Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

endotelyal NO sentaz (eNOS) üretilen Endotel türetilmiş nitrik oksit (NO), kardiyovasküler fizyoloji en önemli vazoprotektif moleküllerden biridir. ENOS ayrılması süperoksit anyon NO biyoyararlanım ve artış azalmaya yol olarak işlevsiz eNOS gibi (O 2 .-) üretim ve sırayla kardiyovasküler hastalıklar teşvik etmektedir. Bu nedenle, endotel hücreleri NO ve O 2 .- seviyelerinin uygun ölçüm kardiyovasküler hastalıklar ve komplikasyonları hakkında araştırma için hayati önem taşıyor. Çünkü NO ve O 2 .- son derece kararsız doğasından ötürü, herhangi bir önlem ve O 2 .- doğrudan kan damarına zordur. Birçok yöntem HAYIR ölçmek ve O 2 .- üretim için geliştirilmiştir. Ancak, her iki hassas olmayan ya da spesifik olmayan ya da teknik olarak zor ve özel ekipman gerektirmektedir. Burada bir adaptasyon tarifYüz eş zamanlı olarak saptanması ve hücre içi NO ve O 2 görselleştirme tr .- kaynaklı bir obezite fare modeli sağlam aorta sırasıyla, hücre geçirgen diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak floresan boya yöntemi yüksek yağ-diyet beslenme ile. Kontrol yalın fare ile karşılaştırıldığında Biz obezite fare taze izole edilmiş sağlam aorta 2 .- seviyeleri hücre içi NO azalmış ve O zengin oldukları olabilir. Bu yöntem, doğrudan algılama ve görselleştirme NO ve O 2 için kolay bir teknik, .- sağlam kan damarlarında ve yaygın (fizyo) patolojik koşullarda, endotelyal (dis) fonksiyonunun incelenmesi için uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

Introduction

Vasküler endotelyal hücreler vazoaktif faktörlerin 1 serbest vasküler fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü korumak. Bu faktörler arasında, endotelyal NO sentazı (eNOS) ile L-arginin üretilen endotel kaynaklı nitrik oksit (NO), kardiyovasküler fizyoloji 2 en önemli ve en iyi karakterize edilen bir faktördür. NO dolayısıyla vasküler hastalık geliştirme 3 karşı koruma, endotel altı boşluğu içine trombosit agregasyonunu ve inflamatuar hücre yapışması ve infiltrasyonunu inhibe düz kas gevşemesi neden olur ve hücre çoğalmasını inhibe eder. Vb yaşlanma, hipertansiyon, diyabet, hiperlipidemi, aşağıdakileri içeren bir çok fizyolojik ve patolojik koşullar altında, karakterize endotel disfonksiyonu hiçbir biyolojik azalma ve O 2 .- üretimi mevcuttur ve ateroskleroz 2 patogenezi teşvik artmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar eNOS ayrılması bir olduğunu göstermekÇeşitli yukarıda belirtilen koşullar 1,4 altında eNOS enzim O 2 ürettiği endotel disfonksiyonu, .- yerine NO için önemli bir mekanizma. Bu nedenle, endotelyal fonksiyon analizi, özellikle endotelyal NO üretimini ve O 2 .- nesil kardiyovasküler hastalıklar ve komplikasyonları hakkında deneysel araştırmalar için çok önemlidir.

