Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Büyük ölçekli 2D elektron mikroskobu (EM), ya da nanotomy, nano ölçekli çözünürlük elektron mikroskobu doku çapında bir uygulamadır. Diğer ve daha önce insan derisi pankreatik adacıklar, doku kültürü ve bütün zebra balığı larvası 1-7 büyük ölçekli EM uygulanır. Burada alt-hücresel ve moleküler özelliklerinin tarafsız tespiti için doku ölçekli tarama EM için evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Nanotomy sağlıklı ve nörodejeneratif zebra balığı beyin araştırmak için uygulanmıştır. Bizim yöntemi standart EM numune hazırlama protokolleri dayanmaktadır: Fiksasyon gluteraldehit ve osmiyum ile, epoksi reçine gömme ardından kesit ve uranil ve kurşun post boyanması ve ardından tek delikli ızgaralar üzerinde ultra ince kesitlerin, montaj ultra ince. Büyük ölçekli 2D EM mozaik görüntüleri EM tarama iletim EM (STEM) kullanarak harici bir geniş alan tarama jeneratöre bağlı bir tarama kullanılarak elde edilir. 50 G piksel i - Büyük ölçekli EM görüntülerin genellikle ~ 5 vardırn boyutu ve en iyi online coğrafi HTML haritalarına benzer herhangi bir web tarayıcısında açılabilir yakınlaştırılabilen HTML dosyaları, kullanarak inceledi. Bu yöntem, (insan), doku, çapraz Bütün hayvanlar bölümleri hem de doku kültürü 1-5'e uygulanabilir. Burada, zebrafish beyinler non-invaziv nöronal ablasyon modelinde analiz edildi. Biz nöronlar ve mikroglia, beynin makrofajlar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ölçülebilir bir hücresel tek veri kümesi doku ve hücre içi değişiklikler içinde görselleştirmek. Büyük yüzey alanı, daha önce görüntülü Buna ek olarak, nanotomy floresan mikroskopi kullanılarak, aynı doku ışık mikroskobu (Clem) EM korelasyonunu 8 kolaylaştıran, daha sonra nano anatomisi (nanotomy) arasında ortaya çıkan, geniş bir alan EM tabi tutulabilir dokular. Toplamda, nanotomy bir doku çapında ölçülebilir bir şekilde EM düzeyinde özelliklerin tarafsız algılanmasını sağlar.

Introduction

Son teknik gelişmeler ultrastrüktürel analiz canlanma lider, EM çok yönlülük, uygulanabilirliğini ve nicel doğa düzeldi. Gelişmeler doğrudan EM seviyesine 8-10 mikroskobik analiz diğer modları karşılaştırmak için 3D EM, büyük ölçekli 2D EM ve ilişkili ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu (CLEM) için geliştirilmiş yöntemler ve belirteçler bulunmaktadır. Büyük ölçekli 2D EM ölçmek ve insan patoloji (yeni) hastalığı özelliklerini belirlemek, hastalık ve doku kültürü modelleri için hayvan modelleri çalışma özellikle uygundur. Nedeniyle görünüm genellikle küçük alanı ile bir doku, geniş ölçekli yüksek büyütme değişiklikleri ilişkilendirmek için, hem de tarafsız bir ve kantitatif ultrastrüktürel özellikleri analiz etmek zordur.

İnsan doku ya da hayvan modellerinde, patoloji değerlendirmesi, hematoksilin ve eozin (H & E) renkli gömülü formaldehid sabit parafin kesitleri (FFPE) tis patolojik analizi içinsue standarttır. Basit yanı sıra H & E boyama immün da patolojik anormallikleri tespit etmek için yapılır. Bu dokular EM DÜZEYİ, özel hücre tipleri de analiz edildi ve edilebilseydi hücre içi değişiklik tespit edilememiştir. Büyük ölçekli EM tarafsız doğa hastalığın beklenmedik ve yeni özellikler bulmak sağlar. Büyük ölçekli tarafından milimetre karelik EM alanlar kadar görülebilir. Biz ve diğerleri, daha önce pankreas adacık 4 sıçan nanotomy, hücre kültürü 2, sıçan beyin 3, deri ve mukoza 7 ve tüm Zebra balığı larvaları 1,5 (www.nanotomy.org) uygulanır. Balığı, beyin bağışıklık hücreleri 11 de dahil olmak üzere, memeli dokularında erişilmesi zor olan hücre tipleri görselleştirmek için, özellikle de, in vivo görüntüleme için son derece uygundur. Burada nanotomy prosedürü nöronal ile metronidazol dönüştürülmesiyle koşullu nöronal ablasyon uygulanan zebra balığı kafaları koronal bölümlerine uygulanan ayrıntılı olarak tarif edilmiştirifade nitroredüktaz (www.nanotomy.org) 5,12-14. Tüm ham veri doku ölçekli değişikliklere moleküler görselleştirme, yakınlaştırılabilen HTML dosyaları olarak sunulmaktadır. Ham verilerin sunumu, dünya çapında uzmanlar tarafından diğer açılardan veri setleri tarafsız analizler sağlar.

Protocol

Zebra balığı larvaları ile Tüm deneyler ulusal ve AB direktiflerine göre Groningen Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Numune Hazırlama

  1. Fiksasyon ve Gömme
    1. tespit
      1. Tricaine (% 0.003), balık larvaları uyuşturan hafifçe alay E3 (5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7.6) anestezi derinliği zebra balığı su ve test eklendi diseksiyon mikroskobu altında 200 ul pipet ile hareket artık (Şekil 1A) tespit edilene kadar.
      2. Tarif edildiği gibi agaroz,% 1.8 konfokal veya 2 foton görüntüleme kullanılarak in vivo görüntüleme verileri elde sonra bağlaşık EM için numune işleme tabi tutulduğunda, agaroz 5,15 düzeltme larva Triton-X-100 (% 0.05) ihtiva eden PBS içinde% 4 PFA kullanılmıştır.
      3. agaroz ve işlem için gelen larva kestibüyük ölçekli EM 5.
      4. plastik tüplerde, oda sıcaklığında 2 saat süre ile, Triton-X-100 (% 0.05) ihtiva eden PBS içinde, taze% 4 paraformaldehid içinde larvaları düzeltildi.
        Not: kültür içinde yetiştirilen hücreler bir sonraki aşamada (1.1.1.5) 'de tarif edildiği gibi (in vitro), doğrudan, glutaraldehid edilebilir.
      5. çözüm çıkarın ve 100 ul% 0.5 PFA,% 2 glutaraldehid (GA) ve 0.1 M sodyum kakodilat içinde (pH 7.4) ilave edilir. 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza ediniz. Durulayın numuneler iki kez 0.1 M sodyum kakodilat içinde.
      6. osmiyum penetrasyonu kolaylaştırmak için Beyin için rostrally larva başlarını kesti. ince şırınga / forseps kullanın.
      7. % 1 ozmiyum tetroksit içinde Postfix'i larvaları (OsO 4) 2 saat boyunca potasyum ferrosiyanür (K 4 [Fe (CN) 6]) buz üzerinde 0.1 M sodyum kakodilat içinde /1.5% ve çift damıtılmış H2O 3 x 5 dk durulama
      8. etanol artan konsantrasyonlarda 20 dakika inkubasyon (% 50,% 70, 3 kez% 100) ile etanol içinde kurutmak.
    2. katıştırma
      1. EM laboratuvarlarında kullanılan standart tariflere göre epoksi reçine hazırlayın.
        Not: şöyle epoksi reçine kullanılmaktadır: karıştırın 19.8 g glycid eter 100, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak 9.6 g 2-dodesenilsukinik asit anhidrit ve 11.4 gr metilnadik anhidrid. 0.5 g DMP-30 (tris- (dimetilaminometil) fenol) eklenir ve tekrar karıştırılır.
      2. etanol içinde% 50 epoksi reçine larva gece inkübe (h / h) (RT) dönerken.
      3. Saf reçine ile sulandırılmış epoksi reçine yerine takın. 30 dakika boyunca inkübe tekrar taze reçine ekleme ve 30 dakika için inkübe edilir. Yine reçine yenilemek ve 58 ° C'de 15 dakika ve düşük basınç altında (200 mbar) altında, oda sıcaklığında 1 saat daha ve ardından oda sıcaklığında 3 saat, inkübe edilir.
      4. Bir iğne kullanarak bir diseksiyon mikroskobu altında piyasada mevcut silikon düz gömme kalıpları başlarını yönlendirmek ya da kalıp ya da gerektiği gibi tarafına bakacak anterior kürdan (Şekil 1B).
      5. Epoksi res polimerize58 ° C'de gece boyunca. Epoksi reçine ise de çok yumuşak bir gün polimerize edilmesi ve 58 ° C 'de sertleşmeye olanak sağlar. forseps kullanarak basınç uygulayarak test sertlik. Bu kolayca girinti başka bir gün polimerize ve 58 ° C'de sertleşmesine izin bırakır. Numune tamamen sertleştiğinde kırparak ve kesit geçin.
      6. Saplama kullanılarak Jilet (Şekil 1B) aşırı reçine uzak Trim.
  2. , Kesit zıt ve Montaj
    1. kesit
      1. Bir ultramikrotom kullanılarak Bölüm epoksi reçine blok.
      2. Cam bıçak ya toluidin mavisi / bazik fuksin için de yarı ince kesitler (500 nm) kesmek için bir elmas histoknife kullanarak (Şekil 1D) doğru konumlanmasını tespit boyama.
      3. kimin ucu bir alev eriterek kapatılmış bir cam Pasteur pipet ile onları toplayıp mikroskobik slaytlar transfer yarı ince kesitler. sıcak bir plaka u kuruntil su bırakılır. sıcak bir plaka üzerinde, su içinde% 1 toluidin mavisi ile 10 saniye boyunca ve% 1 sodyum tetraborat% 0.05 bazik fuksin ile 10 saniye boyunca su, leke ile durulandıktan sonra leke. 40X için 10X de normal ışık mikroskobu ile incelenmesi.
      4. Beynin içinde uygun yer / oryantasyon ulaşıldığında, ultra ince bölümleri kesmek için bir elmas bıçak ile epoksi reçine blok kesit devam (~ 70 nm; Şekil 1E)
      5. kesit ultra ince esnasında ilgi bölgeyi tanımlamak için ve örnek hareket ettirildiğinde kesit açısını ayarlamak için, koku çukurlar, gözler, gri-beyaz cevher sınırları da dahil olmak üzere, beyinde ve çevresinde kolayca tanımlanabilir anatomik yapıları kullanır.
      6. Tek yuvalı L2 x 1 bakır ızgaralar (Şekil 1F), Mount bölüm ızgara çubukları tarafından kesintisiz edinimi izin vermek. bölümleri desteklemek için Formvar kaplı ızgaralar kullanın.
    2. karşıt
      1. ızgara üzerinde leke ince kesitlerReynolds, ardından metanol içinde% 2'lik üranil asetat içinde 2 dakika süreyle s başka bir 2 dakika 16 kurşun sitrat.

2. Görüntü Alma

  1. Büyük Ölçekli KÖK
    Not: KÖK algılama kullanarak yüksek çözünürlükte 3,5,7,17 ​​de görüş birden çok büyük alanları edinme yeteneğine sahip bir dış tarama jeneratör ile tarama EM kullanın. Tipik olarak, tek bir görüntü, bu şekilde önemli ölçüde dikiş miktarını azaltarak, ~ 100 Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntü bakış alanları eşdeğerdir oluşturulur.
    1. Mikroskop Örnek montaj
      1. Birden fazla ızgara numune tutucu bölümünde ile ızgara yerleştirin ve SEM odasına transfer.
    2. KÖK Dedektör hizalama
      1. kiriş altında numune ile ızgara koyun ve yaklaşık olacak şekilde yukarı hareket ettirin. Lens kutuptan 5 mm. kullanılarak 20 kV bir görüntü eldelens-dedektörü.
      2. ızgara kenarında odaklanın ve 4,0 mm çalışma mesafesi ayarlayın.
      3. güvenli bir konuma numune tutucu taşıyın ve KÖK dedektörü getirmek.
      4. in-lens dedektörü ile maksimum hızda ayarlamalar vidaları ise görüntüleme çevirerek görüntü alanında STEM dedektör delik ortalayın.
      5. Dikkatle sadece objektif kutup ve detektör arasındaki uyacak numune tutucu geri getir.
      6. kesit alanı olmak emin olmak için de lens dedektörü ile bir görüntü kazanır.
      7. Anahtar algılama (kazanç orta ve 'eksi' ayarlanmış tüm kadranlar) STEM ve bir görüntü elde ve taranacak alanı seçmek için.
      8. 21 kV hızlandırma gerilimi yükseltmek ve (yine kararlı görüntünün) ışın stabilizasyonu için bekleyin ve daha sonra 2 kV adımlarla 29 kV gidin.
    3. Görüntüleri Kazanılması
      1. örnek Ön-irradiate yakınlaştırma (e-beam neden olduğu parlaklık değişikliklerini önlemek için)taranacak tam alana kadar dışarı görüntü penceresi uyuyor.
      2. 120 mikron diyafram değiştirin (dedektör kazançları bir adım azaltılması gerekmektedir uygun dinamik aralığı tutmak için).
      3. De-odak görüntü bulanık yani.
      4. azaltılmış alan tarama seçeneğini kullanarak mümkün olduğunca sıkı taranan bölgeyi olun.
      5. Bir çerçeve yaklaşık olarak taranır şekilde ayarlayın tarama hızı. 1-2 sn.
        Not: boyutu ve doku bağlı olarak bu tipik alır ½ saat (100 x 100 mm FOV) 3 saat (1.000 x 500 mm) kadar kadar.
      6. En az 100X de yakınlaştırmak ve 10 sn için küçük bir alan taraması.
        Not: Bu bölge çevresindeki, ışınlama öncesi yeterli karşılaştırıldığında parlaklığı değişmez zaman.
      7. 30 mikron diyafram geri getir (ve orta kazancı STEM)
      8. örnek odaklanın.
      9. wobbler (~ 40,000X büyütmede) kullanarak diyafram hizalayın.
      10. odak hafif alan / özelliği seçerken, tarama hızını ayarlamak gibi ayrıntılar olduğunugörebilir.
      11. mikroskop yazılımı dikkatlice dinamik aralığındaki tüm pikselleri tutmak için histogramı izleyerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. karanlık alan / özellikler için aynı şeyi.
      12. geri parlak alana gidin ve tekrar kontrol edin. histogram her iki tarafında biraz boşluk var bu yüzden güvenli tarafta olmak.
      13. taranacak tam alan görüntüleme penceresini uygun şekilde uzaklaştırın ve geniş alan satın alma programını başlatın.
      14. ekranından bir alanı seçerek bir mozaik kurmak için sihirbazı seçeneğini kullanın. Kullanım piksel boyutu 2 - ayrıntılar gerekli olan ne bağlı 5 nm. KÖK için bekleme süresi 3 uS kullanın.
      15. Seçeneğini seçin "önceki karo üzerinde otofokus" onay kutusunu, varsayılan şirket ayarları ile büyük ölçekli toplama yazılım otofokus kullanmak "önce yürütme ayarını doğrulamak" ve nerede verileri kaydetmek tanımlayın.
      16. Basın mikroskop ayarlarını kontrol etmek "optimize".
        Not: Şimdi ihtiyaç duyulan zaman sh olacakkendi. Bu kadar 1 x 0,5 mm alanları için 72 saat için olabilir.
      17. Pencere "maksimum karo çözünürlük" türü 20.000 nedenle bireysel fayans künt kenar etkileri önlemek, daha büyük daha 20k x 20k olmayacaktır. Basın "yürütme".
      18. odaklama ve Parlaklık / Kontrast (B / C) kontrol etmek için sorulduğunda, dış tarama jeneratörü kapatmak ve dikkatli bir şekilde mikroskop yazılımı odağı ve astigmat ayarlayın. B / C değiştirmeyin.
        Not: Sahne taşındı ve büyütme değişti ama büyütme geri istediğiniz piksel boyutuna ayarlanmış olması gerekir edilebilir.
      19. Yine dış tarama Jeneratör geçmek ve basın "Devam".

3. Veri Analizi

  1. büyük ölçekli EM dosyası görüntüleyici programı açın ve dosyayı "mozaik bilgi" açın. Bu, tüm kiremitli tif dosyaları açılacaktır. Bu, tercihen yeni satın almalar engel değil başka bir iş istasyonunda gerçekleştirilir.
  2. seçeneği 'au seçinTüm mozaik dikiş (parametreler eşik 0.90, otomatik gürültü azaltma dikiş, yarısı modu üst üste. vaka dikiş kriterlerinde de, zoom yerine elle konumunda karo yerleştirin ve 'olduğu gibi devam' düğmesine tıklayın olamaz).
  3. bir html dosyası olarak ihracat, ya da alternatif olarak tek bir TIF olarak.
    TIF bir küçültme gerekli olabilir dışa unutmayın. Daha sonra ölçümler sağlayan dosya adı son piksel boyutunu içerir.
  4. bir resim düzenleme programında açarak TIF dosyasındaki açıklamaları gerçekleştirin. Buna paralel olarak, optimum çözünürlük gözlem için bir web tarayıcısında yakınlaştırılabilen html dosyasını açın.

Representative Results

1 haftalık Zebra balığı larvalarının baş koronal kesitlerin Büyük ölçekli EM veri kümesi tek bir büyük ölçekli görüntüde birçok doku ve hücre özelliklerini gösterir (www.nanotomy.org).

Kontrol beyin bölümlerinin Nanotomy koku elyaf demetlerinin, nöronal çekirdekleri ve sinaps da dahil olmak üzere nöronal alt bölümlerinde (Şekil 2A, www.nanotomy.org) de dahil olmak üzere, rostral önbeyin nöral dokuya tipik ultrastrüktürel özelliklerini ortaya koymaktadır. ayırt edilebilir kafasına hücre tipleri alt çene büyük vakuoller, koku sinir hücrelerinin osmiophilic miyelin, küçük bir kabın endotel hücreleri, yapılar Meninx (meninkslerin Zebra balığı meslektaşı membranöz tabaka kaplayan dahil olan kondrositler dahil memeli beyin). Hücre alt yapıları farklı cel içinde epidermisin Glikokaliks, farklı nükleer morfolojiye ve odaklar bulunmaktadır Golgi aygıtı, endoplazmik retikulum (ER), mitokondri ve sinaptik veziküllerin ve post-sinaptik yoğunlukları da dahil olmak üzere l türleri ve organeller.

Beklenmedik ventrikül döşeyen hücrelerin çekirdekleri beyinde daha yanal dağılmış diğer hücrelere göre çok elektron yoğun. Buna ek olarak, bu ventriküler çekirdekler beyinde diğer hücrelere mevcut değildir ve fagositik mikroglia (Şekil 2) çekirdeklerinde bulunan heterokromatin, boyut ve yapıda farklı görünür koyu odaklar göstermektedir. zebrafish gelişmekte olan ventrikül astar hücreleri daha farklılaşmış hücrelerden daha bir değişmiş kromatin durumunu yansıtıyor olabilir çoğunlukla radyal glial hücreler ve nöronal atalarıdır bulunmaktadır. dokuda kök hücreler genellikle oldukça nadir olduğu için, nanotomy EM nedenle kök hücrelerin mikroskopik özelliklerini belirlemek için kullanılabilir, doku ölçekli kök hücre markörleri için doku etiketleme ilişkilendirmek için.

ve_content: nöronal ablasyonu uygulanan bir Zebra balığı larva bir koronal bölümünde "fo tutmak-together.within sayfa =" 1 "> Büyük ölçekli EM (www.nanotomy.org) bulunmayan birçok özel dokular ve hücresel ve moleküler özellikleri ortaya Hücresel özellikleri fagositik mikroglia içerir ve büyük olasılıkla ölmekte olan hücre (Şekil 2B, www.nanotomy.org) temsil eden, hücrelerinin boyutunu vaküol kontrol hayvanlarında.. Önceki EM çalışmaları omurgalılarda 18,19 mikroglia tanımlanmıştır. mikroglia karakteristik özellikleri uzatılmış çekirdek içerir bir sonraki uzun dar sisternala- nispeten karanlık / yoğun sitoplazmalı ve bu fagozomların, lipid damlacıkları ve lizozomlar gibi çok sayıda kapanım, nükleer zarf, belirgin Golgi aygıtı, ücretsiz poliribozomların, granüllü endoplazmik retikulum (ER) yamalı kromatin kümeleri. Tüm bu memeli dokularında mikroglia atfedilen diğerlerinden ayıran, aynı zamanda zebra balığı beyinlerinde bu hücreler (Şekil 2B, www.nanotomy.org) bulundu.

<keep-together.within sayfa = "1">: fo p class = "jove_content" Şekil 1
Şekil 1: Zebra balığı Brain üzerine Büyük ölçekli Doku Elektron Mikroskobu iş akışı. (A) 7 günlük bir Zebra balığı larva. (B) epoksi reçine yan yana gömülü Zebra balığı larva kafaları. Yarı kesit ve numune yönlendirilmesi -thin için (C) Cam bıçak. (D) iki gösteren Temsilcisi yarı ince toluidin mavisi lekeli bölüm yan yana (F).. ultra ince (70 nm) bölümleri kesmek için (E) Elmas bıçak Zebra balığı larvaları gömülü konumlandırma belirtmek için tek delikli ızgara üzerinde tüm Zebra balığı larva beyin bölümünün (D) görüntü Düzenlendi. (G) Bu çalışmada büyük ölçekli 2D EM için kullanılan mikroskopi sistemi. görüntü işleme (H) Akış. tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

şekil 2
. Şekil 2: Nanotomy Sonuçlar:. Makromolekül itibaren Doku tedavi 7 gün sonra döllenme kontrolü ve (B) beyin (A) Nanotomy (nöronal ablasyonu; Şekil 1), nöron spesifik özellikler gösteren dejeneratif beyin ablasyon (B) Bu hücre ölümünü ve nöral doku ((A) ve (B)) süngerimsi görünümünü geçiren fagositik mikroglia koyu hücreleri bulunur. (5 uyarlanmıştır) Üst paneller: Bölgenin 10X büyütülmüş görünümü orta paneller belirtti. Orta paneller: Bölgenin 10X büyütülmüş görünümü alt paneller belirtti. (A, orta panel) (A, alt panel) içinde neuropil gösteren sinaps yüksek büyütme görünümü, sinaptik veziküller (SVS) vepostsinaptik yoğunluğu (PD). (B, Orta panel) belirgin Golgi aygıtı (G) gibi tipik amoeboid mikroglial özelliklerini (alt panel) gösteren muhtemelen amoeboid mikroglia veya makrofaj (orta panel, M) Yüksek büyütme görünümü, lizozomal vakuol (L) dahil kapanımlar. Ölçek çubukları: 50 um (üst), 5 um (orta) ve 0.5 um (alt). Bu rakam 5 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız , veya tam veri çevrimiçi ziyaret (nanotomy.org).

Discussion

EM biyolojik bağlamda makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile hücresel bağlam analizi sağlar. Bununla birlikte, bu tipik olarak görüş alanını sınırlar. Büyük ölçekli 3D EM karmaşık veri işleme 10 gerektiren, nano ölçekli çözünürlüğü 3 boyutlu rekonstrüksiyon oluşturarak haritalama nöronal bağlantısı için uygundur. Buna karşılık, 2D büyük ölçekli EM görüntüleme verileri tek bir bölümü ve dikiş gerektirir ve verilerin değerlendirilmesi, bir internet tarayıcısına erişimi olan herkes tarafından mümkündür. Biz ve diğerleri, daha önce dokuları ve bütün hayvanların analiz etmek büyük ölçekli EM kullanılır. En yaklaşımlar, TEM ve SEM-tabanlı dikiş gelince kendi avantajları var. Burada, tarama iletim EM (STEM) yüksek çözünürlükte geniş bir görüş alanının oluşturulmasına imkan olduğu kullanılmıştır. Büyük Yıkıldığı görüntüleme, genellikle, tek bir KÖK görüntü yaklaşık olarak 100 TEM görüntüleri, önemli ölçüde dikiş miktarının azaltılması bakış alanları eşdeğerdiryüksek çözünürlükte bakış DS. Daha yüksek çözünürlük gerekli ise, TEM avantajlı olabilir. KÖK olmayan kontrast örnekler iyi bir ince yapı kontrast 6 kullanılabileceğini TEM üzerinde bir avantaja sahiptir.

Buna ek olarak, burada açıklanan yöntem basitçe bölümler birden mikroskop sistemleri kullanımının yaygınlaştırılmasının, silis gofret üzerine monte geri saçılan elektron algılama (BSD) ile kullanılmak üzere ayarlanabilir. HTML yakınlaştırılabilen doku EM dosyaları hasta verilerini analiz etmek için, bilimsel araştırma LM ve EM verileri (CLEM) 8, sunum amaçlı birleştirerek, tam içeriği analiz edilmemiş olabilir veri paylaşımı ve eğitim, ölçümü için çok yararlıdır. BSD kullanılabilir, daha genel olarak algılama gövdesinden tarama elektron mikroskobu geçerli olan: Seçenek olarak ise, bir SEM büyük ölçekli EM, ancak bir TEM silis gofret iki ana avantajı olan, kullanılabilir. İkincisi, büyük bölümünün (> 1 mm 2 alanlarda montajıfaiz) basittir. Tek yarıklı ızgaraları montaj emek yoğun ve teknik açıdan zor. TEM, SEM ve KÖK arasında ayrıntılı bir karşılaştırma başka bir yerde 6 ayrıntılı. BSD görüntüleme bir dezavantajı, resim gürültü artmıştır, KÖK göre olmasıdır. Bu, kısmen daha uzun alıcı zamanlarda elde edilen piksel kalma süresini arttırmak sureti ile telafi edilebilir.

Numune hazırlama, nispeten standart EM işleme (fiksasyon, gömme ve kesit) için 5-7 ihtiyaç olmasına rağmen, eserleri tamamen yoksun büyük ultra ince bölümleri kesmek için teknik olarak zordur. Bölümler, kolay kırılabilir, çok kırılgan olan kat veya tipik veri kümesi başına birden fazla saat sürer görüntüleme sırasında yok edilir. Ancak, ham tarafsız verilerin çevrimiçi paylaşımı, bu yayınladığı verilere daha kolay karşılaştırmak ve kontrol grubu olarak açık alanda yayınlanan veri kümesi kullanmak mümkün hale gelmelidir. Şu anda, yetenekli la birkaç EM cihazlarırge ölçekli analiz kullanılmakta olan ve çoğu görüntüleme merkezleri işbirlikçi çabaları takdirle karşılıyoruz ama bu nedenle bu tekniği erişilebilirlik, biraz sınırlı.

Büyük ölçekli bölümler için doku doğru, numune boyunca sabit olması gerekmektedir. Bu hızlı ama ılımlı fiksatif PFA bir karışımı yavaş ama güçlü fiksatif GA ile birlikte kullanılır nedeni budur. Kesme ve eserler olmadan büyük bölümleri toplayıp zordur. BSD ile birlikte gofret ile çalışma tek delikli ızgaralar ilgili bölümler toplama kıyasla daha kolaydır. Ağır metal sonrası boyama klasik EM göre daha önemlidir. Bütün bölüm görüntülü beri her obje görünür olacaktır. TEM kullanıcılar genellikle zor, çünkü mikroskop operasyonda farkı, bir SEM geçmek için bulabilirsiniz.

Sayısallaştırılması ve veri paylaşımı - hücre içi özellikleri miktarının tek EM görüntüler zordur. olasılık ve büyük ölçekli uzaklaştırmak içinÇıkan kolaylıkla hücreler içinde nano ölçümü ile takip edilebilir ilgi hücreleri, belirlenmesini sağlar. Bu veri kümeleri belirli hücre tipleri hızla farklı ölçeklerde saptanabilir özelliklere dayalı tespit ve bu büyük doku kesitlerinde tarafsız bir şekilde ölçülebilir olduğunu göstermektedir. Örneğin mikroglia kendi morfolojisi ve yoğun sitoplazmaya dayalı tespit edilebilir. Daha önce büyük ölçekli EM doku kültürü veri kümesi 2 içinde ER genişliği gösterdi Daha sonra, tek tek hücrelerin üzerinde yakınlaştırma üzerine, bu hücrelerin nano ölçekli hücre içi ve moleküler özellikleri, aynı veri kümesi içinde ölçülebilir. nanotomy bir başka avantajı çevrimiçi büyük ölçekli veri setleri barındırma diğerleri belki diğer özellikler için veri incelemek için izin ve yeni hipotez kendi sonuçlara ulaşmak olacaktır.

CLEM - kantitatif EM kolaylaştırılması yanı sıra, büyük ölçekli EM kolay ışık mikroskobik ilişkilendirmek için yaparEM seviyeye 8 pic etiketleme. Bu örnekte, bir zebrabalıkları ablasyon modelinde fagositik mikroglia varlığı gösterilmiştir. nörobilim önemli bir soru, bireysel fonksiyonları ve katkıları mikroglia ve fagositik ve bağışıklık hücrelerinin potansiyel diğer kaynaklardan budur. Erken EM çalışmalar hastalığın 18 mikroglia ayırt edici hücre içi özelliklerini göstermiştir. bu gen ifadesi, morfoloji ve işlev olarak, diğer bağışıklık hücreleri büyük örtüşmeyi sergileyen Ne yazık ki, seçici bir şekilde patolojik bir ortamda, özellikle mikroglia etiket zordur. Bu nedenle, belli olup olmadığı ve ultrastrüktürel düzeyde mikroglia makrofajlar infiltre türetilmiş monosit dahil olmak üzere diğer kaynaklardan bağışıklık hücrelerinin farklı zaman. İşlevsel farklar analizi için bir başlangıç ​​noktası sağlayacaktır bu hücreler arasındaki ultrastrüktürel farklılıklar anlama olup olmadığını. seçici transgenik ya da ifade işaretlerini birleştiren ve CLEM det veriyorultrastrüktürel özellikleri ection belirli nüfusa seçici.

Tanı ve sunum ve eğitim - tek bir veri kümesi EM verileri içinde microscale için nano ölçekli görselleştirme ile büyük ölçüde geniş bir kitleye kolaylaştırılır. bağıntılı ve büyük ölçekli EM artan imkanları ve araçları ile temel ve tıbbi araştırmalarda EM'nin bir canlanma öngörüyoruz. Burada temsil edilen Yöntem A zebrabalıkları beyin yaralanması modeli 5'e uygulanır, ancak diyabet 4 ve hücre kültüründe 2 bir fare modelinde, insan dokusu 7, fare beyni 3 kullanılmaktadır ve aynı zamanda, bir TEM ile kombinasyon halinde de kullanılabilir Bu yöntemin çok yönlülük gösteren tabanlı bir yaklaşım 1. mikroskop operatörü artık çok seçilmiş ve dolayısıyla yanlı görüntüler, ancak tüm sayısız ultrastrüktürel özellikleri kaydedildi ve dünya çapında analiz için açık olan kaydediyor.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

işin çoğunluğu NWO 175-010-2009-023 ve ZonMW 91111006 tarafından desteklenen UMCG Mikroskopi ve Görüntüleme Merkezi (UMIC), en yapılmıştır; BNGG için STW "Mikroskopi Valley 12718". Bu eser, Marie Curie Kariyer entegrasyon hibe (nöronlar ölüyor tasarruf) Bir ZonMW VENI hibe ve TJvH bir Alzheimer Nederland burs sponsor oldu

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
  2. Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
  3. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
  4. Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
  5. van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
  6. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
  7. Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
  8. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
  9. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
  10. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
  11. Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
  12. van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
  13. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
  14. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
  15. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
  16. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
  17. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  18. Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
  19. Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics