Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

1Cell Biology, UMC Groningen, 2Clinical Genetics, Erasmus MC Rotterdam
* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

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Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

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Abstract

Großflächige 2D-Elektronenmikroskopie (EM) oder nanotomy ist das Gewebe weite Anwendung nanoskaliger Auflösung Elektronenmikroskopie. Andere und wir bisher angewandten großen Maßstab EM auf die menschliche Haut Pankreasinseln, Gewebekultur und ganze Zebrabärblingembryonen 1-7. Hier beschreiben wir ein universell anwendbares Verfahren für das Tissue-Skala Scanning EM für unvoreingenommene Erkennung von Unter zellulären und molekularen Eigenschaften. Nanotomy wurde angewendet, um die gesunde und eine neurodegenerative cerebra- zu untersuchen. Unsere Methode basiert auf standardisierten EM Probenvorbereitung Protokolle: Fixierung mit Glutaraldehyd und Osmium, gefolgt von Epoxy-Harz Einbettung, Ultradünnschnitt und Montage von ultra-dünnen Schnitte auf ein Lochgitter, gefolgt von Post-Färbung mit Uranylacetat und Blei. Großflächige 2D-EM Mosaikbilder werden mit einem Scannen erfassten EM an einen externen großen Bereich Scan-Generator mit Raster-Transmissions-EM verbunden (STEM). Groß angelegte EM-Bilder sind in der Regel ~ 5-50 G Pixel in Größe und am besten mit diesen zoombaren HTML-Dateien, die in einem beliebigen Web-Browser, ähnlich wie Online-geographischen HTML Karten geöffnet werden kann. Dieses Verfahren kann auf (human) Gewebe, Querschnitte von ganzen Tieren angewendet werden , sowie Gewebekultur 1-5. Hier Zebrabärbling Gehirne wurden in einer nicht-invasiven Ablation neuronalen Modell analysiert. Wir visualisieren innerhalb eines einzigen Datensatzes Gewebe, zellulärer und subzellulärer Veränderungen, die in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen und Mikroglia quantifiziert werden können, die Makrophagen des Gehirns. Zusätzlich nanotomy die Korrelation von EM mit Lichtmikroskopie (CLEM) 8 auf dem gleichen Gewebe erleichtert, da große Oberflächenbereiche zuvor Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, können anschließend in großen Bereich EM unterzogen werden, was in der Nano Anatomie (nanotomy) von Gewebe. Insgesamt ermöglicht nanotomy unvoreingenommene Erkennung von Features auf EM-Ebene in einem Gewebe weiten quantifizierbare Weise.

Introduction

Neue technische Entwicklungen haben die Vielseitigkeit, die Anwendbarkeit und quantitative Natur der EM verbessert, was zu einer Wiederbelebung der Ultrastrukturanalyse führt. Die Fortschritte sind 3D - EM, in großem Maßstab 2D - EM und verbesserte Verfahren und Reagenzien für korrelierte Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (CLEM) andere Formen der mikroskopischen Analyse zum Vergleich direkt auf die EM - Ebene 8-10. Großflächige 2D-EM ist besonders geeignet zu quantifizieren oder (Roman) Krankheit Merkmale für die menschliche Pathologie identifizieren, Tiermodelle für Krankheiten und Gewebekulturmodelle untersuchen. Aufgrund der typischerweise kleinen Sichtfeld ist es schwierig, Veränderungen bei hoher Vergrößerung an ein Gewebe breiten Skala zu korrelieren, sowie unbiasedly und quantitativ ultrastrukturelle Merkmale analysieren.

Für pathologische Analyse von menschlichem Gewebe oder die Beurteilung der Pathologie in Tiermodellen, Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt Abschnitte von fixierten und in Paraffin eingebettet Formaldehyd (FFPE) tissue ist der Standard. Neben einfachen H & E-Färbung Immunmarkierung auch zur Identifizierung pathologischen Anomalien durchgeführt. Wenn solche Gewebe an der EM-Ebene, spezifische Zelltypen untersucht werden konnten, und subzellulären Veränderungen identifiziert werden konnten. Die unvoreingenommene Art von großen EM ermöglicht unerwartete und neuartige Merkmale der Krankheit zu finden. Durch groß angelegte EM Bereiche Quadratmillimetern können sichtbar gemacht werden. Wir und andere vorher nanotomy angewendet Pankreasinseln 4, Zellkultur 2, Rattenhirn 3, Haut und Schleimhaut 7 und ganze Zebrabärblingembryonen 1,5 (www.nanotomy.org) an Ratten. Zebrabärblinge sind sehr gut geeignet für in - vivo - Bildgebung, in besonders Zelltypen zu visualisieren, die den Zugang in Säugetiergewebe schwer einschließlich Gehirn Immunzellen 11. Hier ist die nanotomy Verfahren wird im Detail beschrieben, angewandt auf Koronalschnitte von Zebrabärbling Köpfe unterzogen bedingten neuronalen Ablation durch Umwandlung von Metronidazol durch neuronaleausgedrückt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle Rohdaten werden als zoombare HTML-Dateien vorgestellt, um Änderungen Gewebe Skala molekularen Visualisierung. Die Darstellung der Rohdaten ermöglicht unvoreingenommene Analysen der Datensätze aus anderen Winkeln von Experten weltweit.

Protocol

Alle Versuche mit Zebrabärblingembryonen wurden von der Tierversuchskommission der Universität von Groningen nach nationalen und EU-Richtlinien zugelassen.

1. Probenvorbereitung

  1. Fixation and Embedding
    1. Fixierung
      1. Betäuben Fischlarven in Tricaine (0,003%) hinzugefügt , um die E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7,6) Zebrabärbling Wasser und Test für die Tiefe der Anästhesie durch leichtes Stoßen mit einer 200 ul Pipettenspitze unter dem Mikroskop Dissektion , bis die Beweglichkeit nicht mehr erkannt (Abbildung 1A).
      2. Bei der Bearbeitung von Proben für die korrelative EM nach in vivo Bildgebungsdatenerfassungs mittels konfokaler oder 2 Photon Imaging in 1,8% Agarose wie beschrieben, 5,15 fix Larven in Agarose mit 4% PFA in PBS , das Triton-X-100 (0,05%).
      3. Schneiden Sie Larven aus Agarose und Verfahren fürGroß EM 5.
      4. Fix Larven in frischem 4% Paraformaldehyd in PBS, das Triton-X-100 (0,05%) für 2 h bei Raumtemperatur in Kunststoffröhrchen.
        Hinweis: Zellen in Kultur gezüchtet (in vitro) kann direkt in Glutaraldehyd fixiert werden, wie im nächsten Schritt (1.1.1.5).
      5. Entfernen Lösung und mit 100 & mgr; l 0,5% PFA, 2% Glutaraldehyd (GA) und 0,1 M Natriumcacodylat (pH 7,4). Lagern über Nacht bei 4 ° C. Rinse Proben zweimal in 0,1 M Natriumcacodylat.
      6. Schneiden larvalen Köpfe rostral zur hindbrain Eindringen von Osmium zu erleichtern. Verwenden feinen Spritzen / Zange.
      7. Postfix - Larven in 1% Osmiumtetroxid (OsO 4) /1.5% Kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6]) in 0,1 M Natriumcacodylat auf Eis für 2 Stunden und Spülen 3 x 5 min in bidestilliertem H 2 O.
      8. Entwässern in Ethanol durch 20 min Inkubation in steigenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70%, 3 x 100%).
    2. Verankerung
      1. Bereiten Epoxidharz nach Standardrezepturen in EM-Labors eingesetzt.
        Hinweis: Wir verwenden Epoxidharz wie folgt: mix 19,8 g glycid Ether 100, 9,6 g 2-Dodecenylbernsteins Säureanhydrids und 11,4 g Methylnadinsäureanhydrid einen Magnetrührer. In 0,5 g DMP-30 (Tris- (dimethylaminomethyl) phenol) und wieder mischen.
      2. Larven über Nacht in 50% Epoxyharz in Ethanol (v / v) Inkubieren während des Drehens (RT).
      3. Ersetzen verdünnte Epoxy-Harz mit reinem Harz. Inkubieren für 30 Minuten, fügen Sie frisches Harz wieder und Inkubation für weitere 30 min. Wieder das Harz aktualisieren und dann 3 h bei RT, 15 min bei 58 ° C und noch 1 h bei RT unter niedrigem Druck (200 mbar) und anschließend inkubieren.
      4. Richten Sie die Köpfe in handelsüblichen Silizium flach Einbettschälchen unter einem Präpariermikroskop mit einer Nadel oder Zahnstocher mit dem vorderen Blick auf die Seite der Form oder nach Bedarf (1B).
      5. Polymerisieren Epoxy-resin bei 58 ° C über Nacht. Wenn Epoxidharz an einem anderen Tag noch zu weich erlauben ist zu polymerisieren und bei 58 ° C aushärten. Test-Steifigkeit durch Druck mit einer Pinzette Anwendung. Wenn dies leicht lässt eine Vertiefung an einem anderen Tag erlauben bei 58 ° C zu polymerisieren und zu härten. Wenn Probe vollständig ausgehärtet ist, um Trimmen und Schneiden fortzufahren.
      6. Abschneiden von überschüssigem Harz von den Stub Verwendung Rasierklingen (1B).
  2. Sectioning, der Kontrast und die Montage
    1. sectioning
      1. Abschnitt Epoxidharz Block ein Ultramikrotom verwenden.
      2. Verwenden Sie ein Glas Messer oder einen Diamanten histoknife zu schneiden Semidünnschnitten (500 nm) für Toluidinblau / Basisfuchsinlösung (1D) Färben der richtige Positionierung zu erkennen.
      3. Übertragen Semidünnschnitten auf Objektträger, indem sie sie mit einem Glas Pasteur-Pipette, deren Spitze in einer Flamme durch Schmelzen geschlossen wurde Kommissionierung. Trocknen auf einer heißen Platte until kein Wasser gelassen wird. Fleck für 10 sec mit 1% Toluidinblau in Wasser auf einer heißen Platte und nach 10 sec mit 0,05% basischem Fuchsin in 1% Natriumtetraborat mit Wasser, Beize Spülen. Untersuchen Sie mit einem normalen Lichtmikroskop mit 10facher bis 40facher.
      4. Wenn die richtige Stelle / Orientierung im Gehirn erreicht wird, weiterhin die Epoxidharz - Block mit einem Diamantmesser sectioning ultradünne Schnitte zu schneiden (~ 70 nm; 1E)
      5. Verwenden Sie leicht identifizierbare anatomische Strukturen in und um das Gehirn, einschließlich Riechgruben, Augen, grau-weißen Substanz Grenzen, die Region von Interesse zu identifizieren während Ultradünnschnitt und die Schneidewinkel einzustellen, wenn die Probe gekippt wird.
      6. Abschnitt Montage auf Single - Slot - L2 x 1 Kupfergitter (Abbildung 1F), mit dem Erwerb von Gitterstäben ohne Unterbrechung zu ermöglichen. Verwenden Sie Formvar beschichteten Gitter die Abschnitte zu unterstützen.
    2. kontrastierend
      1. Stain ultradünne Schnitte auf dem Gitters für 2 min in 2% Uranylacetat in Methanol durch Reynolds gefolgt Bleizitrat für weitere 2 min 16.

2. Image Acquisition

  1. Large Scale STEM
    Hinweis: Wir verwenden Scan - EM mit einem externen Scan - Generator kann mehrere große Sichtfelder mit hoher Auflösung zu erwerben 3,5,7,17 ​​STEM - Detektion. Typischerweise erzeugt ein Bild auf diese Weise auf die Sichtfelder von ~ 100 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) -Bilder äquivalent ist, signifikant die Menge des Nähens zu verringern.
    1. Montagebeispiel in Mikroskop
      1. Platzieren Sie Gitter mit Abschnitt in der mehrere Gitterprobenhalter und Transfer in die Kammer des SEM.
    2. Die Ausrichtung des STEM - Detektor
      1. Setzen Sie das Gitter mit der Probe unter dem Balken und bewegen Sie ihn auf, so dass es etwa sein wird. 5 mm von der Linse Pol. Erwerben Sie ein Bild bei 20 kV unter Verwendung vondie in-Objektiv-Detektor.
      2. Konzentrieren Sie sich auf Gitterkante und passen bis 4,0 mm Arbeitsabstand.
      3. Bewegen Sie den Probenhalter in eine sichere Position und bringen in den STEM-Detektor.
      4. Zentrieren Sie das Loch des STEM-Detektor in dem Bildfeld durch die Anpassungen Schrauben während Bildgebung bei maximaler Geschwindigkeit mit dem in-lens-Detektor drehen.
      5. bringen Sie vorsichtig den Probenhalter zurück, die zwischen dem Objektiv Pol und dem Detektor gerade passt.
      6. Erwerben Sie ein Bild mit dem in-lens-Detektor sicher sein, auf der Schnittfläche zu sein.
      7. Wechseln Sie in den MINT-Detektion (Verstärkungsmedium und alle setzen Quadranten auf "minus") und ein Bild erwerben und wählen Sie den zu scannenden Bereich.
      8. Heben Beschleunigungsspannung bis 21 kV und warten auf eine Stabilisierung des Strahls (stabiles Bild wieder) und dann bis 29 kV in Schritten von 2 kV gehen.
    3. Aufnehmen von Bildern
      1. die Probe Pre-bestrahlen (Helligkeitsänderungen durch den E-Strahl verursacht werden) durch Zoomenaus, so dass die gesamte Fläche zu scannende passt das Bildfenster.
      2. Ändern Öffnung bis 120 & mgr; m (um den richtigen Dynamikbereich die Detektor Gewinne müssen einen Schritt reduziert werden).
      3. De-Fokus so dass das Bild unscharf wird.
      4. Machen Sie den Scan-Bereich so dicht wie möglich an die reduzierte Fläche Scan-Option.
      5. Stellen Sie Scan-Geschwindigkeit, so dass ein Rahmen in ca. abgetastet wird. 1 bis 2 Sekunden.
        Hinweis: Je nach der Größe und der Gewebe dieses typischerweise dauert ½ h (100 x 100 um FOV) zu bis zu 3 h (1,000 x 500 um).
      6. Zoom mindestens 100X in und um nur einen kleinen Bereich für 10 Sekunden.
        Hinweis: Wenn dieser Bereich nicht Helligkeit ändert sich im Vergleich zu seiner Umgebung, vor der Bestrahlung ist ausreichend.
      7. Bringen Sie die 30 & mgr; m Öffnung zurück (und STEM Gewinn mittel)
      8. Fokus auf die Probe.
      9. Richten Sie Öffnung der Wobbler (bei ~ 40.000facher Vergrößerung) verwendet wird.
      10. Während im Fokus der hellste Bereich / Funktion wählen, Scan-Geschwindigkeit eingestellt, dass Detailssichtbar sind.
      11. Im Mikroskop-Software stellen Sie die Helligkeit und den Kontrast, indem Sie vorsichtig das Histogramm beobachten alle Pixel im dynamischen Bereich zu halten. Machen Sie dasselbe für den dunkelsten Bereich / Funktionen.
      12. Zurück zum hellen Bereich und erneut prüfen. Seien Sie auf der sicheren Seite, so gibt es etwas Platz auf beiden Seiten des Histogramms ist.
      13. Verkleinern, so dass die gesamte Fläche, um das Abbildungsfenster gescannt passt, und starten Sie den großen Bereich Akquisitionsprogramm.
      14. Verwenden Sie den Assistenten Option, um ein Mosaik einzurichten durch einen Bereich auf dem Bildschirm auswählen. Verwenden Sie Pixel-Größe 2 - 5 nm je nachdem, was Details sind notwendig. Verwenden Sie Verweilzeit 3 ​​& mgr; s für STEM.
      15. Wählen Sie die Option "Autofokus auf vorherige Fliese", verwenden Sie die groß angelegte Erfassungssoftware Autofokus mit Standard-Firmeneinstellungen, Kontrollkästchen "überprüfen vor der Ausführung der Einstellung" und definieren, wo die Daten zu speichern.
      16. Drücken Sie "optimieren" Mikroskop-Einstellungen zu überprüfen.
        Hinweis: Jetzt wird die benötigte Zeit sein shbesitzen. Dies kann bis zu 1 x 0,5 mm Bereiche bis 72 h betragen.
      17. Im Fenster "maximale Kachel Auflösung" Typ 20.000 so einzelne Fliesen werden nicht größer als 20k x 20k, verhindert stumpfe Randeffekte. Drücken Sie auf "Ausführen".
      18. Wenn für die Überprüfung Fokus und Helligkeit / Kontrast (B / C) aufgefordert, schalten Sie Generator externe Scan und sorgfältig Fokus und Astigmatismus in der Mikroskop-Software einstellen. Nicht B / C ändern.
        Hinweis: Die Bühne bewegt werden kann und die Vergrößerung geändert, aber Vergrößerung muss wieder auf die gewünschte Pixelgröße eingestellt werden.
      19. Schalten Sie externe Scan-Generator wieder ein und drücken Sie auf "weiter".

3. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie groß angelegte EM-Datei-Viewer-Programm und öffnen Sie die Datei "Mosaik-Info". Dies öffnet alle gekachelten tif-Dateien. Diese ist vorzugsweise auf einem anderen Arbeitsplatz durchgeführt, um keine neuen Akquisitionen behindern.
  2. Wählen Sie die Option 'augesamte Mosaik zum Aufnähen (Parameter überlappen Modus auf die Hälfte, Schwellen näht 0,90, Rauschunterdrückung automatisch. Bei Heft Kriterien nicht in und manuell Fliese in Position zu bringen erfüllt, Zoom und klicken Sie auf "weiter wie ').
  3. Export als HTML-Datei, oder alternativ als einzelne TIF.
    Beachten Sie, dass für TIF exportieren könnte ein Downscaling benötigt werden. Fügen Sie die endgültige Pixelgröße in den Dateinamen für Messungen später.
  4. Führen Sie Anmerkungen in der TIF-Datei, indem es in einem Bildbearbeitungsprogramm zu öffnen. Parallel dazu öffnen Sie die zoombare html-Datei in einem Web-Browser für eine optimale Auflösung Beobachtung.

Representative Results

Groß angelegte EM-Datensatz von Koronalschnitte des Kopfes von 1-Wochen alten Zebrabärblingembryonen zeigt viele Gewebe und zelluläre Funktionen in einem einzigen großen Stufenbild (www.nanotomy.org).

Nanotomy Kontrolle Gehirnschnitte zeigt typische ultrastrukturelle Merkmale von Nervengewebe des rostralen forebrain einschließlich Geruchsfaserbündel, neuronale Kerne und neuronalen Unterfächer einschließlich Synapsen (2A, www.nanotomy.org). Zelltypen im Kopf, die unterschieden werden können, gehören Chondrozyten mit großen Vakuolen im Unterkiefer, osmiophilen Myelin der Riechnervenzellen, Endothelzellen eines kleinen Schiffes, Strukturen umfassen die meninx (die Zebrabärbling Pendant der Meningen, die membranartige umhüllende Schicht Säugerhirn). Subzellulären Strukturen umfassen die Glycocalyx der Epidermis, verschiedene Kern Morphologien und Foci in verschiedenen cel l Typen und Organellen einschließlich Golgi-Apparat, endoplasmatischen Retikulum (ER), Mitochondrien und synaptischen Vesikeln und postsynaptischen Dichten.

Unerwarteter die Kerne von Zellen, die die Ventrikel auskleiden sind sehr elektronendichten Vergleich zu anderen Zellen mehr seitlich im Gehirn verteilt. Zusätzlich zeigen diese Kerne ventrikulären dunkle Foci , die in anderen Zellen im Gehirn nicht vorhanden sind und unterschiedlich erscheinen in Größe und Struktur von dem Heterochromatin, die in Kernen von phagozytischen Mikroglia (Abbildung 2) gefunden wird. Zellen, die die Ventrikel bei der Entwicklung von Zebrafisch-Futter sind meist radialen Gliazellen und neuronale Vorläuferzellen, die eine veränderte Chromatin Zustand als mehr differenzierte Zellen zurückgelegt werden muss. Als Stammzellen in Gewebe im Allgemeinen recht selten sind, nanotomy zur Gewebekennzeichnung für Stammzellmarker mit Gewebe Skala korrelieren EM daher verwendet werden könnten ultrastrukturelle Merkmale von Stammzellen zu identifizieren.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Groß EM (www.nanotomy.org) eines koronalen Abschnitt in einer Zebrabärbling Larve neuronalen Ablation zeigt, dass viele spezifische Gewebe unterziehen, und zellulären und molekularen Eigenschaften nicht gefunden in Kontrolltieren. Cellular Features phagozytischen Vakuolen Mikroglia und die Größe der Zellen umfassen, wahrscheinlich darstellt sterbenden Zellen (2B, www.nanotomy.org). EM haben frühere Studien Mikroglia in Vertebraten 18,19 identifiziert. Kennzeichnende Merkmale der Mikroglia länglichen Kerne umfassen , Klumpen von fleckige Chromatin neben der Kernhülle, prominente Golgi-Apparat, frei Polyribosome, granulare endoplasmatischen Retikulum (ER) mit langen, schmalen Zisternen, relativ dunkel / dichten Zytoplasma und zahlreiche Angebote wie phagosomes, Lipidtröpfchen und Lysosomen. Alle diese Kennzeichen, auf Mikroglia in Säugetiergewebe zugeschrieben wird , wurden auch in diesen Zellen in Zebrabärbling Gehirne (2B, www.nanotomy.org) gefunden.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Abbildung 1
Abbildung 1: Workflow von Groß Tissue Elektronenmikroskopie auf Zebrabärblinge Gehirne. (A) 7 Tage alten Zebrafisch - Larve. (B) Zebrabärbling larvalen Köpfe nebeneinander in Epoxidharz eingebettet. (C) Glasmesser für Halb -Thin sectioning und Orientieren der Probe. (D) Representative Semidünn Toluidinblau-Färbung Schnitt zeigt zwei Side-by-Side - eingebettet Zebrabärblingembryonen. (E) Diamantmesser ultradünnen (70 nm) Abschnitte zu schneiden. (F) bearbeitete Bild in (D) von ganzen Zebrabärbling Larven Gehirn Abschnitt auf einem Lochraster Positionierung anzuzeigen. (G) Mikroskopiesystem für große 2D - EM in dieser Studie verwendet. (H) Ablauf der Bildverarbeitung. Bitte klicken Sie hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
. Abbildung 2: Nanotomy . Ergebnisse: Von Makromolekül Gewebe (A) Nanotomy der Gehirne von 7 Tagen Kontrolle nach der Befruchtung und (B) behandelt (neuronale Ablation; Abbildung 1), Besonderheiten bei der neuronalen zeigt abgetragenen degenerative Hirn (B) Diese phagozytischen Mikroglia, dunkle Zellen umfassen läuft Zelltod und schwammigen Aussehen neuronaler Gewebe ((A) und (B)). Die oberen Felder (angepasst von 5): 10fach vergrößerte Ansicht Region angegeben in mittleren Panels. Mittelplatten: 10fach vergrößerte Ansicht Region in unteren Platten angegeben. (A, Mitte) Hohe Vergrößerung Ansicht von neuropil zeigt Synapse in (A, unteres Bild), synaptische Vesikel (SVs) undpostsynaptischen Dichte (PD). (B, Mitteltafel) Hohe Vergrößerung Ansicht von amoeboid Mikroglia oder möglicherweise ein Makrophagen (Mitteltafel, M) zeigt typische amöboide Mikroglia - Funktionen (unten) mit prominenten Golgi - Apparat (G), Einschlüsse einschließlich lysosomale Vakuolen (L). Maßstabsbalken: 50 & mgr; m (oben), 5 & mgr; m (Mitte) und 0,5 & mgr; m (unten). Diese Zahl wurde von 5 geändert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen , oder besuchen Sie die vollständigen Daten online (nanotomy.org).

Discussion

EM ermöglicht die Analyse von zellulären Kontext mit hochauflösende Abbildung von Makromolekülen in biologischen Kontext. Dies schränkt jedoch typischerweise das Sichtfeld. Größere angelegte 3D - EM ist besonders geeignet für die Zuordnung neuronaler Konnektivität durch nanoskalige Auflösung 3 - dimensionale Rekonstruktion zu schaffen, erfordern komplexe Datenverarbeitung 10. Im Gegensatz dazu 2D großen Maßstab EM erfordert nur einen einzigen Abschnitt und Nähen der Abbildungsdaten, und die Beurteilung der Daten ist möglich, indem jeder, der Zugang zu einem Internet-Browser. Wir und andere bisher in großem Maßstab EM verwendeten Gewebe und ganze Tiere zu analysieren. Wie für die meisten Ansätze, TEM und SEM-basierte Nähte haben ihre eigenen Vorteile. Hier scanning transmission EM (STEM) verwendet, die mit einer hohen Auflösung Erzeugung einer großen Sichtfeld ermöglicht. Typischerweise ist ein STEM Bild auf die Sichtfelder von etwa 100 TEM-Bilder äquivalent, signifikant die Menge an Naht verringert wird, wenn große fiel Abbildends Sicht bei hoher Auflösung. Wenn eine höhere Auflösung benötigt wird, kann TEM vorteilhaft sein. STEM hat den Vorteil gegenüber TEM , dass nicht-kontrastiert Proben mit guter ultra Kontrast 6 verwendet werden.

Zusätzlich kann das hier beschriebene Verfahren einfach für mit rückgestreute Elektronendetektion (BSD) Verwendung eingestellt werden auf Abschnitten auf Silica Wafer angebracht ist, die Verwendung auf mehrere Mikroskopsysteme zu erweitern. HTML-zoombaren Gewebe EM - Dateien sind sehr nützlich für die Quantifizierung, gemeinsame Nutzung von Daten , die zu seinem vollen Inhalt kann nicht analysiert wurden, LM und EM - Daten (CLEM) 8, Präsentationszwecke in der wissenschaftlichen Forschung kombiniert, um Patientendaten zu analysieren und für die Bildung. Alternativ kann in EM Groß in einem SEM, aber nicht in einem TEM, Silica Wafer können verwendet werden, was zwei Vorteile hat: BSD verwendet werden kann, die auf Rasterelektronenmikroskopen als STEM Detektions allgemein verfügbar ist. Zweitens Montage großer Teile (> 1 mm 2 BereichenInteresse) ist einfach. Montage auf einzelnen geschlitzten Gittern ist arbeitsintensiv und technisch anspruchsvoll. Detaillierter Vergleich zwischen TEM, SEM und STEM ist an anderer Stelle 6 detailliert beschrieben. Ein Nachteil der BSD-Bildgebung ist, dass STEM verglichen, Bilder haben erhöhtes Rauschen. Dies kann teilweise durch Erhöhen der Pixel-Verweilzeit ausgeglichen werden, was zu einer viel längeren Erfassungszeiten.

Obwohl für die Probenvorbereitung relativ Standard EM Verarbeitung (Fixierung, Einbettung und Schneiden) 5-7 benötigt wird, ist es technisch anspruchsvolle große ultradünne Schnitte völlig frei von Artefakten zu schneiden. Abschnitte sind sehr zerbrechlich, leicht brechen, falten oder während der Bildgebung zerstört, die in der Regel mehrere Stunden pro-Datensatz erfolgt. Da jedoch der Online-Sharing der rohen unvoreingenommene Daten sollte es möglich werden, leichter zu veröffentlichten Daten zu vergleichen und veröffentlichten Daten-Set in der offenen Domäne als Kontrollen verwendet werden. Derzeit einige EM-Geräte der Lage, large-Scale-Analyse sind im Einsatz, und daher Zugang zu dieser Technik ist etwas begrenzt, obwohl die meisten Imaging-Zentren gemeinsamen Bemühungen begrüßen.

Für großflächige Abschnitte hat das Gewebe richtig in der gesamten Probe zu fixieren. Deshalb ist eine Mischung aus dem schnellen, aber moderate Fixativ PFA in Kombination mit der langsamen, aber starke Fixiermittel GA verwendet wird. Schneiden und Aufnehmen von großen Teilen ohne Artefakte ist schwierig. Arbeiten mit Wafern in Kombination mit BSD ist einfacher, im Vergleich zu den Abschnitten auf einzelne Lochgitter zu sammeln. Schwermetallpfosten Färbung ist kritischer Vergleich zu klassischen EM. Da der ganze Abschnitt jedes Artefakt wird sichtbar abgebildet wird. TEM Benutzer typischerweise finden es schwierig, ein SEM zu wechseln, wegen des Unterschieds in Mikroskopbetrieb.

Quantifizierung und gemeinsame Nutzung von Daten - subzellulärer Funktionen Quantifizieren in einzelnen EM Bilder schwierig ist. Die Möglichkeit, zu vergrößern und aus GroßBilder können leicht Identifizierung von Zellen von Interesse, die von nanoskaligen Messungen innerhalb der Zellen folgen kann. Diese Datensätze zeigen, dass bestimmte Zelltypen können schnell in diesen großen Gewebeschnitten in unvoreingenommen identifiziert und quantifiziert werden, basierend auf Eigenschaften nachweisbar in verschiedenen Maßstäben. Beispielsweise Mikroglia können auf der Grundlage ihrer Morphologie und dichten Zytoplasma identifiziert werden. Anschließend, auf auf die einzelnen Zellen Zoomen, nanoskaligen subzellulärer und molekularen Eigenschaften dieser Zellen innerhalb des gleichen Datensatzes gemessen werden, wie wir zuvor für ER Breite in einem großen Maßstab EM Gewebekultur - Datensatz 2 gezeigt. Ein zusätzlicher Vorteil der nanotomy ist, dass Online von großen Datenmengen Hosting erlauben anderen, um die Daten zu überprüfen, vielleicht für andere Funktionen, und ihre Schlussfolgerungen zu neuen Hypothese ziehen.

Clem - Zusätzlich zur Erleichterung der quantitativen EM, EM in großem Maßstab macht es einfacher , Licht microsco zu korrelierenpic Kennzeichnung EM Level 8. Im vorliegenden Beispiel wird das Vorhandensein von phagozytischen Mikroglia in einem Zebrabärbling Ablation Modell gezeigt. Eine wichtige Frage in den Neurowissenschaften ist es, was die einzelnen Funktionen und Beiträge sind von Mikroglia und mögliche andere Quellen von phagozytischen und Immunzellen. Frühe EM Studien haben unterscheidenden subzellulären Eigenschaften der Mikroglia bei Krankheit 18 gezeigt. Leider ist es schwierig, selektiv Mikroglia insbesondere in einem pathologischen Einstellung bezeichnen, da sie große Überlappung mit anderen Immunzellen in der Genexpression, der Morphologie und Funktion aufweisen. Daher ist es unklar, ob und wann Mikroglia auf ultrastruktureller Ebene unterscheiden sich von Immunzellen aus anderen Quellen, einschließlich Monozyten-Makrophagen abgeleiteten infiltrieren. Zu verstehen, ob es ultrastrukturellen Unterschiede zwischen diesen Zellen wird ein Ausgangspunkt für die Analyse der funktionellen Unterschiede. Die Kombination von selektiven transgenen oder Expression-Markern und Clem ermöglicht detection von ultrastrukturelle Merkmale selektiv auf bestimmte Bevölkerungsgruppen.

Diagnose und Präsentation und Bildung - durch nanoskalige Visualisierung innerhalb eines einzelnen Datensatzes EM Daten zu mikroskaligen stark an ein breites Publikum erleichtert. Mit den erweiterten Möglichkeiten und Werkzeuge für die korrelative und groß angelegte EM erwarten wir eine Belebung der EM in der Grundlagen- und medizinischen Forschung. Unsere Methode , die hier dargestellt ist , an einen Zebrabärbling Hirnverletzung Modell angewendet 5, hat aber auf die menschliche Gewebe 7, Rattenhirn 3, in einem Rattenmodell für Diabetes 4 und in Zellkultur - 2, und kann auch verwendet werden in Kombination mit einem TEM verwendet -basierte Ansatz 1 die Vielseitigkeit dieses Verfahrens zeigt. Das Mikroskop Bediener nicht mehr die Aufzeichnung hoch ausgewählt, und daher voreingenommen Bilder, aber alle zahlreiche ultrastrukturelle Merkmale erfasst und offen für die weltweite Analyse.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Die Mehrheit der Arbeit wurde an der UMCG Mikroskopie und Imaging Center (UMIC) durchgeführt, die von NWO 175-010-2009-023 und ZonMW 91.111.006 gefördert wird; STW "Mikroskopie-Tal 12718" zu BNGG. Diese Arbeit wurde von einem ZonMW VENI Zuschuss gefördert, eine Marie-Curie-Karriere Eingliederungszuschuss (Einsparung sterbende Neuronen) und einer Alzheimer Nederland Gemeinschaft zu TJvH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
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