Storskalig Scanning transmissionselektronmikroskopi (Nanotomy) hälsosam och skadade Zebrafisk Brain

* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Storskalig 2D elektronmikroskopi (EM), eller nanotomy är vävnads omfattande tillämpning av nano upplösning elektronmikroskopi. Andra och vi tidigare tillämpade storskalig EM till mänsklig hud pankreasöar, vävnadskultur och hela zebrafisk larver 1-7. Här beskriver vi en allmängiltig metod för vävnads skala scanning EM för objektiv detektering av sub-cellulära och molekylära funktioner. Nanotomy tillämpades för att undersöka friska och en neurodegenerativ zebrafisk hjärnan. Vår metod bygger på standardiserade EM provberedningsprotokoll: Fixering med glutaraldehyd och osmium, följt av epoxi-harts inbäddning, ultratunna sektionering och montering av ultratunna-avsnitt om ett hål nät, följt av post färgning med uranylacetat och bly. Storskaliga 2D EM mosaik bilder förvärvas med hjälp av en scanning EM ansluten till en extern stor area scan generator med sveptransmissions EM (STEM). Storskaliga EM bilder är vanligtvis ~ 5 - 50 G pixlar In storlek, och bäst visas med zoombar HTML-filer, som kan öppnas i alla webbläsare, som liknar nätet geografiska HTML kartor. Denna metod kan tillämpas på (human) vävnad, tvärsnitt av hela djur såväl som vävnadskultur 1-5. Här har zebrafisk hjärnor analyserades i en icke-invasiv neuronal ablation modell. Vi visualisera inom en enda datauppsättning vävnad, cellulär och subcellulära ändringar som kan kvantifieras i olika celltyper inklusive neuroner och mikroglia, hjärnans makrofager. Dessutom underlättar nanotomy korrelationen av EM med Ijusmikroskopi (CLEM) 8 på samma vävnad, eftersom stora ytareor tidigare avbildas med fluorescensmikroskopi, kan därefter utsättas för stort område EM, vilket resulterar i nano anatomin (nanotomy) av vävnader. Sammantaget gör nanotomy opartisk detektion av funktioner på EM-nivå i en vävnad omfattande kvantifierbara sätt.

Introduction

tekniska utvecklingen de senaste har förbättrat mångsidighet, användbarhet och kvantitativ natur EM, vilket leder till ett återupplivande av ultra analys. Förskott inkluderar 3D EM, storskalig 2D EM och förbättrade förfaranden och reagens för korrelerad Ijusmikroskopi och elektronmikroskopi (CLEM) för att jämföra andra typer av mikroskopiska analysen direkt till EM nivå 8-10. Storskalig 2D EM är särskilt lämpligt att kvantifiera eller identifiera (nya) sjukdoms funktioner för mänsklig patologi, studera djurmodeller för sjukdom och vävnadsodlingsmodeller. På grund av den vanligtvis små synfältet är det svårt att korrelera förändringar på hög förstoring till en vävnad stor skala, samt att unbiasedly och kvantitativt analysera ultra funktioner.

För patologisk analys av mänsklig vävnad eller bedömningen av patologi i djurmodeller, hematoxylin och eosin (H & E) färgade sektioner av formaldehyd fast paraffininbäddade (FFPE) tissue är standard. Förutom enkel H & E färgning immunomärkning utförs också för att identifiera patologiska avvikelser. Om sådana vävnader kan analyseras på EM-nivå, specifika celltyper, och subcellulära förändringar kunde identifieras. Den objektiva karaktären av storskalig EM tillåter finna oväntade och nya egenskaper hos sjukdomen. Genom storskaliga EM områden upp till kvadratmillimeter kan visualiseras. Vi och andra tillämpas tidigare nanotomy råtta pankreasöar 4, cellodling 2, råtthjärna tre, hud och slemhinnor 7 och hela zebrafisk larver 1,5 (www.nanotomy.org). Zebrafisk är mycket lämpliga för in vivo avbildning, i synnerhet för att visualisera celltyper som är svåra att komma åt i däggdjursvävnader, inklusive hjärnan immunceller 11. Här nanotomy förfarande beskrivs i detalj, appliceras på koronala sektioner av zebrafiskhuvuden som genomgår villkorlig neuronal ablation genom omvandling av metronidazol med neuronaluttryckt nitroreduktas (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alla rådata presenteras som zoombar HTML-filer, visualisera molekylär vävnadsskalförändringar. Presentationen av rådata tillåter objektiva analyser av datamängder från andra vinklar av experter över hela världen.

Protocol

Alla experiment med zebrafisk larver godkändes av djurförsökskommitté vid universitetet i Groningen i enlighet med nationella och EU: s riktlinjer.

1. Provframställning

  1. Fixering och inbäddning
    1. Fixering
      1. Söva fisklarver i tricaine (0,003%) tillsätts till E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7,6) zebrafisk vatten och testet för anestesidjupet genom peta försiktigt med en 200 mikroliter pipettspets enligt dissektionsmikroskop tills rörelse inte längre detekteras (Figur 1A).
      2. Vid behandling av prover för korrelat EM efter att ha förvärvat in vivo imaging data med hjälp av konfokal eller två foton avbildning i 1,8% agaros som beskrivits, 5,15 fix larver i agaros med användning av 4% PFA i PBS innehållande Triton-X-100 (0,05%).
      3. Klipp larver från agaros och processen förstorskalig EM 5.
      4. Fixa larver i färskt 4% paraformaldehyd i PBS innehållande Triton-X-100 (0,05%) under 2 h vid rumstemperatur i plaströr.
        Obs: Celler odlade i kultur (in vitro) kan direkt fixeras i glutaraldehyd, såsom beskrivs i nästa steg (1.1.1.5).
      5. Ta bort lösningen och tillsätt 100 | il 0,5% PFA, 2% glutaraldehyd (GA) och 0,1 M natriumkakodylat (pH 7,4). Lagra över natten vid 4 ° C. Skölj prover två gånger i 0,1 M natriumkakodylat.
      6. Skär larver huvuden rostrally till bakhjäman att underlätta penetrering av osmium. Använd fin sprutor / pincett.
      7. Postfix larver i 1% osmiumtetroxid (OSO4) /1.5% kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6]) i 0,1 M natrium-kakodylat på is under 2 h och skölj 3 x 5 min i dubbeldestillerat H2O
      8. Torka i etanol med 20 min inkubationer i ökande etanolkoncentrationer (50%, 70%, 3 gånger 100%).
    2. inbäddning
      1. Förbered epoxiharts enligt standardrecept som används i EM labb.
        Obs: Vi använder epoxiharts enligt följande: Blanda 19,8 g glycid eter 100, 9,6 g 2-dodecenylsuccinic syraanhydrid och 11,4 g methylnadic anhydrid med användning av en magnetomrörare. Tillsätt 0,5 g DMP-30 (tris- (dimetylaminometyl) fenol) och blanda igen.
      2. Inkubera larver över natten i 50% epoxiharts i etanol (v / v) under rotation (RT).
      3. Byt utspädd epoxiharts med ren harts. Inkubera under 30 min, tillsätt färskt harts igen och inkubera under ytterligare 30 minuter. Återigen uppdatera hartset och sedan inkubera 3 h vid RT, följt av 15 min vid 58 ° C och ytterligare 1 h vid RT under lågt tryck (200 mbar).
      4. Orientera huvudena i kommersiellt tillgängliga kisel platt inbäddning formar under ett dissektionsmikroskop med hjälp av en nål eller tandpetare med främre inför sidan av formen eller vid behov (Figur 1B).
      5. Polymerisera epoxy resi över natt vid 58 ° C. Om epoxiharts är fortfarande alltför mjuk låta en annan dag för att polymerisera och härda vid 58 ° C. Test stelhet genom att applicera tryck med pincett. Om detta lätt lämnar en inbuktning låta en annan dag för att polymerisera och härda vid 58 ° C. När provet är helt härdad vidare till trimning och snittning.
      6. Klipp bort överflödigt harts från axel använder rakblad (Figur 1B).
  2. Sektionering, kontrastera, och monterings
    1. sektionering
      1. Avsnitt epoxiharts blocket med användning av en ultramikrotom.
      2. Använd en glaskniv eller en diamant histoknife att skära halvtunn sektioner (500 nm) för toluidinblått / grundläggande fuksin (figur 1D) färgning att upptäcka rätt positionering.
      3. Överför halv tunna sektioner på objektglas genom att plocka upp dem med ett glas Pasteur pipett vars spets har stängts genom smältning i en flamma. Torka på en varm platta until inget vatten kvar. Färga i 10 sekunder med 1% toluidinblått i vatten på en varm platta och efter sköljning med vatten, bets för 10 sek med 0,05% basisk fuchsin i 1% natriumtetraborat. Undersök med en normal ljusmikroskop vid 10X till 40X.
      4. När den rätta platsen / orientering i hjärnan nås, fortsätter sektione epoxiharts block med en diamant kniv för att skära ultratunna sektioner (~ 70 nm, Figur 1E)
      5. Använd lätt identifierbara anatomiska strukturer i och runt hjärnan, inklusive doft gropar, ögon, grå-vita substansen gränser, för att identifiera regionen av intresse under ultratunna sektionering och för att justera snitt vinkel när provet lutas.
      6. Mount avsnittet L2 x 1 koppargaller (figur 1F) fack, för att möjliggöra förvärv avbryts av gallerstänger. Använd Formvar belagda galler för att stödja sektionerna.
    2. kontrasterande
      1. Fläckultratunna avsnitt om rutnäts under 2 min i 2% uranylacetat i metanol följt av Reynolds blycitrat under ytterligare 2 min 16.

2. Image Acquisition

  1. Large Scale STEM
    Obs: Vi använder scanning EM med en extern skanning generator som kan förvärva flera stora synfält med hög upplösning 3,5,7,17 ​​använder STEM upptäckt. Typiskt genereras en bild på detta sätt är ekvivalent med synfälten på ~ 100 transmissionselektronmikroskop (TEM) bilder, vilket avsevärt minskar den mängd av sömmen.
    1. Monterings Prov i mikroskop
      1. Placera gallret med avsnitt i flera provgallerhållare och överför till kammaren i SEM.
    2. Anpassning av STEM Detector
      1. Sätt gallret med provet under strålen och flytta det så att det blir ca. 5 mm från linspolen. Förvärva en bild på 20 kV med användning avi-lins detektor.
      2. Fokus på gallerkanten och justera arbetsavstånd till 4,0 mm.
      3. Flytta provhållaren till en säker plats och ta in STEM detektor.
      4. Centrera hålet i STEM detektor i bildfältet genom att vrida justeringsskruvarna medan avbildning vid maximal hastighet med detektorn i objektivet.
      5. Försiktigt föra tillbaka provhållaren som bara kommer att passa mellan linsen pol och detektorn.
      6. Förvärva en bild med in-lins detektor för att se till att vara på sträckan området.
      7. Växla till STEM upptäckt (förstärkningsmediet och alla kvadranter som på "minus") och få en bild och välja det område som ska skannas.
      8. Höj accelerationsspänningen till 21 kV och vänta på stabilisering av balken (stabil bild igen) och sedan gå till 29 kV i steg om 2 kV.
    3. förvärva bilder
      1. Pre-bestråla provet (för att undvika ljusstyrkan ändras till följd av e-stråle) genom att zoomaut så hela området som ska skannas passar bildfönstret.
      2. Ändra öppning till 120 um (för att hålla rätt dynamiska omfånget detektor vinster måste sänkas ett steg).
      3. De fokus så att bilden är suddig.
      4. Gör det skannade området så hårt som möjligt med hjälp av den reducerade området skanningsalternativ.
      5. Ställ skanningshastighet så att en ram scannas i ca. 1-2 sek.
        Obs: Beroende på storlek och vävnads detta tar vanligtvis ½ h (100 x 100 pm FOV) till upp till tre timmar (1000 x 500 ^ m).
      6. Zooma in åtminstone 100 och skanna ett litet område i 10 sekunder.
        Obs! När det här området inte ändrar ljusstyrkan jämfört med dess omgivningar, pre-strålning är tillräcklig.
      7. Ta tillbaka 30 pm öppningen (och STEM vinst på medium)
      8. Fokus provet.
      9. Rikta bländaren med wobbler (vid ~ 40,000X förstoring).
      10. Även i fokus välja den lättaste område / funktion, ställ skanningshastighet så att detaljerär synliga.
      11. I mikroskop mjukvaran justera ljusstyrka och kontrast genom att noggrant titta på histogrammet för att hålla alla bildpunkter i det dynamiska området. Gör samma sak för de mörkaste området / funktioner.
      12. Gå tillbaka till det ljusa området och kontrollera igen. Var på den säkra sidan så det finns lite utrymme på båda sidor av histogrammet.
      13. Zooma ut så hela området som ska skannas passar bildfönstret, och starta det stora området förvärvsprogram.
      14. Använd guiden möjlighet att ställa upp en mosaik genom att välja ett område från skärmen. Använd pixelstorlek 2-5 nm beroende på vilka uppgifter är nödvändiga. Använd uppehållstid 3 ps för STEM.
      15. Välj alternativet "autofokus på tidigare plattor", använd den storskaliga förvärv programvara autofokus med standardföretagsinställningar, kryssrutan "kontrollera inställningen innan utförande" och definiera var att spara data.
      16. Tryck på "optimera" för att kontrollera mikroskop inställningar.
        Obs: Nu den tid som behövs kommer att vara shegen. Det kan vara upp till 72 timmar för 1 x 0,5 mm områden.
      17. I fönstret "maximal kakel upplösning" typ 20.000 så enskilda plattor inte kommer att vara större än 20k x 20k, förhindra trubbiga kanteffekter. Tryck på "kör".
      18. När du tillfrågas för att kontrollera fokus och ljusstyrka / kontrast (B / C), stänga yttre scan generator och noggrant ställa in fokus och astigmatism i mikroskop programvara. Ändra inte B / C.
        Obs: Scenen kan flyttas och förstoring förändrats, men förstoringen måste sättas tillbaka till den önskade pixelstorleken.
      19. Slå på extern skanna generator igen och tryck på "continue".

3. Dataanalys

  1. Öppna storskalig EM-fil tittaren program och öppna filen "mosaik info". Detta kommer att öppna alla kaklade tif-filer. Detta utförs företrädesvis på en annan arbetsstation till inte hindra nya förvärv.
  2. Välj alternativet "auatt sy hela mosaik (parametrar lappar läget på halv, sy tröskel 0,90 reduktion automatisk buller. Om sömmar kriterier kan inte uppfyllas, zooma in och placera manuellt kakel på plats och klicka på "fortsätta som är").
  3. Export som en html-fil, eller alternativt som en enda TIF.
    Observera att för TIF exportera en nedskalning kan behövas. Inkludera den slutliga pixelstorleken i filnamnet för bestämning senare.
  4. Utför anteckningar i TIF-fil genom att öppna den i ett bildredigeringsprogram. Parallellt öppnar zoombar html-fil i en webbläsare för optimal upplösning observation.

Representative Results

Storskalig EM dataset av koronala sektioner av chefen för en veckor gamla zebrafisk larver visar många vävnader och cellulära funktioner i en enda stor skala bilden (www.nanotomy.org).

Nanotomy kontrollhjärnsektioner avslöjar typiska ultra egenskaper hos nervvävnad av rostralt framhjärnan, inklusive luktfiberknippen, neuronala kärnor och neuronala under fack inklusive synapser (Figur 2A, www.nanotomy.org). Celltyper i huvudet som kan särskiljas inkluderar kondrocyter med stora vakuoler i underkäken, osmiophilic myelin av lukt nervceller, endotelceller i ett litet fartyg, strukturer inkluderar Meninx (zebrafisk motsvarighet mening, det membranskiktet kapsling däggdjurshjärnan). Subcellulära strukturer inkluderar glycocalyx av epidermis, olika nukleära morfologier och härdar i olika cel l typer och organ inklusive Golgiapparaten, endoplasmatiskt retikulum (ER), mitokondrier och synaptiska vesiklar och post-synaptiska densiteter.

Oväntat kärnorna hos celler som kantar ventrikeln är mycket elektrontätt förhållande till andra celler dispergerade mer lateralt i hjärnan. Dessutom är dessa ventrikulära kärnor visar mörka foci som är frånvarande i andra celler i hjärnan och verkar olika i storlek och struktur från heterokromatin, som finns i kärnan av fagocytisk mikroglia (Figur 2). Celler som kantar ventrikeln att utveckla zebrafisk inkluderar mestadels radiella gliaceller och neuronala stamceller, som kan återspegla en förändrad kromatin tillstånd än mer differentierade celler. Som stamceller i vävnad är i allmänhet ganska ovanligt att nanotomy korrelera vävnad märkning av stamcellsmarkörer med vävnads skala EM kan därför användas för att identifiera ultra egenskaper hos stamceller.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Storskaliga EM (www.nanotomy.org) av en koronalt sektion i en zebrafisk larv genomgår neuronal ablation avslöjar många specifika vävnader och cellulära och molekylära funktioner som inte finns i kontrolldjur. Cellular funktioner inkluderar fagocytiska mikroglia och vakuoler storleken på celler, troligen representerar döende celler (Figur 2B, www.nanotomy.org). har tidigare EM studier identifierade mikroglia i ryggradsdjur 18,19. Utmärkande för mikroglia inkluderar långsträckta kärnor , klumpar av ojämn kromatin bredvid kärnhöljet, framträdande Golgiapparaten, fria polyribosomer, granulära endoplasmatiska retiklet (ER) med långsmala cisternae, relativt mörk / tät cytoplasma, och många inneslutningar, såsom fagosomer, lipid droppar och lysosomer. Alla dessa stämplar, hänföras till mikroglia i däggdjursvävnader, hittades också i dessa celler i zebrafisk hjärnor (Figur 2B, www.nanotomy.org).

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figur 1
Figur 1: Workflow av Storskalig Tissue elektronmikroskopi på Zebrafish hjärnor. (A) 7 dagar gammal zebrafisk larv. (B) Zebrafish larver huvuden inbäddade sida vid sida i epoxiharts. (C) glaskniv för semi -thin sektione och orientera provet. (D) Representant halvtunn toluidinblått färgade snitt som visar två sida vid sida inbäddade zebrafisk larver. (E) Diamond kniv för att skära ultratunna (70 nm) sektioner. (F) redigerade bilden i (D) av hela zebrafisk larver hjärnan avsnittet om ett hål rutnät för att indikera placeringen. (G) mikroskopi system som används för storskalig 2D EM i denna studie. (H) Flöde av bildbehandling. klicka häratt se en större version av denna siffra.

figur 2
. Figur 2: Nanotomy Resultat:. Från makromolekyl till Tissue (A) Nanotomy av hjärnorna hos 7 dagar efter befruktningen kontroll och (B) behandlades (neuronal ablation, Figur 1), som visar funktioner som är specifika för den neuronala ablation degenerativ hjärnsjukdom (B) Dessa inkluderar fagocytiska mikroglia, mörka celler som genomgår celldöd och svampliknande utseendet hos nervvävnad ((A) och (B)). Övre paneler (anpassad från 5): 10X förstorad vy av region som anges i mitten paneler. Mitten paneler: 10X förstorad vy av region som anges i lägre paneler. (A, mellersta panel) Hög förstoring bild av neuropil visar synaps i (A, lägre panel), synaptiska vesiklar (SVS) ochpostsynaptiska densitet (PD). (B, mellersta panel) Hög förstoring bild av amöboid mikroglia eller möjligen en makrofag (mittpanel, M) visar typiska amoeboid mikrogliaceller funktioner (lägre panel) inklusive framträdande Golgiapparaten (G), inneslutningar inklusive lysosomala vakuoler (L). Skalstrecken: 50 ^ m (överst), 5 | j, m (mitten) och 0,5 | j, m (underst). Denna siffra har ändrats från 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra , eller besöka den fullständiga data online (nanotomy.org).

Discussion

EM möjliggör analys av cell sammanhang med hög upplösning avbildning av makromolekyler i biologiska sammanhang. Detta begränsar emellertid typiskt synfältet. Större skala 3D EM är särskilt lämplig för att kartlägga nervkopplingar genom att skapa nano upplösning 3 dimensionella rekonstruktioner, som kräver komplexa databehandling 10. Däremot kräver 2D storskalig EM bara ett enda avsnitt och sömnad av bilddata, och bedömning av uppgifter är möjlig genom vem som helst med tillgång till en webbläsare. Vi och andra tidigare använts i stor skala EM för att analysera vävnader och hela djur. När det gäller de flesta metoder, TEM och SEM-baserade sömmar har sina egna fördelar. Här var scanning transmission EM (STEM) används som möjliggör genereringen av ett stort synfält med hög upplösning. Vanligtvis är en STEM bild motsvarar synfälten på cirka 100 TEM-bilder, vilket avsevärt minskar mängden sömmar när avbildning stor fields perspektiv med hög upplösning. Om det krävs högre upplösning, kan TEM vara fördelaktigt. STEM har den fördelen framför TEM att icke-kontrasterade prover kan användas med god ultrastrukturella kontrast 6.

Dessutom kan den här beskrivna metoden enkelt justeras för användning med bakåtspridd elektrondetektering (BSD) på avsnitten monterad på kiseldioxid wafers, bredda användningen till flera mikroskopsystem. HTML-zoombar vävnads EM-filer är mycket användbara för kvantifiering, delning av data som inte kan ha analyserats till sin fulla innehåll, som kombinerar LM och EM data (Clem) 8, presentationsändamål i vetenskaplig forskning, analysera patientdata, och för utbildning. Alternativt kan i storskalig EM i en SEM, men inte i en TEM, kiseldioxid wafers kan användas, som har två huvudsakliga fördelar: BSD kan användas, vilket är mer allmänt tillgängliga på svepelektronmikroskop än STEM detektering. För det andra, montering av stora delar (> 1 mm 2 områden avränta) är okomplicerad. Montering på enstaka slitsade galler är arbetsintensiv och tekniskt utmanande. Detaljerad jämförelse mellan TEM, SEM och STEM specificeras på annat håll 6. En nackdel med BSD avbildning är att, jämfört med STEM, bilder har ökat buller. Detta kan delvis kompenseras genom att öka tiden pixeluppehålls, vilket resulterar i mycket längre hämtningstider.

Även för provberedning relativt standard EM bearbetning (fixering, inbäddning och snittning) behövs 5-7, är det tekniskt utmanande att skära stora ultratunna sektioner helt saknar artefakter. Sektioner är mycket bräcklig, lätt gå sönder, lägga sig eller förstörs under avbildning, vilket normalt tar flera timmar per dataset. Men på grund av online-delning av rå objektiva data bör det bli möjligt att jämföra lättare publicerade data och använda publicerade dataset i det öppna verksamhetsområdet som kontroller. För närvarande är det få EM-enheter med förmåga att laRGE-skala analys är i bruk, och därför tillgång till denna teknik är något begränsad, även om de flesta röntgenkliniker välkomna samarbeten.

För storskaliga sektioner vävnaden måste vara ordentligt fästa i hela provet. Det är därför en blandning av snabb men måttlig fixativ PFA används i kombination med den långsamma men stark fixerings GA. Kapning och plocka upp stora delar utan artefakter är svårt. Arbeta med skivor i kombination med BSD är lättare jämfört med att samla delar på enstaka hål galler. Heavy metal post färgningen är mer kritisk än klassisk EM. Eftersom hela avsnittet avbildas varje artefakt kommer att vara synlig. TEM användarna typiskt att det är svårt att byta till en SEM, på grund av skillnaden i mikroskop drift.

Kvantifiering och datadelning - kvantifiera subcellulära funktioner är svårt i enstaka EM bilder. Möjligheten att zooma in och ut i stor skalabilder kan lätt identifiering av celler av intresse, som kan följas av nano mätningar inuti cellerna. Dessa datamängder visar att specifika celltyper kan snabbt identifieras och kvantifieras på ett opartiskt sätt i dessa stora vävnadssnitt, baserat på funktioner detekterbara i olika skalor. Till exempel mikroglia kan identifieras baserat på deras morfologi och tät cytoplasma. Därefter, vid zooma in på de enskilda cellerna, nanoskala subcellulära och molekylära egenskaperna hos dessa celler kan mätas inom samma dataset, som vi tidigare visade för ER bredd inom ett storskaligt EM vävnadskultur dataset 2. En ytterligare fördel med nanotomy är att hosting av storskaliga datamängder på nätet gör det möjligt för andra att inspektera uppgifter, kanske för andra funktioner, och dra sina slutsatser om ny hypotes.

CLEM - Förutom att underlätta kvantitativ EM gör storskalig EM det lättare att korrelera ljus microscopic märkning EM nivå 8. I föreliggande exempel närvaron av fagocytiska mikroglia i en zebrafisk ablation modell visas. En viktig fråga i neurovetenskap är vad de enskilda funktionerna och bidrag är av mikroglia och potentiella andra källor till fagocytiska och immunceller. Tidiga EM studier har visat distinkta subcellulära funktioner i mikroglia vid sjukdom 18. Tyvärr är det svårt att selektivt märka mikroglia i synnerhet i en patologisk inställning, som de uppvisar stor överlappning med andra immunceller i genuttryck, morfologi och funktion. Därför är det oklart om och när mikroglia på ultra nivå skiljer sig från immunceller från andra källor, inklusive monocyter härrör infiltrerande makrofager. Förstå om det finns ultra skillnader mellan dessa celler kommer att ge en utgångspunkt för analys av funktionella skillnader. Kombinera selektiva transgena eller uttrycks markörer och CLEM tillåter Detvsnitt av ultra funktioner selektiva för specifika populationer.

Diagnos och presentation och utbildning - Genom att visualisera nanoskala till mikro inom en enda datauppsättning EM data underlättas avsevärt till en bred publik. Med de ökade möjligheter och verktyg för korrelat och storskalig EM räknar vi ett återupplivande av EM i grundläggande och medicinsk forskning. Vår metod representerade här tillämpas på en zebrafisk hjärnskada modell 5, men har använts på mänsklig vävnad 7, råtthjäma 3, i en råttmodell för diabetes 4 och i cellkultur 2, och kan även användas i kombination med ett TEM -baserade tillvägagångssätt 1 visar mångsidigheten hos denna metod. Operatören mikroskop inte längre inspelning starkt markerad och därmed snedvridna bilder, men alla många ultra funktioner registreras och öppna för global analys.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Majoriteten av arbetet har utförts på UMCG Mikroskopi och Imaging Center (UMIC), som sponsras av NWO 175-010-2009-023 och ZonMW 91.111.006; STW "Microscopy Valley 12718" till BNGG. Detta arbete sponsrades av en ZonMW VENI bidrag, en Marie Curie karriär integrationsbidrag (spara döende nervceller) och en Alzheimer Nederland gemenskap till TJvH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
  2. Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
  3. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
  4. Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
  5. van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
  6. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
  7. Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
  8. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
  9. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
  10. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
  11. Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
  12. van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
  13. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
  14. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
  15. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
  16. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
  17. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  18. Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
  19. Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics