Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Biology

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Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10.3791/52959 (2015).

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Abstract

Introduction

Proteom-Experimente, die Massenspektrometrie (MS) können so gestaltet werden, entweder nicht-zielgerichtete (Schrotflinte) oder gezielte Methoden verwenden. Entdeckung Proteomik beruht in der Regel auf Bottom-up-Schrotflinte MS, entweder durch die Verwendung eines herkömmlichen datenabhängigen Erfassungsmodus oder mit Hilfe eines der neu entwickelten Datenunabhängige Techniken (zB MS E, SWATH) 1,2. Shotgun Proteomics ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Hochdurchsatz-Peptid-Identifikation und relative Quantifizierung, aber es in der Regel für die absolute Quantifizierung oder auf kleine, definierte Sets (~ zig) von Proteinen ungeeignet ist. Die MS-Methode die am häufigsten für gezielte Proteomics ist wegen seiner hohen Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Dynamik 3-5 gewählten Reaktionsüberwachung (SRM). Alternativen zu SRM sind parallel Reaktionsüberwachung, die Vorteile der hochauflösenden Voll MS Scan-6 nimmt.

SRM ist in der Regel unter Verwendung einer Nanofluss reverSED Phasen-Hochleistungschromatographie (Nano RP-LC) Gerät in einen Nanoelektrospray-Ionisations (nano-ESI) Ionenquelle zu einer Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (QqQ-MS) angebracht ist. In einem typischen Experiment werden Probenproteinen proteolytisch verdaut und die resultierenden Peptide werden chromatographisch getrennt, desorbiert und ionisiert. Die erhaltenen Vorläuferionen m / z durch den ersten Quadrupol (Q1) gefiltert und fragmentiert in der zweiten Quadrupol (Q2) durch Kollision sie mit einem Stoßgas. Die resultierenden Fragmentionen m / z-gefiltert in dem dritten Quadrupol (Q3) und durch eine Dynode quantifiziert. Jedes Vorläufer- und Fragmentionenpaar wird als Übergang bezeichnet, und jeder Übergang wird für eine bestimmte Zeitdauer (die Verweilzeit, typischerweise 2-50 ms) überwacht. Während LC-SRM, die QqQ-MS durchläuft einer vordefinierten Liste von Übergängen (das Tastverhältnis ist typischerweise ≤3 s) und ein Chromatogramm jedem Übergang entsteht.

Alternative strategies zur Proteinquantifizierung verwenden in der Regel Immunoassays wie Dot-Blots, Western Blots, ELISAs, Antikörper-Mikroarrays, Reverse-Phase-Protein-Microarrays, Mikrofluid-Immunoassays, digital ELISAs, und Mikrokügelchen basierende Immunoassays 7. Die besten Immunoassays deutlich empfindlicher als LC-SRM ist, und der Probendurchsatz von Immunoassays deutlich höher als die der LC-SRM 5 sein. Jedoch kann die Entwicklung Immunoassays teuer und / oder zeitaufwendig, und die resultierenden Assays können anfällig für Cross-Reaktivität und / oder Störungen, inkompatibel mit Zell- / Gewebe Lyse / Homogenisierungsverfahren werden und / oder nicht zugänglich Multiplexen 5,8. Einige dieser Probleme können durch Kopplung Antikörper- und MS-basierte Techniken behandelt werden. Zum Beispiel können Zielproteine ​​mittels Immunpräzipitation vor Proteolyse und LC-SRM 9-12 angereichert werden. Alternativ verwendet der SISCAPA Technik Immunpräzipitation im Anschluss an die Proteolyse im Peptid level 13,14. Neben Strategien immunoenrichment kann Immunodepletion hoher Fülle Proteine ​​eingesetzt werden, um LC-SRM Empfindlichkeit durch Reduzieren von Interferenz erhöhen koeluierender Analyten 15,16.

MS-basierte Proteinquantifizierung kann in relative und absolute Quantifizierung in markierungsfreien und stabilen Isotopenmarkierung (zB metabolische Markierung, chemische Markierung, und Heavy-markiertem Protein und Peptid-interne Standards) unterteilt werden, und auch. Markierungsfreie Techniken können nützlich für die relative Proteinquantifizierung, sind aber für eine genaue absolute Quantifizierung ungeeignet. Im Vergleich dazu haben Markierungstechniken Fehler mit Probenvorbereitung und MS assoziierten Varianz reduziert und werden häufig für die relative Proteinquantifizierung 17 eingesetzt. Zum Beispiel unter Verwendung einer kultivierten humanen Zelllinie aktiviert relative Quantifizierung Biomarkern über LC-SRM von menschlichem Serum 18 hergestellten stabilen Isotop markiert Proteoms (SILAP) -Standards. Genaue absolute Proteinquantifizierung von MS verlangt, dass gereinigte, quantifiziert, isotopenmarkierte Protein oder Peptid internen Standards versetzt, in biologischen Proben vor der MS werden. Der Einbau von schweren Isotopen-markierten internen Standards in ein LC-SRM-Workflow ermöglicht absolute Quantifizierung, die nachweislich hoch reproduzierbar und übertragbar zwischen Laboratorien 16,19 sein.

Stabiles Isotop markierten internen Standards für die absolute Proteinquantifizierung von MS gehören Peptid-Standards unter Verwendung von Festphasensynthese 20, Proteine ​​von verketteten Protease-spaltbare Peptidstandards 21, und in voller Länge Proteinstandards 22 vorbereitet. Zielprotein kovalente Modifikation und unvollständig Probenvorbereitung (dh unvollständige Lyse der Probe und Homogenisierung und unvollständiges Protein-Solubilisierung Denaturierung, Alkylierung und Proteolyse) kann eine genaue Quantifizierung zu untergraben. Interne protein Normen sind die am wenigsten von den meisten dieser potentiellen Probleme betroffen sein, aber sie sind in der Regel die schwierig herzustellen. Eine Alternative ist es, jede Zielprotein Verwendung mehrerer interner Peptidstandards, die dazu bestimmt sind, Amino- und Carboxy-terminalen nativen flankierenden Reste umfassen analysieren. Unabhängig davon, welche Art von interner Standard verwendet wird, sollte es während der Probenvorbereitung wie möglich Spike-in werden die biologischen Proben in einem möglichst frühen Zeitpunkt. Außerdem sollten mehrere Probenpräparationstechniken (zB unterschiedliche Denaturierungsbedingungen) getestet werden. Die Verwendung von mehreren orthogonalen experimentellen Techniken (experimentell Kreuzvalidierung) ist eine praktikable Strategie zur Überwindung meisten Quantifizierung mögliche Herausforderungen 23-25.

LC-SRM Quantifizierung von Proteinen ist ein sehr flexibles Verfahren, das in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet worden ist. Bemerkenswerterweise wurde verwendet, um Peptid- und Protein-Biomarkern in studierenklinischen Proben, wie Serum, Stanzbiopsien und Feinnadelabsaugungen 5. LC-SRM ist auch verwendet worden, um die Stöchiometrie von Proteinkomplexen 5,26 messen, Botulinumneurotoxine 27 zu erfassen, um die Proteinphosphorylierung Dynamik innerhalb Signalwege 5 quantifizieren und um Änderungen in der Proteinkonformation 28 zu quantifizieren.

Unser Labor ist mit LC-SRM, die Signalproteine, die Makrophagen-Chemotaxis vermitteln, um die Entwicklung von Chemotaxis Signalweg Simulationen unterstützt quantifizieren. Das Gesamtkonzept des Protokolls (Abbildung 1) beginnt mit Ranking der vorläufige Soll Peptide. Anschließend werden rohe externen Peptidstandards synthetisiert und verwendet werden, um LC-SRM-Assays für die qualitative Analyse von biologischen Proben zu entwickeln. Wenn der biologischen Probe stammenden Zielpeptid erfaßt wird, werden gereinigte Schwer markierten internen Peptid-Standards für die quantitative LC-SRM hergestellt. Dieses Protokoll kann zu ac verwendet werdennau Quantifizierung von Proteinen aus einer Vielzahl von biologischen Proben und zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinziele zu unterstützen.

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Protocol

Hinweis: Diese Methode wurde bereits beschrieben 56 worden.

1. Peptidzielauswahl

  1. Stellen Sie eine Liste der Zielproteine, und verfügen über eine kleine Anzahl von Housekeeping-Proteinen für die Normalisierung in biologischen Proben, und auch eine interne Proteinstandard (zB Glühwürmchen-Luciferase). Verdauen die Zielproteine ​​in tryptischen Peptide in silico mit einem Software-Tool, wie beispielsweise Proteinverdauung Simulator 29,30.
  2. Erfordern, dass die Peptide sind voll tryptischen und enthalten keine fehlenden Trypsin-Spaltstellen. Vermeiden Peptide mit den Nachbar Trypsin-Spaltstellen, um möglicherweise unvollständig Trypsinverdau 31 zu vermeiden.
  3. Erfordern, daß die Länge jedes Peptid 5-20 Resten. Betrachten Sie längere Peptide, aber beachten Sie, dass sie in der Regel teurer zu synthetisieren.
  4. Vermeiden Sie ein Peptid, wenn sie auf eine natürliche genetische Variante (zB ein Single-Nukleotid entsprichte-Polymorphismus). Vergewissern Sie sich außerdem, dass die Trypsin-Websites sind nicht betroffen (Schritt 1.2).
  5. Vermeiden Sie ein Peptid, wenn es zu einem Ort der posttranslationalen Modifikation (PTM) entspricht. Ähnlich zu vermeiden, die ein Peptid, wenn es während der LC-MS Probenvorbereitung wäre anfällig für chemische Modifikation. Insbesondere vermeiden Peptide anfällig für Cystein und Methionin-Oxidation, Asparagin und Glutamin Desamidierung und Amino-terminalen Glutamin Bildung von Pyroglutamat. Bestätigen, dass die Trypsin-Websites sind nicht betroffen (Schritt 1.2).
    1. Außerdem vermeiden Peptide, die von Protein-Amino- und Carboxy-Termini stammen, da Protein-Termini sind anfällig für posttranslationale Modifikation (aminoterminales Methionin Verlust und Acetylierung und Carboxy-terminale Amidierung).
  6. Verlangen, dass jedes Zielpeptid ist einzigartig für jedes Zielprotein. Wenn dies nicht möglich ist, erfordern, daß das Peptid ist einzigartig für einen Satz von Isoformen / Homologen. Gönnen Peptide sich nur durch Leucin / Isoleucin-Substitutionals ob sie identisch waren bei der Ermittlung Peptid Einzigartigkeit, denn diese führen fast identisch bei LC-SRM.
    1. Ist eine umfangreiche transkriptomischen Analyse aller der biologischen Proben wurde (zB RNA-seq) durchgeführt wird, zu bestimmen Peptid Einzigartigkeit Verwendung in silico Übersetzungen der Transkript-Sequenzen 32 anstelle der Verwendung der Proteom der Arten.
  7. Erfordern, dass die Zielpeptide sind proteo. Identifizieren proteo Peptide mit Schrotflinte Massenspektrometrie 1,2 der biologischen Proben untersucht. Alternativ abrufen Peptid Identifikationen proteotypischen Peptide, die von Online-Proteomics-Datenbanken wie die NIST-Massenspektrometrie Bibliotheken 33 (http://peptide.nist.gov/), der weltweit Proteome-Maschine 34 (X HUNTER Spektrenbibliotheken von http: // www .thegpm.org / Jäger / index.html und GPMDB Peptididentifikationen von http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. Wenn quantitative Transkript Ebene Analysen von biologischen Proben durchgeführt wurden (zB RNA-seq, qPCR) dann vermieden wird, die Peptide, die an den relativ niedriger Abundanz Transkripten entsprechen.
  9. Bei Bedarf können Sie Zielpeptide, die für die LC-SRM-Assays an Zielprotein Orthologe eingesetzt werden könnten (beispielsweise, um sowohl der menschlichen und der Maus-Formen von einem Target-Protein-Assay).
  10. Wählen Sie mindestens zwei Zielpeptide pro Zielprotein (wenn möglich).

2. Herstellung von Peptidstandards

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls wird die Herstellung einer Reihe von zwanzig lyophilisierten Peptids Standards (wobei jeder 1 nmol in Menge) für Downstream-Analysen. Für eine unterschiedliche Anzahl von Peptiden oder für unterschiedliche Peptidmengen, es müssen entsprechend angepasst werden.

    20,37.
    1. Sicherzustellen, dass die Cysteinreste externer Peptidstandards carbamidomethylated (die chemische Struktur von Iodacetamid Alkylierung gebildet). Im Gegensatz dazu sicherzustellen, dass die Cysteinreste des internen Peptidstandards unmodifiziert sind (diese werden bei der Probenvorbereitung, alkyliert werden, wie unten beschrieben).
    2. Gestalten Sie interne Peptidstandards, so dass sie Amino- und Carboxy-terminalen nativen flankierenden Reste enthalten (für Trypsinverdau Effizienz kontrollieren; jeder ist in der Regel drei Minuten vor sechs Reste lang).
    3. Entwerfen internen Peptidstandards, so dass sie mit stabilen Isotopen markiert. Stellen Sie sich das natürliche Isotopenprofil der Zielpeptid und die Masse Messgenauigkeit der MS bei der Auswahl eines Peptidmarkierungsstrategie. Verwenden Sie keine deuterierten Peptidstandards weil Peptid Deuterierung Ursachen Umkehrphasen-LC-Retentionszeits 38 zu verschieben.
      Anmerkung: In der Regel werden tryptische internen Peptidstandards mit ~ 98% rein synthetisiert [13 C 6, 15 N 4] Arg und [13 C 6, 15 N 2] Lys am Carboxy-Terminus eingebaut.
    4. Reinige interne Peptidstandards unter Verwendung von HPLC 39, und genau zu quantifizieren 40.
  1. Geben Sie 100 ul 0,1% v / v Ameisensäure, kann 20% v / v Acetonitril (ACN), um je 1 nmol lyophilisierten Peptids Standard, um eine Peptidkonzentration von 10 uM (Aufpassen, da lyophilisierten Peptids zu erzeugen eine sehr geringe Dichte haben und kann leicht verloren gehen). Wirbel die Proben für 2 min und Bade beschallen sie für 5 min, um sicherzustellen, dass das Peptid die Auflösung vollständig ist.
  2. Bündeln die gelösten Peptide und konzentrieren das erhaltene Gemisch im Vakuum-Konzentrator auf ein Endvolumen von 80 ul. In 20 ul ACN, jede ausgefallene Peptid aufzulösen.
    Hinweis: der Beispiel jetzt Contains 10 uM von jedem Peptid und 20% v / v ACN.
  3. Für interne Peptid-Standards, bereiten eine Verdünnungsreihe zur quantitativen LC-SRM:
    1. Vorzubereiten 100 ul einer 1 uM Verdünnung: Kombinieren 90 ul 20% v / v ACN und 10 ul der 10 & mgr; M Peptidmischung.
    2. Vorzubereiten 100 ul einer 100 nM verdünnt: Kombinieren 90 ul 20% v / v ACN und 10 ul der 1 & mgr; M Peptidmischung.
  4. Für externe Peptidstandards, bereiten 100 ul einer 1 & mgr; M Verdünnung für die LC-MS indem 90 ul 0,1% v / v Ameisensäure und 10 ul der 10 & mgr; M Peptidmischung.
    Hinweis: Die Probe enthält jetzt 1 & mgr; M von jedem Peptid, 0,1% v / v Ameisensäure und 2% v / v ACN, und ist bereit, für LC-SRM Assay-Entwicklung verwendet werden.

3. LC-SRM-Assay-Entwicklung

  1. Analyse der Mischungen der externen Peptidstandards (ungefähr 1-10 pmol jedes Peptid pro Injektion) von Shotgun MS unter Verwendung eines Nano-Strömungs HPLC System zu einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (LC-QqQ-MS (/ MS)) gekoppelt ist.
    1. Verwenden Sie ein LC-MS-System mit einer Kapillarsäule mit C-18-Medien (≤5 um Durchmesser, ~ 200 Å Poren, Länge ≥10 cm, id = 50-100 um) gepackt ausgestattet und ein Nano-ESI-Spitze (in der Regel unter Verwendung hergestellt ein Laser-Puller). Sicherzustellen, dass jeder LC-MS Lauf umfasst eine ~ 60 min linearer Gradient (typischerweise 0-40% Lösungsmittel B), eine Spalte Regenerationsschritt (~ 80% Lösungsmittel B) und eine Spalte Reäquilibrierung Schritt (~ 0% Lösungsmittel B ) (Lösungsmittel A = 0,1% v / v Ameisensäure in H 2 O, Lösungsmittel B = 0,1% v / v Ameisensäure in ACN, Fließgeschwindigkeit = 200-800 nl / min, ESI-Spannung = 1800 V, Q3 Isolationsbreite = 0,7 m / z, q2 Argondruck = 1,5 mTorr).
    2. Für jede Vorläuferionenscan, dynamisch wählen Sie die oben ~ 10 intensivsten Vorläuferionen für die Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS). Führen jeder Probe in Doppelbestimmung, so dass zwei unterschiedliche Kollisionsenergie Rampen verwendet werden: ein optimal, wenn fragmentieren +2 Vorläuferionen und die anderefür drei Vorläuferionen 41.
    3. Führen Sie das LC-QqQ-MS (/ MS) Analysen mit Q3 Vorläuferion Scannen (Q1 Vorläuferion Scannen kann Tailing der Vorläufer-Ionen-Peaks, die aus niederenergetischen Argon Kollisionen in Q2 verursachen).
    4. Stellen Sie sicher, dass der LC-MS-System ausreichend Durchführung durch die Analyse von QC Proben und technische Replikate. Verhindern von Probenmaterial unter Verwendung von frisch zubereiteten LC-Säulen und Ausführen mehrerer Rohlinge zwischen den Proben.
  2. Analyse der resultierenden shotgun LC-QqQ-MS (/ MS) von Daten mit Datenbanksuche gegen den Sequenzen der externen Peptidstandards 42. Falls verwerfen mehrdeutig Peptididentifikationen mit den Peptididentifikations Konfidenzbewertungen (zB Erwartungswerte) oder mit statistischen Modellierung 42. Unabhängig davon, manuell alle Peptididentifikationen 43 überprüfen, um sicherzustellen, dass sie alle eindeutig.
  3. Verwenden Sie die Schrotflinte MS Peptididentifikationen construct eine Spektrenbibliothek mit einem Software-Programm wie Skyline.
    1. Bereiten Sie ein LC-SRM Übergang Liste mit den 3-10 intensivsten Übergänge pro Vorläuferion (+2 und +3 Vorläuferionen; +1 und +2 Fragmentionen, y-, b- und a-Ionen, die ≥2 Reste lang).
    2. Entsorgen Sie einen Übergang, wenn die Vorläufer- und Fragmentionen m / z-Werte überlappen, in der Masse Messgenauigkeit des QqQ-MS (Vorläuferionenfragmentierung ist manchmal unvollständig, denken Sie daran, die Mono-Isotope und die schweren natürlichen Isotopenformen, wie auch die nicht-markierten berücksichtigen und Schwer markierte Formen).
    3. In ähnlicher Weise einen Übergang zu verwerfen, wenn das Fragment-Ion m / z mit der von einem anderen Fragment-Ionen aus dem gleichen Vorläuferionen.
  4. Mit den daraus resultierenden Übergangslisten durchzuführen LC-SRM-Analysen der Mischungen der externen Peptidstandards (führen Massenspektrometrie, wie in Schritt 3.1 beschrieben; Q1 und Q3 Isolationsbreite = 0,7 m / z; Verweilzeit = 2-50 ms).
  5. Manually überprüfen Sie die resultierende LC-SRM-Daten und löschen Sie alle mit schlechter Leistung Assays (die Analyse der LC-SRM-Daten ist in Kapitel 5 beschrieben).

4. LC-SRM-Assays biologischer Proben

  1. Bereiten Sie die Speisen von kultivierten Zellen 44. Wenn mehrere Versuchsbedingungen werden, Block verglichen und zufällig die Proben, um mögliche systematischer Fehler 45 zu reduzieren.
  2. Für jedes Gericht von Zellen, saugen Sie den Zellkulturmedium zu verschwenden und die Zellen in einem Serum-freien Puffer 44. Falls erforderlich, die Zellen werden in einem serumfreien Puffer, um alle verbleibenden extrazelluläre Protein zu entfernen.
  3. Für jede Probe, zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen und insgesamt durch die Verwendung eines Lebensfähigkeit Fleck (zB Trypanblau) und einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers 44.
  4. Pellet die Zellen durch Zentrifugation, und saugen Sie den Überständen zu verschwenden 44 (eine typische Zellpellet Volumen ist ~ 30 & mgr; l).
  5. Mischen Sie jede Probe mit sanften Pipettieren, und übertragen Sie die jeweils mit einem 2-ml-Tube (mit einem Schraubdeckel mit einem O-Ring) mit ~ 100 & mgr; l von 0,1 mm Zirkonia / Silica-Kügelchen (beachten Sie, dass die Perlen können Schnappdeckelröhrchen führen zu lecken ). Lyse der Zellen durch Verwirbeln der Proben für 5 min bei voller Geschwindigkeit (das die Zellen lysiert durch Kugelschläge).
    1. Alternativ lysieren die Zellen unter Verwendung eines anderen mechanischen Verfahren (zB mit einem Französisch Presse oder Homogenisierung Tipps).
      Hinweis: Vermeiden Sie Zentrifugieren Zelllysate da dies ausgefällte Protein pelletieren, die ot könntechts, sonst tryptisch verdaut und durch LC-MS nachgewiesen werden.
  6. Das Tensid denaturierten Proben, inkubieren bei 90 ° C für 10 min, Proben Homogenisierung und Proteindenaturierung zu unterstützen.
  7. Bad beschallen die Proben für 10 min bei Raumtemperatur zu einer Homogenisierung und Proteindenaturierung zu unterstützen.
    Anmerkung: Die Lysate und Lysepuffer kann bei -80 ° C gelagert werden (der Lysepuffer wird für die Schritte 4.9 und 4.13 erforderlich).
  8. Durchführen einer Proteinkonzentration Assay 46 (zB ein Bicinchoninsäure-Assay) der Lysate (und des Lysepuffers als Kontrollversuch).
  9. Für qualitative Analysen (dh, werden keine internen Standards versetzt Peptid-in die Proben werden), Pipette 200 ug (Proteinmasse) Zelllysat in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für quantitative Analysen, bereiten vier solcher Proben für einen stabilen Isotopenverdünnungsreihe.
  10. Für jede Probe, fügen Sie eine interne Proteinstandard (zB </ Em>, fügen ~ 5 pmol von ~ 98% rein Firefly Luziferase).
  11. Für quantitative Analysen, fügen Isotopenverdünnungsreihe der äquimolaren Mischung der internen Peptidstandards (beispielsweise 0, 0,2, 2, 20 pmol von jedem Peptid) an den Proben.
    1. Parallel dazu vorzubereiten Kontrollproben unter Verwendung der internen Peptidstandards alleine (dh ohne Zelllysat) (beispielsweise 0, 0,2, 2, 20 pmol von jedem Peptid).
    2. Auch bereiten Kontrollproben mit den externen und internen Peptidstandards (zum Beispiel: 2 pmol von jedem externen Peptid-Standard, und 0, 0,2, 2, und 20 pmol von jedem internen Peptid-Standard).
      Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Peptid-Standards sind frei von Ameisensäure als es mit dem Trypsinverdau stören.
  12. Hinzuzufügen Lysepuffer so dass alle Proben identische Volumina. Hinweis: Eine typische Probenvolumen 70 & mgr; l, so wird dieses Volumen für dieses Protokoll verwendet werden.
  13. Reduzieren Protein Cysteinreste durch Zugabe 0.7 ul 1 M DTT (frisch hergestellt) zu jeder Probe (die endgültige DTT Konzentration 10 mM) und die Inkubation der Proben bei 60 ° C für 30 min.
  14. Alkylat Protein Cysteinen durch Zugabe von 7 ul gepufferter Iodacetamid (500 mM Iodacetamid, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8; frisch hergestellt) zu jeder Probe (die endgültige Iodacetamid Konzentration 50 mM) und die Inkubation der Proben bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln (Iodacetamid ist lichtempfindlich). Falls erforderlich, löschen den verbleibenden Jodacetamid durch Zugabe DTT bis zu einer Endkonzentration von 50 mM.
  15. Für jede der Proben unter Verwendung von Harnstoff denaturiert, fügen 482 ul 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, so dass der endgültige Harnstoffkonzentration 1 M (Trypsin signifikant bei> 1 M Harnstoff 47 gesperrt).
  16. Tryptisch verdauen die Proteine ​​in Peptide.
    1. Für jede Probe, das Zelllysat enthält, hinzuzufügen 8 ul 0,5 ug / ul Sequenziergrad modifizierten Trypsin so daß das endgültige Konzentrat TrypsinIon ist 01.50 (Protein w: w) Trypsin: Probe und inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 18 Stunden.
    2. Für jede Probe, die nicht Zelllysat enthält, werden 0,5 ul 0,5 ug / ul Sequenziergrad modifizierten Trypsin und Inkubation der Probe bei 37 ° C für 2 Stunden (jede dieser Proben sind für Kontrollversuche und enthalten typischerweise nur 10 ng -10 ug Peptid + Proteinmasse).
  17. Für jede der Harnstoff denaturierte Proben, fügen 440 ul 2% v / v Ameisensäure (die endgültige Ameisensäurekonzentration auf 1% v / v). Bestätigen Sie, dass diese Proben sind pH ~ 3.
    1. Für jede der Tensid denaturierten Proben, fügen 914 ul 0,5% v / v TFA (die endgültige TFA-Konzentration 0,5% v / v). Bestätigen Sie, dass diese Proben sind pH ~ 1,5. Diese Proben bei 37 ° C, 60 min, um das Tensid zu hydrolysieren.
  18. Mikrozentrifugen alle Proben bei 21.000 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um das Tensid Schwanzgruppe und andere prec Pelletipitates, die eine C-18-SPE-Kartusche verstopfen würde.
  19. Festphase zu extrahieren jedem der Überstände mit einer Einweg C-18-SPE-Kartusche (Puffer A = 0,1% v / v Ameisensäure; Puffer B = 0,1% v / v Ameisensäure, 80% v / v ACN; ~ 100 mg C- 18-Harz pro Kassette). Zwingen den mobilen Phasen durch die C-18-SPE-Kartusche mit einem ebenflächigen Gummiball, mit einem Extraktionsverteiler oder durch Zentrifugieren der Kassette in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen bei 10 × g für 5 min.
    1. Befeuchten Sie die Spalte, indem 1 ml Puffer B, ins Gleichgewicht, indem sie 1 ml Puffer A zweimal, gelten die Probe, und waschen Sie die Patrone, indem 1 ml Puffer A zweimal. Elution der Peptide, indem 1 ml Puffer B langsam (ca. 2 min).
  20. Konzentrat jedes Eluats im Vakuumkonzentrator auf ein Endvolumen von 100 ul zu verdampfen ACN. Zugeben von 200 & mgr; l H 2 O zu jeder Probe und engt jeweils im Vakuum-Konzentrator auf ein Endvolumen von 98 ul zu verdampfen mögliche Wiederverwendung entferntRest ACN.
  21. Add 2 ul von 5% v / v Ameisensäure in ACN zu jeder Probe (die endgültige Probenkonzentration 0,1% v / v Ameisensäure, 2% v / v ACN).
    Anmerkung: Die Proben können bei -80 ° C gelagert werden.
  22. Analyse der Proben mittels LC-SRM (wie in Schritt 3.4). Für qualitative LC-SRM-Analysen, führen Sie die biologischen Proben und die externen Peptid-Standards, und alle der erhaltenen Daten zusammen zu analysieren. Für quantitative LC-SRM-Analysen, führen Sie den Isotopenverdünnungsreihe von jeder biologischen Probe, und auch laufen die Proben, die aus den Peptid-Standards allein, und alles der erhaltenen Daten zusammen zu analysieren.

5. LC-SRM Datenanalyse

HINWEIS: Peptide Identifizierung und Quantifizierung kann stark vereinfacht werden und mit Software wie Skyline teilweise automatisiert, aber es ist immer noch dringend empfohlen, dass alle Daten-Annotation manuell überprüft werden. Auch ist es am besten, um Protein-Ebene Informationen während der manuellen annot ausschließenation der LC-SRM-Daten um Verzerrungen zu vermeiden.

  1. Für jedes Peptid Identifizierung, zu bestätigen, dass die Form jeder Übergang Elutionsprofil ist in etwa gaußförmig. Für jeden Übergang, zu bestätigen, dass das Elutionsprofil ist das Produkt mehrerer Signale von der MS-Detektor gemessen (das heißt, nicht das Produkt von einer oder zwei zufällige Spitzen von MS-Rauschen).
  2. Für jedes Peptid Identifizierung, sicherzustellen, dass das gesamte Peptid Elutionsprofil ausgewählt. Vermeiden Sie manuell die Anpassung der Elutionsprofil Grenzen der Teilkomponenten des Peptid-Identifikation (Schwer-markierten Peptidform, die nicht markierten Form, einzelne Vorläuferionen, und individuelle Übergänge).
  3. Zu bestätigen, dass jeder Übergang Elutionsprofil hat einen Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) ≥3. Hinweis: "Noise" bezieht sich auf Zufalls MS Lärm, nicht auf Signal von koeluierender Analyten reproduzierbar. Chromatogram Glättungsfunktionen können die Analyse von stark verrauschten Daten zu unterstützen.
  4. Für jedes Peptid Identifikation,zu bestätigen, dass alle Übergänge nahezu identische Elutionsprofile (nicht nur gleiche Spitzenscheitelzeiten, Elutionsprofile können verschiedene Amplituden aufweisen).
  5. LC-SRM Analysen einer großen Menge der Peptid-Standards (typischerweise ≥100 fmol jedes Peptids), bestätigen, daß die entsprechende Peptid-Elutionsprofile sind sehr intensiv (typischerweise s / n ≥100) und daß die Peptididentifikationen eindeutig. Anmerkung: Diese sehr zuversichtlich Identifikationen kritisch für die Identifizierung der entsprechenden biologischen Probe abgeleitete Peptide sein.
  6. Für jedes Peptid Identifizierung, zu bestätigen, dass die relativen Übergangsstärken mit denen der selbstbewusst identifizierte Peptid-Standard. Falls erforderlich, verwerfen laut, relativ niedriger Intensität Übergang Elutionsprofile, aber bestätigen, dass keiner der relativ starke Übergänge fehlen. Ignorieren Sie relativ starke Übergangs Elutionsprofile, die durch eine Zusammenarbeit deutlich und eindeutig betroffen sindeluierenden Verunreinigung.
  7. Für jedes Peptid Identifikation, schätzen die Wahrscheinlichkeit, dass sie nach dem Zufallsprinzip von Hintergrundsignal (random MS Rauschen plus reproduzierbare Signal von koeluierender Analyten) produziert wurde.
    1. Manuell schätzen diese Wahrscheinlichkeit durch die Untersuchung der gesamten LC-SRM Chromatogramms und der Schätzung der Einzigartigkeit jedes Peptid-Identifikation. Produzieren eine Reihe von zuversichtlich Peptididentifikationen, die einen geschätzten False Discovery Rate (FDR) von 5% hat. Verwenden strengere Kriterien (zB FDR ≤1%), wenn ein höheres Vertrauen gesetzt von Identifikationen erforderlich (Verwendung von lockerere Kriterien wird nicht empfohlen).
    2. Alternativ können Sie die mProphet Algorithmus 48 bzw. des Prüfungsalgorithmus 49, aber die Ergebnisse manuell überprüfen.
  8. Für jedes Peptid Identifizierung, zu bestätigen, dass die beobachtete Elutionszeit ist konsistent mit der Hydrophobie des Peptids (Skyline ist entworfen, um diese Berechnung durchzuführen).
  9. Für jedes Peptid, zu bestätigen, dassdessen Elutionszeit ist konsistent über die LC läuft.
    Hinweis: LC-SRM-Analysen manchmal produzieren Elutionsprofile, die systematisch zwischen den Läufen verzerrt werden. Systematischen Verschiebungen nach Instrument Veränderungen, wie das Ersetzen einer Spalte zu erwarten. Auch kann früh eluierenden Peptide anfällig Verschiebung (insbesondere wenn die Säule geladen nahe Kapazität) ist, und späte Elution Peptide können auch anfällig für verlagern. Peptididentifikation ist nun abgeschlossen.
  10. Zur Verbesserung Peptid Quantifizierung einmal inspizieren jedes Peptid Identifizierung und verwerfen einen Übergang Elutionsprofil, wenn es besonders laut Vergleich zu den anderen Übergangs Elutionsprofile der Peptididentifikation. Wirf eine Übergangs Elutionsprofil wenn seine relative Übergangsintensität ist falsch (im Vergleich zur Peptid-Standard).
  11. Überprüfen Sie die Grenzen jedes Vorläuferion und Übergangs Elutionsprofil. Falls notwendig, sorgfältig die Elutionsprofil Grenzen anpassen, um Hintergrundsignal beschneiden entfernt (oder improve Hintergrundsignal Schätzung).
  12. Für jede interne Peptid-Standard, zu überprüfen, ob es mit einer nachweisbaren Menge an Licht Peptid verunreinigt (von der LC-SRM-Analysen der internen Peptidstandards allein, oben beschrieben). Anschließend verwerfen Licht Peptid Elutionsprofile, die wesentlich durch Licht-Peptid-Verunreinigungen innerhalb der internen Peptidstandards kompromittiert wurden.
  13. Quantifizieren jeden Übergang Elutionsprofil durch Berechnung seiner LC-Peakfläche. Gegebenenfalls Abzug der geschätzten Hintergrundsignal. Quantifizierung jedes Peptid Elutionsprofil durch Addition der entsprechenden Übergangs Quantifizierung Werte (nachfolgend wird dies als "Sum_Peak_Area" Wert bezeichnet). Für jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Wert, die Berechnung der biologischen Probe Peptid molaren Überfluss mit Daten aus LC-SRM von internen oder externen Peptidstandards (nur die Übergänge, die erfolgreich sowohl von der biologischen Probe Peptid quantifiziert wurdenLC-SRM, und dass der Peptidstandard).
    1. Quantifizierung mittels externer Peptidstandards (nicht empfohlen):
      1. Zeichnen Sie die externe Peptids Standard Sum_Peak_Area Werte im Vergleich zu den externen Peptid Standardwerte molarer Überfluss. Herstellung einer Standardkurve, indem eine lineare Regression auf die Daten (typischerweise nur die lineare Komponente des dynamischen Bereichs verwendet werden soll, jede nichtlineare Komponente mit äußerster Vorsicht verwendet werden). Für jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Wert, verwenden Sie die Standardkurve, um das Peptid molaren Überfluss zu berechnen.
        Anmerkung: Dieser Quantifizierungsverfahren ist nicht empfehlenswert, weil es erfordert, dass die Probenvorbereitung und die LC-SRM sein demonstrability robust, da die biologischen Proben und externen Peptidstandards werden durch LC-SRM getrennt hergestellt und analysiert. Auch dann, wenn es nicht für die Matrixeffekte (Wirkungen aufgrund von Komponenten von einer anderen als der Analyt-Probe) zu berücksichtigen.
    2. Quantifizierung mittels internerPeptid-Standards (empfohlen):
      1. Für jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Werte und entsprechende Schwer markierten internen Standardpeptid Sum_Peak_Area Wert, berechnen Sie die leicht / schwer Verhältnis. Verwenden Sie dieses Verhältnis als ein Maß für die entsprechende leichte / schwere Peptid molaren Häufigkeitsverhältnis, das molare Fülle der biologischen Probe-Peptid zu berechnen. Insbesondere entspricht die biologische Probe Peptid molaren Überfluss der internen Peptidstandard molaren Überfluss multipliziert mit dem leicht / schwer Sum_Peak_Area Verhältnis.
      2. Für jeden biologischen replizieren und Zielpeptid, identifizieren den linearen Bereich der LC-SRM Quantifizierung durch Erstellen einer Standardkurve unter Verwendung einer linearen Regression. Insbesondere zeichnen die internen Peptidstandard molaren Überfluss Werte im Vergleich zu den schwer / leicht Sum_Peak_Area Verhältniswerte (beachten Sie, dass die biologische Probe Masse konstant ist über die Datenmenge). Verlangen, dass jede biologische Probe Peptid Sum_Peak_Area Wert im linearen Bereich ist (typicFall sollte nur die lineare Komponente des dynamischen Bereichs verwendet werden; beliebige nichtlineare Komponente sollte mit äußerster Vorsicht verwendet werden). Ebenso führen Sie diesen Schritt für jede Zielpeptid Übergang.
        Hinweis: Analyt Quantifizierung mit LC-QqQ-SRM sollte linear über einen weiten Dynamikbereich (~ 10.000) sein. Am unteren Ende wird das Hintergrundsignal (random MS Rauschen plus reproduzierbare Signal von koeluierender Analyten) Quantifizierung Genauigkeit und Präzision zu reduzieren. Am oberen Ende wird Detektor Sättigungsnichtlinearität verursachen (schließlich kann dies dazu führen, Elutionsprofile flach ab einer bestimmten Signalstärke sein).
  14. Falls führen eine globale Normierungs für die Proben, wie beispielsweise eine zentrale Tendenz Normalisierungs 50, um geringe Unterschiede in der Probenmenge vor der Spiking-in der internen Peptidstandards zu korrigieren. Wenn nötig, verwenden Sie nur die Hauswirtschaft Proteine ​​aus Schritt 1.1.
  15. Bei Bedarf unterstellen fehlen quantificatIonen-Werte 51,52.
    Hinweis: Es ist unangemessen, einfach ersetzen fehlende Werte durch die Hälfte der unteren Bestimmungsgrenze (LLOQ) oder Halb der Nachweisgrenze (LOD), da dies würde künstlich reduzieren Quantifizierung Varianz und konnte in einem statistischen Test zur Folge haben (zB eine ANOVA ), die ein falsch positives Ergebnis (ein Typ-I-Fehler). Allerdings ignoriert fehlende Werte können auch problematisch sein. Zum Beispiel, wenn die Hälfte der wahren Fülle Werte unter der Nachweisgrenze, und die andere Hälfte über dem LLOQ, dann die mittlere Überfluss beobachtet würde überschätzen die meine wahre Fülle.
  16. Stellen Sie sicher, dass die Tests erfüllen die allgemein akzeptierte Richtlinien für die LC-SRM 23-25. Bemerkenswert ist, erfordern, dass der Variationskoeffizient der Quantifizierungswerte typischerweise ≤25% für klinische Assays und ≤35% für die nicht-klinischen Tests 25. Für LC-SRM-Assays zur Gesundheitsversorgung oder tierärztlichen Produkten oder Dienstleistungen, die für die Regulierungs App berücksichtigt werdenroval, verlangen, dass die Tests die strengeren Genauigkeitsanforderungen für solche Tests zu erfüllen: "Die je Konzentration bestimmt Präzision sollte 15% des Variationskoeffizienten (CV) mit Ausnahme der LLOQ, wo es sein sollte 20% des nicht überschreiten CV "23,24.

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Representative Results

Die Entwicklung von Vorhersageberechnungsmodelle von Signalübertragungswegen ist eines der grundlegenden Ziele der Systembiologie 53. Leider ist auch für Signalwege, die ausführlich untersucht worden und haben eine hohe klinische Bedeutung, es ist noch nicht allgemein möglich, quantitativ vorherWegs Verhalten in Reaktion auf Störungen (beispielsweise gilt dies für die MAPK / ERK-Weg 54). Vor kurzem hat eine Untersuchung angestellt gezielte Proteomik, Transkriptomik und rechnerische Modellierung und Simulation, um die Maus-Makrophagen-Chemotaxis Signalweg 56 zu studieren. Der Schwerpunkt der Untersuchung war Sphingosin-1-Phosphat vermittelte Chemotaxis von RAW 264.7-Zellen (eine Maus Monozyten / Makrophagen-Zelllinie). Um Weg Modellierung zu erleichtern, wurden LC-SRM-Assays entwickelt und durchgeführt, um die absolute Fülle der Chemotaxis Signalweg Proteinen innerhalb RAW 264.7-Zellen zu messen. Die erhaltenen Werte waren Fülle Verwendungd als Parameter der Weg-Modells.

Die Gesamtversuchsschema (Figur 1) beginnt mit einer Liste von Zielproteinen, die G i2, einen heterotrimeren G-Protein-α-Untereinheit enthalten. Der Erfolg des Gesamtprotokolls ist stark abhängig von der Wahl des Peptids, die Ziele und proteo quantotypic sind wie YDEAASYIQSK. Mischungen von externen Peptidstandards hergestellt und durch Schrotflinte LC-QqQ-MS (/ MS) analysiert. Das resultierende YDEAASYIQSK Tandem-Massenspektrum wurde von mehreren Fragmentionen zusammengesetzt, und es hatte eine niedrige Hintergrund (Abbildung 2). Die Spektren wurden verwendet, um LC-SRM Ziel Listen, die die Top Ten der intensiven Fragmentionen pro Vorläuferionen zu komponieren.

Ein Gemisch aus 409 externe Peptidstandards ("JPT409") wurde dreifach durch qualitative LC-SRM analysiert (Daten nicht gezeigt). Diese Stichprobe umfasste drei G i2 Peptide, und die Identifizierung von allen dreien warbeurteilt, zuversichtlich zu sein. Anschließend RAW 264.7 Proben (biologische Replikate "RAW1" und "RAW2") und die JPT409 Probe wurden jeweils in doppelter Ausführung durch qualitative LC-SRM analysiert (zwei LC-SRM technische Replikate) (diese sechs LC-SRM-Analysen wurden durchgeführt, wie als ähnlich möglich). Die YDEAASYIQSK Peptid wurde souverän in allen sechs Analysen identifiziert (3A - C). Die YDEAASYIQSK Gangsintensitätsmuster waren konsistent über die sechs LC-SRM-Analysen, und diese waren in etwa vergleichbar mit der Schrotflinte LC-MS (/ MS) Muster (die "Library" Replikation von Figur 3C).

Das Muster der Übergangs Intensitäten allein nicht immer ausreichend für die zuversichtlich Identifizierung eines Peptids. Das Peptidhydrophobie und gemessen LC-Retentionszeit müssen konsistent sein. Auch müssen die externen Peptidstandards und die entsprechenden biologischen Probe Peptide haben ungefährgleich Retentionszeiten. Die Hydrophobie (geschätzt unter Verwendung der SSRCalc Version 3.0 100 Å Algorithmus 55) und beobachteten Retentionszeit von YDEAASYIQSK erwiesen sich Einklang (4A) ist. Auch wurde die YDEAASYIQSK Verweilzeit unter Verwendung sowohl der RAW 264.7 Analysen und die Analysen der externen Peptidstandards gemessen und alle der Verweilzeit Werte waren annähernd gleich (4B).

Die meisten der qualitative LC-SRM-Analysen der biologischen Proben waren erfolgreich, so entspricht schweren markierten, gereinigt, quantifiziert internen Peptid-Standards wurden hergestellt und versetzt in RAW 264.7-Zelllysaten. Isotopenverdünnungsreihe LC-SRM wurde verwendet, um Proben, die aus den internen Peptidstandards allein (Probe "R0"), die interne und die externe Peptidstandards (Probe "R1") und sechs RAW 264.7 biologischen Replikaten (Proben "R2" zu analysieren - "R7"). Zwei different Proteindenaturierungsmittel wurden verwendet, um für mögliche Protein Solubilisierung, Denaturierung, Alkylierung und / oder Verdauung Probleme, die genaue Zielproteinquantifizierung untergraben könnten testen (Proben R2-R4 verwendet Harnstoff und Proben R5-R7 verwendet RapiGest SF). Die leichte und schwere Formen der YDEAASYIQSK enthalten nahezu identisch Übergang Intensitätsmuster und Elutionsprofile (5A - C). LC-SRM summiert Peakflächenverhältnisse wurden als ein Maß für die relative Häufigkeit Peptid verwendet, und die YDEAASYIQSK Verhältnisse wurden verwendet, um G i2 Fluss Werte in Einheiten von Kopien pro RAW 264.7-Zellen zu berechnen. Parallel dazu eine zweite G i2 interne Peptidstandard (IAQSDYIPTQQDVLR) wurde verwendet, um quantitative G i2 LC-SRM-Assays der gleichen RAW 264.7 Proben durchzuführen, und die beiden Assays erzeugte hoch ähnlichen G i2 Häufigkeitsmessungen über alle biologischen Wiederholungen (Fig 5D). Die Vereinbarung der beiden G i2 LC-SRM-Assays genaue und präzise waren.

Insgesamt wurden 35 Proteine ​​mit 58 internen Peptidstandards (Tabelle 1) quantifiziert. Bemerkenswert ist, die LC-SRM-Assays der internen Proteinstandard, waren genau und präzise (Firefly Luziferase Schritt 4.11). Die umfassende Reihe von Skyline von Daten aus dieser Untersuchung ist in der Panorama online LC-SRM-Datenbank (in der Manes_RAW_Chemotaxis Ordner https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view) zur Verfügung.

Abbildung 1
Fig. 1: Übersicht der Protokoll Drei vorläufige Zielpeptide für G i2 (a heterotrimeren G-Protein-α-Untereinheit) wurden für externe Peptidsynthese Standard ausgewählt. Dies waren analySchrotflinte durch LC-MS (/ MS) zed zu drei G i2 LC-SRM-Assays zu entwickeln, und diese Tests wurden verwendet, um qualitative Analysen biologischer Proben durchzuführen. Alle drei G i2 Zielpeptide identifiziert wurden, und zwei wurden für interne Peptid-Standardpräparat ausgewählt. Trypsin spaltbare "JPT-Variablen" verwendet, um die interne Peptid-Standards unter Verwendung von UV-Spektrophotometrie quantifiziert. Die internen Peptidstandards wurden verwendet, um quantitative G i2 LC-SRM-Assays von RAW 264.7 Proben durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Fig. 2: Shotgun LC-MS (/ MS) Die dargestellte Massenspektrum stammte aus der Analyse von einer der G i2 externen Peptidstandards (YDEAASYIQSK). Bei dieser VorstufeIonen, die Top Ten der am intensivsten Übergänge wurden für die LC-SRM (mit Ausnahme der a1 1+ Fragment-Ion aufgrund seiner kurzen Länge) ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Fig. 3: Qualitative LC-SRM von G i2 Die YDEAASYIQSK Chromatogramm vom JPT409 Analysen enthielt eine sehr geringe Hinter und das Peptid wurde vertrauens identifiziert (A). Die entsprechenden RAW 264.7 Analysen ergab mehr Hintergrundsignal, aber das Peptididentifikation noch eindeutiger (B). Die relativen Übergangsintensitätsmuster waren konsistent über alle sechs LC-SRM-Analysen (zwei technische Replikate von drei unabhängigen Mustern), und diese waren in etwa similar an die entsprechende Schrotflinte LC-MS (/ MS) Muster (die "Library" Wiederholung) (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4: Peptid Retentionszeit-Vorhersage und Unterschiede zwischen Läufen wurde eine lineare Regression unter Verwendung der geschätzten Hydrophobizität berechneten und gemessenen qualitative LC-SRM Elutionszeit von allen Zielpeptide und die vorhergesagten und gemessenen Elutionszeiten YDEAASYIQSK waren konsistent (A). . Darüber hinaus ist die Konsistenz der beobachteten Elutionszeit jedes Peptids für die LC-SRM-Analysen bestimmt wurde. Die Elutionszeiten YDEAASYIQSK spannt einen Bereich von ca. 40 sec, die im Einklang mit der Präzision des LC-SRM Instrument, das verwendet wurde, war (Wertesind die Peakspitze Zeit +/- die Halbwertsbreite-max, und auch die volle Breite an der Basis des Spitzen) (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Fig. 5: Quantitative LC-SRM von G i2 Die Übergangs Chromatogramme der biologischen Probe Peptid (A) und der inneren Peptidstandard (B) hatte konsistent relativen Übergang Intensitäten und wurden aufsummiert, (C) (dargestellt ist die "R2" Analyse für YDEAASYIQSK mit 10 fmol interne Peptid-Standard). Den leichten und schweren Elutionsprofile wurden konsistent (C) und das Verhältnis der Fläche unter diesen Kurven wurde als Maß des lig verwendetht / schwere Peptid Hülle und Fülle. Eine zweite G i2 interne Peptidstandard (IAQSDYIPTQQDVLR) wurde für die quantitative LC-SRM parallel = 12 CV = 8,38 verwendet, und die resultierende G i2 Fluss Werte waren konsistent über sowohl den sechs biologischen Replikaten und den beiden Zielpeptide (insgesamt n und %) (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<td> 68.467
UniProt Beitritts Zielprotein Zielpeptid Fülle (fmol / & mgr; g) Fülle (Kopien / Zelle, normalisiert) CV
P08659 Luciferase (UV bei 280 nm) 23,824 n / A n / A
P08659 Luciferase VVDLDTGK 24,103 n / A 7%
P08659 Luciferase VVPFFEAK 24,717 n / A 4%
P60710 Actin, zytoplasmatische 1 IWHHTFYNELR 760,448 61762598 3%
P16858 GAPDH LISWYDNEYGYSNR 357,803 28906524 14%
P06151 Lactatdehydrogenase LLIVSNPVDILTYVAWK 129,623 10633145 30%
P99024 Tubulin β 5 ALTVPELTQQVFDAK 78,765 6398971 3%
P20152 Vimentin SLYSSSPGGAYVTR 121,100 9807488 10%
P60766 CDC42 DDPSTIEK 86,647 6957317 27%
P60766 CDC42 QKPITPETAEK 26,475 2153669 6%
Q8C3J5 DOCK2 ETLYETIIGYFDK 1,459 118.539 15%
Q8C3J5 DOCK2 ISSSPTHSLYVFVR 1,795 143.440 33%
Q8BPU7 ELMO1 ALTTKPSSLDQFK 2,302 186.754 7%
Q8BPU7 ELMO1 SAIDISILQR 1,244 99.728 25%
Q8BGM0 FGR GAYSLSIR 1,099 89.473 17%
Q8BGM0 FGR WTAPEAALFGR 0,319 24.766 6%
P27601 G & agr; 13 GIHEYDFEIK 0,843 15%
P27601 G & agr; 13 VFLQYLPAIR 1.295 106.176 23%
P08752 G & agr; (i) 2 IAQSDYIPTQQDVLR 10.900 885.701 2%
P08752 G & agr; (i) 2 YDEAASYIQSK 9,774 790.616 9%
Q9DC51 G & agr; (k) EYQLNDSASYYLNDLDR 6,574 537.862 15%
Q9DC51 G & agr; (k) ISQTNYIPTQQDVLR 3,504 285.784 10%
P62874 Gß 1 AGVLAGHDNR 17,078 1385578 4%
Q9CXP8 G & ggr; 10 DALLLGVPAGSNPFR 2,167 179.178 36% P63213 G & ggr; 2 EDPLLTPVPASENPFR 3,284 266.360 8%
Q80SZ7 G & ggr; 5 VSQAAADLK 6,087 493.512 6%
P08103 HCK GPVYVPDPTSSSK 1,143 93.044 12%
P08103 HCK IIEDNEYTAR 0,944 77.147 19%
P43406 Integrin α V AGTQLLAGLR 0,276 22.264 32%
P43406 Integrin α V SHQWFGASVR 0,443 34.235 5%
P25911 LYN VIEDNEYTAR 1,461 119.377 13%
Q5SW28 PI3K regulatorischen 5 AGFPGILDTASPGK 0,301 24.331 11%
Q8K3B3 PI3K regulatorischen α LYEEYTR 0,472 38.592 16%
Q8K3B3 PI3K regulatorischen α TWNVGSSNR 0,524 42.697 12%
Q8K3B3 PI3K regulatorischen α VLSEIFSPVLFR 0,440 35.902 20%
Q5U3K7 PI3K regulatorischen β DTPDGTFLVR 0,188 15.262 30%
Q5U3K7 PI3K regulatorischen β IAEIHESR 0,282 22.561 13%
Q0VGQ5 PI3K α LINLTDILK 0,102 8494 38%
Q8CI98 PI3K δ HEVQEHFPEALAR 0,178 14.566 22%
Q8CI98 PI3K δ ITEEEQLQLR 0,481 38.709 24%
Q9ES52 PIP3 5-Phosphatase 1 IVVLAKPEHENR 0,486 39.194 19%
Q9ES52 PIP3 5-Phosphatase 1 LSQLTSLLSSIEDK 2,056 167.123 7%
Q69ZK0 PIP3 abhängige Rac GEF 1 DSVLSYTSVR 0.647 52.712 32%
Q69ZK0 PIP3 abhängige Rac GEF 1 NQLLLALLK 0,354 27.425 5%
Q9CQE5 RGS 10 ASSQVNVEGQSR 2,460 199.782 4%
Q9CQE5 RGS 10 WASSLENLLEDPEGVQR 20,647 206.005 11%
Q9CX84 RGS 19 AEANQHVVDEK 0,495 39.753 21%
Q9CX84 RGS 19 LIYEDYVSILSPK 0,846 68.481 22%
B9EKC3 Rho GAP 5 DGLAQELANEIR 0,448 34.653 10%
Q99PT1 Rho GDI 1 SIQEIQELDK 3,156 267.063 16%
Q99PT1 Rho GDI 1 VAVSADPNVPNVIVTR 37,077 3006168 5%
Q61599 Rho GDI 2 LNYKPPPQK 37,975 3086596 3%
Q61599 Rho GDI 2 YVQHTYR 21,436 1711908 47%
Q61210 Rho GEF 1 FDGAEGSWFQK 2,149 176.139 47%
Q61210 Rho GEF 1 SGLELEPEEPPGWR 2,911 236.483 8%
Q9QUI0 RhoA QVELALWDTAGQEDYDR 43,500 3532438 8%
P70336 ROCK2 GAFGEVQLVR 0,527 42.800 23%
P70336 ROCK2 IYESIEEAK 1.011 83.794 33%
P70336 ROCK2 LEGWLSLPVR 0,573 48.259 22%
Q8R0X7 S1P-Lyase 1 AGYPLEKPFDFR 1,787 147.043 27%
Q8R0X7 S1P-Lyase 1 TPEIVAPESAHAAFDK 3,562 291.791 18%

Tabelle 1: Quantitative LC-SRM von RAW 264.7-Zellproteinen Fünfunddreißig RAW 264.7-Zellproteine ​​wurden mit achtundfünfzig internen Peptidstandards und sechs biologischen Replikaten quantifiziert.. Fünf der Zielproteine ​​wurden Housekeeping Proteine ​​(Actin, GAPDH, Lactatdehydrogenase, Tubulin und Vimentin) und quantifiziert, um die Normalisierung durch biologische Proben (Schritt 1.1) ermöglichen. Zusätzlich wurde eine interne Proteinstandard-spiked ineinander Zelllysat und quantifiziert durch LC-SRM (4,765 pmol von Firefly Luziferase pro 200 & mgr; g Probe; 98% rein durch SDS-PAGE; spektrophotometrisch bei 280 nm quantifiziert; Schritt 4.11). Die CV-Werte wurden in den sechs biologischen Replikate mit den weltweit normierten Fülle Werten berechnet (mit Ausnahme der Luciferase; Schritt 5.15).

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Discussion

Absolute Proteinquantifizierung ist für ein sehr breites Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, wie Biomarker-Validierung und Signaltransduktionsweg Modellierung. Vor kurzem hat gezielte Proteomik mit LC-SRM von Verbesserungen an zahlreichen Technologien, einschließlich Peptidstandardpräparat, HPLC, QqQ-MS und LC-SRM Datenanalyse profitiert. Folglich ist es eine leistungsfähige Alternative zu Immunoassays. Immunoassays können extrem empfindlich und Hochdurchsatz, aber die Entwicklung einer robusten Immuntest kann sehr schwierig sein, weil Immunoassays können anfällig für Kreuzreaktivität und / oder Störungen, unvereinbar mit Zell- / Gewebe Lyse / Homogenisierung Methoden sein, und / oder nicht zugänglich Multiplexen 5,8. Zum Beispiel ist der umfassendste Test auf Kreuzreaktivität, um die Immuntest unter Verwendung von Proben, die von Gen-Knockouts, die schwierig sein kann, um vorzubereiten entstand durchzuführen.

Dieses Protokoll beschreibt Ziel Peptide Auswahl, LC-SRM Assayentwicklung, qualitative und quantitative LC-SRM und LC-SRM Datenanalyse. Es wurde verwendet, um die absolute Häufigkeit von 36 Chemotaxis Weg Proteine ​​in RAW 264.7 Zellen 56 zu messen, aber ihre Anwendbarkeit weit über diese spezifische Anwendung. Obwohl es wurde entwickelt, um Proteine ​​in Zellpellets zu quantifizieren, könnte es für die Analyse von anderen biologischen Proben (zB biofluids) und anderen SRM Ziele (zB Phosphopeptide) eingestellt werden. Zum Beispiel die Änderung der Homogenisierung und / oder die Proteinverdauung Protokoll kann die Solubilisierung, Denaturierung, Alkylierung, Verdauung und Quantifizierung von besonders schwierig Zielproteine ​​(beispielsweise Membranproteine) deutlich verbessern können, oder Analyse von besonders schwierigen Proben (zB Proben ermöglichen mit <100 ug Proteinmasse).

Die anfängliche Auswahl der Zielpeptide ist kritisch, kann zeitaufwendig sein. Für hundreds von Zielproteinen kann ein Ad-hoc-Punktzahl für jedes Kriterium verwendet werden kann, und die vorläufige Soll Peptide können auf der Basis der Summe der Punkte gewählt werden, wie dies zuvor 56 geschehen. Alternativ kann diese Analyse mit PeptidePicker, ein Web-Interface, das Zielpeptid Auswahl 30 vereinfacht automatisiert werden (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/).

Nachdem die Ziel-Peptide wurden ausgewählt, und die LC-SRM-Assays entwickelt wurden, ist es entscheidend, dass die qualitative LC-SRM-Assays der biologischen Proben durchgeführt, da sogar ein hochproteo und quantotypic Peptid nicht nachweisbar sein, wenn das Protein an ausgedrückt werden Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze des Instruments, oder wenn die Hintergrundstörung ist besonders problematisch. Eine zweite Dimension der Trennung (zB starken Kationenaustausch-HPLC, Umkehrphasen-HPLC-pH und gelfreie Elektrophorese) kann Proteom Tiefe zu erhöhen, sondern erforderndeutlich mehr Zeit Instrument und Datenanalyse. Alternativ kann eine Bereicherung Strategie (zB Peptid- und Protein-Ebene immunoenrichment und Zellfraktionierung) Proteom Tiefe verbessern und Immunodepletion hoch vorkommenden Proteine ​​können verwendet werden, um Störungen durch koeluierender Analyten zu reduzieren.

LC-SRM von ~ zehn Proben für ~ ~ Hunderte oder Tausende von Übergängen erfordert in der Regel umfangreiche Instrumentenzeit. Wenn es nicht für diese Studie verwendet, LC-SRM Planung (Messübergänge während vorgegebenen Elutionszeit Fenster) ermöglicht die Analyse von Übergängen pro Lauf. Auch Planung reduziert die SRM Arbeitszyklus während der relativ freien Perioden des LC-Gradienten, und dies kann zu einer verbesserten Peptid Identifizierung und Quantifizierung führen. Jedoch erfordert, Scheduling, dass das Peptid Elutionszeit vertrauens aus qualitativer LC-SRM-Analyse bestimmt werden. Subtile Änderungen in der Probenvorbereitung, die LC-MS-Gerät,oder der LC-MS-Methode kann dazu führen, Terminplanung zu beschneiden oder sogar ganz versäumen Zielpeptide. So wurden beispielsweise bei der biologischen Probe YDEAASYIQSK Elutionsprofile etwas verschoben im Verhältnis zu denen der externen Standardpeptid (4B), die möglicherweise durch Matrixeffekte.

Zusammenfassend wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Entwicklung und Anwendung von LC-SRM für absolute Quantifizierung von Proteinen präsentiert. Absolute Quantifizierung von Proteinen, die durch LC-SRM wurde bereits gezeigt, reproduzierbare zwischen Laboratorien 16,19 sein. Proteomics-Technologien, einschließlich Probenvorbereitung (zB Automatisierung), Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Datenanalyse, werden rasch zu verbessern, und ermöglicht es LC-SRM praktisch für Großforschung und klinische Anwendungen zu werden. Die Spezifität, Empfindlichkeit, Genauigkeit, reproduzierbar und mit hohem Durchsatz von quantitativen LC-SRM ist es ein leistungsfähiges Werkzeug für die Grundlagenforschung und der Biomedizin.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade Fisher A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit Fisher 23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm BioSpec Products 11079101z
Bestatin hydrochloride Sigma B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) Lonza 12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 Gibco 15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11550
Cell culture L-glutamine Sigma G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Gibco 10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v Lonza 17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers Nexcelom Bioscience CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules Fisher A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep Marienfeld-Superior 0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2 Mediatech 25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id Polymicro Technologies 1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene SUN SRI 200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone SUN SRI 500-061
Luciferase, from Photinus pyralis Sigma L9506-1MG
Pepstatin A EMD Millipore 516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) EMD Chemicals 9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail Roche 04906837001
RapiGest SF Waters 186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge Waters WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position Waters WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb Fisher 03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
SpeedVac vacuum concentrator Fisher SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Tube decapper for Micronic tubes USA Scientific 1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile Sarstedt 72.694.006
Urea Sigma U0631-500g
Water, LC-MS grade Fisher W6-1

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References

  1. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
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