analiz eden ve biyolojik örneklerdeki NO üretimini ölçmek için geliştirilmiş bir çok yöntem yaklaşım vardır. Ve NO - 3 - nedeniyle kolaylıkla NO 2 oksitlenir NO derece kararsız olmaları 3 sn 6 arasında bir yarı ömürle, hiçbir doğrudan ölçülmesi çok zordur. / NO - 3 - NO 2 nedenle saptanması sıvısı örneklerinde hücrelere veya dokulara 5 salınan NO indeksi olarak kullanılmıştır. Prosedür, nispeten kolay olmakla birlikte, bu yöntem, ancak, EA/ HAYIR 3 - - çözeltide bulunan sily istikrarlı NO 2 yüksek arka etkilenir. NO siklik guanozin monofosfat (cGMP) 6 üretilmesi için çözünebilir guanilat siklazı uyaran için hücresel cGMP düzeyi de hiçbir serbest 7 tahmin etmek için belirlenmiştir. Yine, bu dolaylı tahmini ve C-tipi natriüretik peptidin (CNP) gibi endotel kaynaklı faktörler de parçacık guanilat siklazın 8 aktivasyonu yoluyla cGMP düzeylerini artırmak olabilir, çünkü spesifik olmayabilir. NO yan ürün 9, L-sitrulin, üretiminin ölçülmesi, bu nedenle, aynı zamanda, NO üretimini tahmin etmek için dolaylı bir yöntem olarak kullanılabilir bir şekilde L-sitrulin üretimi ile L-arginin ile elde edilir. Bu yöntemin en önemli dezavantajı radyoaktif olduğunu ve biyoaktif NO düzeylerini ölçmek olmadığını vardır, O 2 NO hızla inaktive olabilir bıraktığından beri .-; Öte yandan, L-sitrulin l- için geri dönüştürülebilir10 arginin. Bu kimyasal aydınlatma 11, elektron spin rezonansı, 12 veya elektrokimyasal porphyrinic sensör 13 gibi diğer kimyasal yöntemler bazı araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. Bu yöntemler, genellikle tespit prosedürleri işletim kolay değildir ve özel ekipman gerektirir. Birçok çalışma ile veya endotel fonksiyonunu değerlendirmek ve dolaylı olarak endotel kökenli NO aracılı vasküler relaksasyon ölçmek endotel olmadan izole kan damarları ile organ banyosu deneyleri uygulamak söz aynı zamanda. çoğunlukla fizyolojik duruma yakın, ama olmasına rağmen Ancak, bu yöntem, kesinlikle söylemek NO işlevi ölçmez, oldukça bir üretim eNOS fonksiyonunun net etkilerini yansıtan genel olarak endotel aracılı vazomotor yanıtları değerlendiren diğer endotel kökenli gevşetici faktörleri ve endotel kaynaklı sözleşme faktörleri, O 2 .- üretimi, ve düz kas hücrelerinin de yanıtlarıBu faktörler. ENOS işlevi veya NO üretiminin özel bir analiz genellikle 3 gereklidir.

Bizimki de dahil olmak üzere pek çok araştırma grupları YOK 14-19 hücre içi üretimini saptamak için floresan boya yöntemi kullanılan son yıllarda var. Bu yöntemde, hücre geçirgen floresan göstergesi diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA), in vitro ya da ex vivo hücre ve dokuları canlı kuru NO ve NOS fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. prensibi canlı hücrelerde, DAF-2DA floresan olmayan 4,5-diaminofluorescein hücre içi esteraz suretiyle sitinin asetili alınır edilir bu o zaman ile reaksiyona sokularak DAF-2 triazol (DAF-2T) floresan dönüştürülmüştür (DAF-2) . DAF-2T floresan flöresanlı bir mikroskop veya flöresanlı konfokal mikroskop 14 altında gözlemlenebilir. Hücre içi floresan yoğunluğu dolayısıyla hücrelerde hücre içi NO üretimini veya sağlam kan vesse bir endotelyumuna yansıtırl. Böyle dihydroethidium (jeotermal) gibi belirli bir floresan boya ile birlikte, bir anda hücrelerde ya da kan damarlarında 14 hücre içi NO ve O 2 .- nesil değerlendirir. Benzer şekilde, DHE hücre geçirgen O 2 ile oksitlenir bileşik .- hücrelerin içinde ve daha sonra nükleik asitler ile intercalates floresan mikroskop veya floresan konfokal mikroskop ile kantitatif tespit edilebilen parlak kırmızı bir renk yayan oksidatif ürünü aynı zamanda. Bu, esas itibariyle, süperoksit radikalleri tespit hücreler tarafından iyi korunur ve hatta hafif tespit 20 tolere edilebilir DHE, O 2 .- biyolojik örneklerden saptanması için çok belirgin bir boyadır. Bu flöresan boyası yönteminin avantajlarından biri de tespit eder ve doğrudan bir oturma kan damarının sağlam endotel tabakası üzerinde cepheden NO ve / veya O 2 .- görselleştiren olmasıdır.

Bu sayfada,Bu floresan boya NO algılamak için yöntem ve O 2 .- biz yüz NO tespiti ve O 2 tr için adapte olması tarif .- yüksek yağ-diyet (YYD) besleme tarafından uyarılan bir obezite fare modeli sağlam aorta içinde. Biz bu yöntemi başarıyla ve güvenilir NO ve O 2 .- düzeylerini ölçmek ve obezite taze izole edilmiş sağlam fare aorta endotel tabakasında eNOS (dis) fonksiyonunu değerlendirmek olabilir göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan çalışmaları Fribourg, İsviçre Veteriner Dairesi Etik Komitesi tarafından onaylandı. protokolü kurumda hayvan bakımı ve deney üzerinde yönergeleri takip eder.

İzole Arter İnkübasyon için Set-up 1. Hazırlık

  1. 37 ° C'ye kadar ısıtıldı ve bir karbon tankından% 95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırıldı edilebilir bir organ banyosu sistemi oluşturmak.
  2. Aşağıdaki bileşimin konsantrasyonu ile gerektiği kadar Krebs-Ringer bikarbonat tamponu hazırlayın: (118 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0.026 mM EDTA ve 11.1 mM D-glukoz).
  3. Buz üzerinde stok tampon tutun ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile tampon havalandırır.
  4. organ banyosu sistemi açın, 37 ° C'de sıcaklığı ayarlamak her odasına hazır kullanıma tampon 5 ml ekleyinve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile tampon havalandırmak tutun.
  5. 30 dakika boyunca Krebs-Ringer tampon maddesi ile bir kez odaları yıkayın.
  6. Her bölmeye 5 ml Krebs-Ringer tamponu ilave edin ve buharlaşmayı önlemek için bölme kapsamaktadır.

Fare aorta 2. izolasyonu

  1. fareler kurban ila 150 mg / kg konsantrasyonunda intraperitonal% 0.9 NaCI içinde çözülmüştür pentobarbital enjekte edilir.
  2. cerrahi gemide supinely fare Lay.
  3. sanitizasyon ve nem amacıyla% 70 etanol ile göğüs bölgesinde kürk püskürtün.
  4. kaburga çevresinde keserek açık göğüs boşluğu, kalp ve akciğerler maruz ve akciğerleri kaldırmak için.
  5. Bir kağıt mendille hafifçe göğüs boşluğunda kan kaldırın.
  6. Bir forseps ile yavaşça kalp kavrayın ve cerrahi makas ile aorta ve omurga arasındaki perivasküler yağ dokusunun kesim tarafından aorta ayırmak.
  7. Hemen whol batırmakbuzla soğutulmuş (4 ° C) Krebs-Ringer tampon maddesi içinde e dokular.
  8. Bir diseksiyon mikroskobu altında kalp ve aort arkı çıkarın ve tamponda torakal aort segmenti tutun.
  9. cerrahi makas ve forsepsle bir mikroskop altında perivasküler, yapışan dokulardan aort teşrih.
  10. Bir forseps ile aort uç kenarından tutun ve yavaşça bir 26 G × 1 / 2" şırınga ile Krebs-Ringer tampon kızarma vasküler lümen kanı temizler.
  11. 3 mm uzunluğundaki bölümler halinde temizlenmiş aort halkaları kesin.
    Not: endotel tabakasına zarar vermeyen bu aşamada dikkat ediniz.

3. DHE ve DAF-2DA Boyama

  1. 37 ° C'de Krebs-Ringer tampon ile doldurulmuş bir organ banyosu odaları için forseps ile temizlenmiş aort segmentleri transfer% 95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırıldı.
    forseps ile aort halkaları Touch sadece adventisyal tarafı ve b kelepçe yok: NotLood gemiler.
  2. 30 dakika boyunca organ banyosu odasında arterleri dengelenmesi.
  3. nihai konsantrasyon 1 uM, organ banyosuna asetilkolin (Ach) ekleyin ve 10 dakika boyunca damar inkübe edin.
  4. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde önceden ısıtılmış Krebs-Ringer tampon maddesi ile (1.000 × stoktan seyreltilmiş, her boyanın 5 uM) DHE / DAF-2DA çözeltisi 1 ml hazırlayın. Işık maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile ependorf tüp sarın.
  5. Stimülasyon sonrasında 37 ° C'de, bir mikrosantrifüj tüpü içinde DHE / DAF-2DA çözeltisine organ banyosu arasında aortik halkaları transferi% 95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırılmıştır ve 30 dakika boyunca aort halkaları inkübe edin.
    Not: Bu adımda itibaren, karanlıkta hep aorta tutun.
  6. Çamaşır yıkama için Krebs-Ringer tampon maddesi ile yeni mikrosantrifüj tüpüne aort halkaları aktarın ve 1 dakika içinde üç kere yıkama gibi tekrar edin.
  7. 30 için sabitleme için% 4 paraformaldehid çözüm aort halkaları aktarınMin.
  8. Hazırlama 1 mi 4 ', fosfat tamponlu tuz (PBS), bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tampon (1.000 × stoktan seyreltilmiş 300 nM), 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi. 3 dakika boyunca aorta counterstain.
  9. 1 dakika boyunca yıkama için PBS tamponuyla yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aorta aktarın. yıkamanın üç kez tekrarlayın.
    Not: Aort halkaları kelepçe veya endotel tabakası zarar vermemeye dikkat edin.

Montaj 4. En Face

  1. slayt montaj orta bir damla ekleyin.
  2. Haddelenmiş-up aorta düz yapabilir ve cam slayt aşağı bakacak şekilde endotel ile montaj ortamında yüz tr monte, mikroskop altında mikrocerrahi makas ile uzunlamasına aort halkaları kesin. ileri ve geri aorta hareket etmiyor.
  3. kapak kayma ile slayt Kapak ve oje ile slayt mühür.
  4. Işık koruma altına hava kurutulduktan sonra, korkunç görüntülenmesi için slaytlar kullanınctly veya saat içinde önümüzdeki birkaç gün için -20 ° C'de saklayın.

5. Konfokal Mikroskopik Görüntüleme

  1. floresan sinyalleri algılamak için bir konfokal mikroskop kullanın. Makinenin açın ve büyütme, tarama hızı, çözünürlük, Z-yığını gibi görüntüleme ayarlarını optimize eder.
    1. Bu protokol için, bir 1024 × 1024 piksel, 200 Hz tarama hızı, çözünürlük ve 0.25 mikron Z adım boyutu kullanın. oysa 514 nm jeotermal gelen floresan heyecanlandırmak ve 605 nm emisyon de tespit, 488 nm argon lazer ile DAF-2DA gelen floresan heyecanlandırmak ve 515 nm'de algılar.
  2. DAPI sinyali ultraviyole ışınları ile temizlenene kadar örnek üzerinde odaklanmak için 10X büyütme kullanın ve sonra 40X büyütme amacını ayarlayın.
  3. Kontrol panelindeki Z konumunu ayarlayarak endotel tabakasının aralığını tanımlar. DAPI lekeli çekirdekleri sinyalleri endotel tabakasında oval veya yuvarlak noktalar vardır.
  4. üst taramaendotel sinyal ve kayıt görüntülerin tam kalınlığı boyunca numunenin (lümen sınırında endotel tabakası). Her numune taramak için en az 3 farklı alanları seçin.

Görüntüler 6. Analizi

  1. konfokal mikroskop tarafından taranan verileri açmak için yazılımı kullanın. analiz için alan başına art arda üç görüntüleri seçin ve numune en az 3 farklı alanlarda değerlendirmek. seçilen görüntüleri dışa ve JPEG dosyaları olarak kaydedebilirsiniz.
  2. Görüntü işleme yazılımı ile boyanarak DAF-2DA jeotermal ve DAPI görüntüleri ölçmek. DAPI boyama gelen görüntü için, 'Eklentiler' seçeneğini → DAPI pozitif çekirdeğin sayısını saymak için → 'Hücre Sayaç' Analiz '.
    1. DAF-2DA ve DHE boyaması gelen görüntüler için, sinyallerin yoğunluğunu analiz etmek → 'Tedbir' 'Analiz' seçin ve göreli sinyal yoğunluğu olarak 'Mean' değerini alır. DAF-2DA oranına olarak mevcut sonra sonuçlarDAPI pozitif çekirdekleri veya DAPI için jeotermal enerjiden oranı. Her numune için, her görüntü ve alanın ortalama değerini alır.
  3. katlık değişime almak için kontrol grubunun ortalama her numunenin sonucunu bölün. İstatistiksel analiz Dunnett veya Bonferroni post-testi ile eşleştirilmemiş Student t testi ve ANOVA ile yapıldı. Ortalama ± SEM olarak veri verin. P <0.05 14 anlamlı olarak ortalama değerleri arasındaki farkları göz önünde bulundurun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Obezite iskemik koroner kalp hastalığı için önemli bir risk faktörüdür ve ilişkili NO biyoyararlanımını, aterosklerotik damar hastalığı 21 bir işaretidir endotel azalır. eNOS-ayrılması 22, ateroskleroz ve obezite 14 yaşlanma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik ve patolojik koşullar altında endotel disfonksiyonu için önemli bir mekanizma olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada temsili NO sonucunu ve O 2 .- aorta seviyeleri göstermek için zayıf ve obez fareler karşılaştırın.

% 10.6 yağ,% 27.6 protein ve% 57 karbonhidrat, lif% 4.8: Enerji içeriği; 7 haftalıkken başlayarak, erkek fareler (C57BL / 6J) ya normal chow (NC 14 hafta boyunca ücretsiz erişim verildi ) ya da yüksek yağlı diyet (YYD, enerji içeriği:% 55 yağ,% 21 protein ve% 24 karbonhidrat). YYD farelerde 14 hafta vardı sonrakurban ve göğüs aorta disseke ve yapışan dokuların temizlendi. DAF-2DA ve DHE aşamasını lekelenme, eNOS LN G -Nitroarginine metil ester (L-NAME) (1 mM), eNOS aktivitesi 14 engellemek için 1 saat boyunca banyosu bölmesine ilave edildi inhibitör. Temsilci konfokal floresan sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Üst panelde mavi renk DAPI ile boyanmış endotel hücreleri çekirdeğini temsil etmektedir. orta panelde, yeşil renk floresan olmayan DAF-2 NO, yeşil sinyal yoğunluğu yüksek ise gelir dönüştürülmüş DAF-2T floresan sinyali, hücrelerde NO daha vardır. Benzer şekilde, alt panelde kırmızı renk O 2 .- tarafından okside jeotermal floresan sinyali, yani daha kırmızı renk gösteren örnek daha fazla O 2 .- hücrelerinde vardır.

Konfokal floresan mikroskopi azalma görüldüD farelerinin aort endotel tabakasının NO üretimi sağlar (DAF-2DA boyama) ve artan L-NAME duyarlı O 2 .- nesil (DHE boyama), farelerin bu NC (Şekil 1) 14 beslenir karşılaştırıldığında HFD beslenen eNOS-uncoupling düşündüren obezitede. Sinyalleri sayısal ve çubuk grafikler 14 sunuldu.

Şekil 1
Şekil obezite 1. eNOS-sökme. Yüz NO tespiti ve O 2 tr Konfokal mikroskopik .- sırasıyla DAF-2DA ve DHE boyaması ile. n = 5; *** p <NC vs 0.005; ††† p <YYD grubunda vs 0.005. Ölçek çubuğu = 0.1 mm. (Veriler referans 14 idi) , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NO ya da O 2 tespiti .- floresan boyalar ile çoğu zaman dokuya cryosections 23 da kültürlü endotelyal hücrelerde pek çok çalışmada kullanılan ve. Burada yüz NO tespiti ve O 2 .-, nispeten basit ve sezgisel etkili sırasıyla DAF-2DA ve jeotermal, ile endotel tabakasında düzeyleri tr, yani sağlam bir yaşam kan damarları, bu yöntemi genişletilmiş. Bir arter medyada elastik lifler, özellikle cryosections aorta belirli NO veya O 2 ile müdahale edebilecek çok güçlü otofloresans sinyalleri vermek beri vasküler cryosections yöntemin ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, alt arka plan gösterir ve daha nicel olduğunu. - endotel hücreleri içinde üretilen sinyaller. Ayrıca, orta kas hücrelerinin NADPH oksidaz ya da diğer enzimler tarafından spesifik O 2 .- üretimi de engel olabilirvasküler cryosections olan yöntemin dezavantajı temsil vasküler bölümünde, endotelyal hücrelerde sinyalleri. Buna karşılık, en yüz boyama yöntemi sağlam bir damar segmentinin endotel tabakasından özellikle sinyalleri algılar ve bu nedenle daha hassas analiz verir. cryosection hazırlanması için bir kriyostat makinesi de pahalı bir yatırımdır. Diğer biyokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin ana sınırlama daha az nicel, ancak numuneler arasındaki göreceli karşılaştırma için iyi bir seçimdir. Ayrıca, pahalı bir konfokal mikroskop ihtiyacı da bu yöntemin bir sınırlamadır. çoklu organ hücre sistemi uygundur ve bu laboratuarda mevcut değilse tüplerde kan damarları, böylece, kolayca, bir su banyosu ve düzenleyici sistem bir karbon gaz tankına bağlı olan tüpler bir sistem oluşturabilir 37 ° C'de tutuldu ve% 95 O2 ve% 5 CO gaz

bir dikkat ödemek zorunda birkaç kritik adımlar vardır. perivasküler doku Kolay montaj için temizlenmiş olduğundan emin olun. yapay sinyaller neden ve floresan sinyalleri ile müdahale edebilir, çünkü damar lümeninde kan pıhtısı, uzak yıkanmalıdır. Kan damarı hazırlama, inkübasyon, yıkama, kesme ve montaj ile ilgili tüm prosedür sırasında, bir kan damarlarının endotelyal tabakanın zarar vermemek için çok dikkatli olmak zorundadır. hazırlık tüm prosedür sırasında kan damarı kuru izin vermeyin. DHE ve DAF-2DA böylece aorta her zaman ışığa maruz korunmalıdır boyama aşamasından başlayarak, her ikisi de floresan sondalar bulunmaktadır. Tespitten önce aorta endotel hücreleri canlı olmalıdır adım, bu yüzden aorta her zaman% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile gazlı Krebs-Ringer tampon tutulmalıdır. Numunelerin görüntüleri, hazırlandıktan sonra mümkün olan en kısa şekilde alınmalıdır. floresan ışığı yaymaknce sinyal bile sonuçların doğruluğunu etkileyebilir montaj orta korunması, bir kaç gün içinde zayıf hale gelecektir. yöntem çok kalın damar duvarı ile kan damarları için geçerli olmayabilir.

İki boyalar birlikte kan damarlarının eklendi Bu yöntem, sağlam kan damarlarının endotel tabakasında eşzamanlı NO hayal gücü ve O 2 .- üretilmesini sağlar. Bir de izole kan damarları in vitro NO ve O 2 .- üretim ilaçların farmakolojik etkilerini değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. Bu amaç için, temizlenen aort genellikle bir kontrol ve bir ilaç tedavisi içindir ve DAF-2DA ve DHE adım boyamadan önce ilacın dengelemeden sonra inkübasyon tamponu ilave edilmelidir, iki parçaya kesilmiştir. Bu yöntem, izole edilmiş kan v vazomotor yanıtlarının analizi ile, örneğin, başka bir yöntemi ile birlikte kullanılırsa, bu, özellikle yararlıdıressels, endotelyal hücrelerin bir fizyolojik fonksiyonu kontrol edilebilir. Bu yöntem, bir hastalık modellerinin sağlam kan damarları ve altında yatan mekanizmaların herhangi bir endotel (dis) fonksiyonunu analizi için de uygun olacaktır.

Özetle, biz aynı anda bir floresan konfokal mikroskop ile sağlam kan damarlarının endotel tabakasında NO ve O 2 .- üretimini saptamak için basit bir protokol sundu. Biz bu yöntemi başarıyla obezite fare modelinde nasıl çalıştığını gösteriyor. Bu yöntem çok damar hastalığı koşullarında endotelyal NO soruşturma ve O 2 .- üretiminde yararlı bir tekniktir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33, (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4, (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302, (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126, (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261, (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24, (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333, (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65, (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270, (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13, (1), 113 (2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427, (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88, (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120, (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97, (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105, (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13, (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11, (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112, (17), 2677-2685 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics