एक ही थाली लेआउट इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रियाओं शामिल नहीं है कि कुओं से डेटा का निर्यात नहीं किया जाना चाहिए। डेटा एकत्र करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, तो डेटा का स्वरूप स्वचालित रूप से थर्मल cycler से निर्यात डेटा के स्वरूप से मेल खाना चाहिए। D61, E2: कोशिकाओं में डी 2 होना चाहिए टेम्पलेट सांद्रता बढ़ाने के लिए C61, और डेटा: उदाहरण के लिए, कोई लक्ष्य-नियंत्रण डेटा कोशिकाओं सी 2 में होना चाहिए एक प्रयोग में एक एकाग्रता के कई प्रतिकृति अगर वहाँ E61 के, आदि, 2 एन डी दोहराने कमजोर पड़ने श्रृंखला सर्वोच्च एकाग्रता के लिए कोई लक्ष्य नियंत्रण (एनटीसी) से सही करने के लिए छोड़ दिया आदेश दिया जाना चाहिए और1 सेंट की सही करने के लिए तुरंत कॉलम में बचाया कमजोर पड़ने श्रृंखला पेश करता है। उदाहरण के लिए, 2 के साथ धारा 1.2 में इस्तेमाल थाली लेआउट में कमजोर पड़ने श्रृंखला में प्रत्येक नमूने के 1 को दोहराने के लिए प्रतिदीप्ति डेटा कोशिकाओं सी 2 में बचाया जाना चाहिए, प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिकृति: H61 और प्रतिदीप्ति डेटा प्रत्येक नमूने की 2 को दोहराने के लिए कमजोर पड़ने श्रृंखला कोशिकाओं I2 में बचाया जाना चाहिए: N61। धारा 1.2 में इस्तेमाल थाली लेआउट के लिए, यह एक स्प्रेडशीट के लिए थर्मल cycler सॉफ्टवेयर से डेटा जब निर्यात स्वरूपण डिफ़ॉल्ट है।

एचआईवी -1 qRPA प्रयोगों से प्रदान की प्रतिनिधि डेटा जन प्रतिनिधि कानून अज्ञात नमूनों में न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सबूत की अवधारणा का समर्थन प्रदर्शित करता है। चिकित्सकीय उपयोगी एचआईवी -1 वायरल लोड परीक्षण परिमाण के कम से कम 4 आदेश की एक नैदानिक ​​रेंज, 0.5 log10 प्रतियों की एक सटीक, और कम से कम 200 प्रतियां 19,20 की एक सीमा होती है-की-खोज कर सकते है। वर्णित एचआईवी -1 डीएनए परख इन सीआर मिलता हैiteria और तालिका 1 में दिखाया गया है, कम मात्रा में सबसे सटीक है। इसलिए, एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस कदम के शामिल किए जाने के साथ, इन परिणामों के एक एचआईवी -1 आर टी-जन प्रतिनिधि कानून परख में एचआईवी -1 वायरल लोड को मापने के लिए क्षमता है कि हो सकता है का सुझाव नैदानिक ​​नमूने हैं। एल्गोरिथ्म मापदंडों का समायोजन, एक qRPA परख विकासशील जब धुन नैदानिक ​​जरूरतों के आधार पर संवेदनशीलता और रैखिक गतिशील लेकर कर सकते हैं। 6 (सकारात्मक नमूने के लिए सीमा निर्धारित करता है कि एक पैरामीटर) Z का समायोजन निम्न और उच्च पर संवेदनशीलता और सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं कि पता चलता है लक्ष्य सांद्रता। इसके अलावा, यह जिससे प्रवर्धन की दर को कम करने, कम तापमान पर प्रतिक्रियाओं incubating या उससे कम मैग्नीशियम एसीटेट का उपयोग करके मात्रा का ठहराव के संकल्प और सटीकता की वृद्धि करने के लिए संभव हो सकता है।

अवधारणा qRPA परख की यह सबूत एचआईवी -1 डीएनए युक्त नमूनों की एकाग्रता यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस एमए में वर्णित qRPA परखnuscript, वास्तविक समय जन प्रतिनिधि कानून प्रतिक्रियाओं इकट्ठा विकसित करने और एक भारतीय दंड विधान स्क्रीन, और अज्ञात के नमूने यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मानक वक्र का निर्माण करने के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा की प्रक्रिया के बारे में विस्तृत निर्देश शामिल हैं। विस्तृत निर्देश शामिल के साथ, इस प्रोटोकॉल के नमूने की एक विस्तृत विविधता में डीएनए एकाग्रता यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

इस शोध वैश्विक स्वास्थ्य पहल में ग्रांड चुनौतियों के माध्यम से बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate TwistDx TwistAmp exo
PCR tube strips BioRad TLS0801
PCR flat cap tube strips BioRad TCS0803
Micro-seal adhesive BioRad 558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA Applied Biosystems 360486
96 well cold-block Cole Parmer EW-36700-48
Thermal cycler BioRad CFX96
MiniFuge VWR 93000-196
Vortex VWR 58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 EMD Millipore 648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Promega V4321
Nuclease free water Ambion AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template Waterborne Inc P102C It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
TAE 10X buffer EMD Millipore 574797
Agarose Sigma Aldrich A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope Zeiss Zeiss Imager.J1
Stage heater Bioscience Tools TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller Bioscience Tools TC-1100S
FAM/GFP filter cube Zeiss filter set 38 (000000-1031-346) excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube Chroma 49014 excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter Engraver's Network VLS3.60
1/8" black acrylic McMaster Carr 8505K113
1.5 mm clear acrylic McMaster Carr PD-72268940 
Super glue Office Depot Duro super glue 
PCR grade mineral oil Sigma Aldrich M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel Microsoft
MATLAB MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” Included in SI
Adobe Illustrator Adobe
JoVE_qRPA_well.ai Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai Included in SI
AxioVision software Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript Included in SI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12, (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49, (3), 209-224 (2002).
  3. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75, (1), 1-4 (2013).
  4. Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11, (8), 1420-1430 (2011).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4, (7), 1115-1121 (2006).
  6. Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16, (1), 127-135 (2014).
  7. Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811, (1), 81-87 (2014).
  8. Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13, (1), 99 (2014).
  9. Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86, (5), 2565-2571 (2014).
  10. Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12, (17), 3082 (2012).
  11. Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115, (1), 159-165 (2013).
  12. Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51, (4), 1110-1117 (2013).
  13. Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8, (8), e71642 (2013).
  14. Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (3), e2730 (2014).
  15. Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5, (11), 15 (2010).
  16. Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8, (1), 118-129 (2003).
  17. DNA Extraction from Serum. Life Technologies. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
  18. Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86, (12), (2014).
  19. Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9, (2), e85869 (2014).
  20. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics