זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בידול מסוף שרירי שלד מתחיל עם המחויבות של תאי מבשר mesodermal פלוריפוטנטיים כדי myoblasts. תאים אלה עדיין את היכולת להתרבות או שהם יכולים להבדיל הפתיל לתוך myotubes multinucleated, אשר לְהַבשִׁיל נוספת ליצירת myofibers. בידול מסוף שריר השלד בניצוחו של פעולה מתואמת של גורמי שעתוק שונים, בפרט חברי גורמים רגולטוריים שרירים או MRFs (Myod, Myogenin, Myf5, ו MRF4), המכונה גם משפחת גורמי שעתוק bHLH myogenic. גורמים אלה לשתף פעולה עם מתחמי שיפוץ-הכרומטין בתוך רשת רגולצית תעתיק משוכללת להשיג myogenesis שלד. לפי גישה זו, Myod נחשבת גורם שעתוק מאסטר myogenic המעוררים בידול מסוף שריר. רעיון זה מתחזק לנוכח היכולת של Myod להמיר תאים שאינם שרירים לתאי שריר שלד. כאן אנו מתארים גישה המשמשת לזיהוי Myodשותפי חלבון באופן ממצה על מנת להבהיר את הגורמים השונים המעורבים בידול מסוף שרירי שלד. המטרה לטווח הארוכה היא להבין את המנגנונים אפיגנטיים מעורבים בויסות גני שרירי שלד, כלומר., מטרות Myod. שותפי Myod מזוהים באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) ממערכת Heterologous מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון, ואחריו אימות של תפקיד שותפים רלוונטיים במהלך בידול מסוף שרירי שלד. צורות Aberrant גורם myogenic, או התקנה הסוטה שלהם, קשורות עם מספר הפרעות שריר: מיאסטניה מולד, ניוון myotonic, ראדומיוסרקומה וליקויי התחדשות שריר. ככזה, גורמי myogenic לספק מאגר של מטרות טיפוליות פוטנציאליות בהפרעות שריר, הוא לעניין המכאניזם שיוצר מחלה עוצמה, מנגנון שיקום שיכול לשפר את הטיפול במחלה. לפיכך, להבין." המפורטדינג של האינטראקציות מולקולאריים ואת התוכניות הגנטיות בשליטת גורמי myogenic חיוני תכנון רציונל של טיפולים יעילים.

Introduction

אורגניזמים רבים תאי איקריוטיים מורכבים של איברים ורקמות שונים. לכל רקמה תפקודית ביטוי דפוס גן ספציפי, אשר נקבע בכל שלב התמיינות. התמיינות תאים כרוכה הפעלה של גנים ספציפיים, תחזוקת הביטוי שלהם, בדרך כלל, השתקה של סט של גנים כאלה המעורבים התפשטות תאים. בידול שרירי השלד, או myogenesis, הוא אפוא תהליך רב שלבי, המתחיל קביעת תאי גזע mesodermal לתוך myoblasts, ולאחר מכן מוביל בידול הטרמינל של myoblasts אלה לתוך מונו בעלי הגרעין הראשון, ולאחר מכן רב-גרעיני, myotubes . לפיכך, myoblasts הוא "נקבע" תאים, כי הם עדיין מסוגלים להתרבות, אבל הם מחויבים שושלת שרירי השלד, ובכך יכולים להבחין אך ורק לתאי שריר שלד גם במהלך התפתחות עוברית או התחדשות שריר מבוגרת. תהליך מסוף שרירי שלד שונהentiation הוא מתוזמר על ידי תוכנה גנטית מיוחדת שמתחילה ביציאת צמיתת מחזור התא של תאי מבשר myoblast שמוביל השתקה מוחלטת של גנים הקשורים התפשטות, כגון גני מטרת E2F 1. ואכן, במהלך התהליך של בידול הטרמינל, מעצר התפשטות myoblast הוא צעד חיוני שמקדים את הביטוי של גנים ספציפיים שריר שלד ואת ההיתוך של myoblasts לתוך myotubes 2. תכנית כזו מאפשרת תאי גזע שריר בוגרים, המכונים גם תאי לווין, להבדיל במהלך תהליך ההתחדשות בעקבות פציעה בשרירי שלד.

Myogenesis יונקים תלויה באופן מכריע משפחה של לולאה בצורת סליל סליל בסיסית myogenic (bHLH) שעתוק גורמי Myod, Myf5, MRF4 ו Myogenin, מכונה לעתים קרובות כמו המשפחה של גורמים נחישות שרירי השלד או MRFs (גורמי תקינה שרירים) 3. כל אחד מהם ממלא תפקיד חיוני במפרט ו DIFferentiation של תאי שריר שלד ושיש לו דפוס ביטוי ספציפי 4 5-7. הפעלת Myf5 ו Myod מהווה את הצעד הקובע כי מתחייב לתאי שושלת myogenic, והביטוי הבא של Myogenin מפעיל myogenesis עם הפעלה של גנים ספציפיים שריר שלד, כגון MCK (שרירים קריאטין קינאז). גורמי שעתוק bHLH myogenic פעולה עם בני משפחת MEF2 בהפעלת גנים שריר מ לוקוסים שותק בעבר 8. הם גם מגרים שעתוק הגנים שרירי השלד כמו heterodimers עם חלבונים bHLH בכל מקום, E12 ו E47, המכונה חלבונים E, המחייבים כביכול E-תיבות 8 גנים רגולטוריים שונים אזורים. טוויסט, זיהוי (מעכב של בידול) וגורמים נוספים שלילי לווסת את התהליך הזה, על ידי מתחרה עם Myod עבור חלבוני E מחייבים 8.

Myod נחשב לשחקן המרכזי מפעילת בידול מסוף שרירים 9 10-13. אכן, ביטוי כפוי של Myod ומשרה את בידול טרנס מסוגים סלולריים שונים גם אלה נגזרו אחר ממוצא embryologic 12. לדוגמה, Myod יכול להמיר hepatocytes, פיברובלסטים, מלנוציטים, neuroblasts, ו adipocytes לתאים דמויי שריר. הפעולה חוצה בהתפלגותו של Myod כרוכה הפעלה תקינה של התכנית הגנטית myogenic (גני המטרה שלה בעיקר) בסביבה לא-שרירי, במקביל כדי השתקת התכנית הגנטית המקורית (בעיקר, גני התפשטות).

בשנת מתרבים myoblasts, Myod מתבטאת אך אינו מסוגל להפעיל גנים היעד שלה גם כאשר הוא נקשר היזמים שלהם 14-16. לכן, הדרישה Myod להתבטא ברציפות myoblasts מובחן נשאר elu למדיsive. Myod יכול להדחיק גני ליעדו בשל הגיוס של אנזימי שינוי-הכרומטין דיכוי ב מתרבה myoblasts לפני הטעינה של הפעלת שיפוץ הכרומטין אנזימי 14,17. לדוגמה, ב מתרבים myoblasts, Myod קשורה תעתיק שיתוף מדכא KAP-1, deacetylases היסטון (HDACs) ו methyltransferases ליזין הדיכוי (KMTs), כולל היסטון H3 ליזין 9 או H3K9 ו H3K27 KMTs, פעיל לדכא ביטוי גנים היעד שלה על ידי הקמת 14,17 מבנה הכרומטין מקומית דיכוי. חשוב לציין כי הדו"ח האחרון עולה כי Myod הוא עצמו מפוגל ישירות על ידי H3K9 KMT G9a וכתוצאה מכך עיכוב של transactivating שלה פעילות 16.

המנגנונים אפיגנטיים המעורבים טרנס-הבחנה זו של תאים שאינם שריר ידי Myod הם ידועים ברובם. יש לציין, שורות תאים בעלי עמידות בידול טרנס-induced Myod. לכן, תאי הלה, Myod הוא גם פעיל אואפילו יכול לתפקד כמו מדכא ולא activator של שעתוק בשל חוסר ביטוי של למקטע BAF60C של הכרומטין שיפוץ המורכב SWI / SNF 18. מודל זה ולכן יכול להיות בחירה לאפיין את המנגנונים טובים יותר של דיכוי גני מושרה Myod. זה מתאים גם כדי assay את היכולת של Myod לגרום סביבת הכרומטין דיכוי בבית לוקוסי היעד שלה עם השותפים הקשורים אליו ולכן לחשוף את מנגנוני הדיכוי תלוי Myod ב מתרבה myoblasts מכוונן בידול סופנית.

כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי שותפי Myod באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון. השימוש בתאי הלה-S3 להביע ביציבות הדגל-HA-Myod רשאי לקבל מספיק חומר כדי לטהר את מתחמי Myod מתמציות גרעיניות מופרדות. זיהוי שותפי Myod במערכת Heterologous לווה validatiעל במערכת רלוונטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הלה-S3 גרעיני מלח-שניתן להפיק ושברי הכרומטין הנכנס

  1. אוסף של תאים
    1. לגדול הלה-S3 דגל-HA-Myod והלה-S3 דגל-HA (קו תאים בלתי מבוקרת) ב בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% נסיוב עגל עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (צמיחה בינוני) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולח.
      הערה: תאים הלה-S3 להביע ביציבות תאי הדגל-HA-Myod והלה-S3 transduced עם וקטור הריק (הלה-S3 הדגל-HA) יכולים להיות גם הוקמו באמצעות הפרוטוקול מתואר: 19,20, או שנמסרו על ידי המחברים.
    2. להגביר תאים עד 10 150 מנות מ"מ ומחוברות מלאות של כל שורת תא (תאים הלה-S3 הדגל-HA-Myod והלה-S3 הדגל-HA).
    3. אסוף את supernatant (מכיל תת-אוכלוסייה לא חסיד) לתוך הצנטריפוגה L 5.
    4. שטוף את תת-האוכלוסייה החסידה עם 10 מיליליטר של PBS לכל צלחת 150 מ"מ, trypsinize תאי דקות 1 ב TEM בחדרperature (פתרון 0.05% טריפסין- EDTA, 2 מ"ל למנה 15 ס"מ).
    5. הוסף 4 מ"ל של המדיום לכל צלחת 150 מ"מ לאסוף את התאים לתוך צינורות 50 מ"ל.
    6. מערבבים את supernatant משלב 1.1.3 (ב טווה 5 L) והתאים משלב 1.1.5, להוסיף 500 מ"ל של מדיום הגידול מראש התחמם טריים עבור כל קו התא.
    7. להעביר את ההשעיה התא לתוך 5 טווה L ולגדול תאים עבור 60 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולח.
    8. הוסף 500 מיליליטר של מדיום גידול טרי לגדל תאים למשך 24 שעות.
    9. להוסיף 1 ליטר של מדיום גידול טרי לגדל תאים למשך 24 שעות.
    10. להוציא 1 מ"ל של השעיה התא לספור את התאים ולבדוק כדאיות התא. צבע 30 μl של ההשעיה תא עם 30 μl של 0.4% trypan כחול לספור בחיים (לא כחול) התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
    11. שמור את צפיפות התאים של 2 - 6 x 10 5 תאים / מ"ל ידי הוספת בינוני צמיחה טריים מדי יום; לא יעלה על 1 x 10 6 תאים / מ"ל. המקסימוםנפח עבור טווה אחד 5 L הוא 2.5 ל '
      הערה: השלבים הבאים, המשך על-ידי קבוצות של 2 - 2.5 ליטר של תרבות בצפיפות 1 x 10 6 תאים / מ"ל. חזור על שלבים 1.1.12 - 1.1.14 לאסוף כ 20 L (≈ 20 גרם של גלולה יבשה) של כל קו תא לפני שתמשיך לשלב הבא.
    12. תאים גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
    13. תאים Resuspend ב 100 מ"ל של קר כקרח PBS על ידי pipetting ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את הכדור.
    14. חזור על לשטוף על ידי resuspending את התאים עם 25 מ"ל של PBS קר כקרח, העברת ההשעיה לתוך צינור 50 מ"ל ו צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
      הערה: כדורי תא ניתן גם להשתמש מיד או קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.
  2. בידוד של הגרעינים
    הערה: בצע שלבים 1.2.1 - 1.4.3 בחדר הקר.
    1. buffe טרום צמרמורתrs ו homogenizers.
    2. אם באמצעות חומר קפוא, במהירות להפשיר את כדורי תא באמבט מים ב 37 ° C.
    3. Resuspend 20 גרם (≈ 20 מ"ל) של תאים 20 מ"ל (נפח שווה לגודל של התא גלולה) של חיץ hypotonic (לוח 3) באמצעות 10 מ"ל של חיץ בהתחלה, ולאחר מכן הוספת 5 מ"ל, ואז הוספת עוד 5 מ"ל. שטוף את טפטפות היטב עם חיץ טרי כדי לקבל את המקסימום של תאים.
    4. העברת 40 מיליליטר השעית תא לתוך homogenizer מראש צונן עם עלי צמוד.
    5. Homogenize תאים עם 20 משיכות בתוך homogenizer (20 פנימה והחוצה בתנועות) ולהעביר ההשעיה התא לתוך צינור 50 מ"ל.
    6. שטפו את homogenizer עם 7 מ"ל של חיץ סוכרוז (1/3 מנפח התא הראשוני, טבלה 3) כדי לשחזר את המקסימום של תאים. עבר השעיה זו במהירות לתוך צינור 50 מיליליטר משלב 1.2.5 לשמר את הגרעינים ולהגביל את הזליגה.
    7. להכתים aliquot 30 μl עם 30 μl של 0.4% TRypan כחול, לנתח תחת מיקרוסקופ כדי לשלוט יעילות תמוגה (אם תמוגה הוא מוצלח, כל הגרעינים צריכים להיות כחולים). במידת הצורך, חזור על שלב המגון.
    8. צנטריפוגה במשך 7 דקות ב XG 10,000 ו -4 ° C עד גלולת הגרעינים. שמור את supernatant כמו חלק cytoplasmic.
  3. הכנה גרעינית מלח-שניתן להפיק (SE) שבר
    1. Resuspend גלולה גרעינים ב 8 מ"ל של חיץ סוכרוז (נפח שווה לגודל של גלולה גרעינים). הוסף טיפה אחר טיפה תוך ערבוב ביסודיות על מערבולת 8 מ"ל של חיץ מלח גבוהה (נפח גלולה 1 גרעינים, טבלה 3) כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מ"מ NaCl. דגירה במשך 30 דקות על הקרח ומערבבים כל 5 דקות.
    2. הקטנת ריכוז NaCl 150 מ"מ על ידי הוספת 8 מ"ל (1/3 הנפח הכולל) של חיץ סוכרוז. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. אסוף את supernatant (חלק מלח-שניתן להפיק גרעיני, SE).
      הערה: או המשך לשלב 1.3.3 או לעזוב את SEחלק על הקרח במהלך הכנת חלק הנכנס הכרומטין ואז אולטרה צנטריפוגה שני שברים זמנית.
    3. SE Ultra-צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 85,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קח supernatant (≈ 26 מ"ל).
    4. להקפיא 100 aliquot μl בחנקן נוזלי. עבור לשלב 2 "טיהור מורכבת חלבון", באמצעות שאר לחלץ.
      הערה: aliquot היא לשמש פקד קלט במהלך שלב 5.1.1.
  4. הכנת שבר נכנס הכרומטין
    1. Resuspend גלולה (משלב 1.3.5). בקפדנות 7 מ"ל (נפח שווה לגודל של גלולה) של חיץ סוכרוז.
    2. להוסיף CaCl 2 לריכוז סופי של 1 מ"מ (28 μl של 0.5 מ 'CaCl 2 במשך 14 מ"ל של השעיה) כדי להפעיל MNase (שלב 1.4.4) ומערבבים.
    3. השעיה טרום חום 1 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף 70 μl nuclease micrococcal (MNase) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.0025 U / μl (1/200 דילול מ 0.5U / μl המלאי) ומערבבים.
    5. דגירה בדיוק 12 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבבים כל 4 דקות.
    6. מיד למקום את התגובה על הקרח.
    7. כדי להפסיק פעילות MNase, להוסיף 112 μl של 0.5 M EDTA pH 8.0 (1/125 דילול) לריכוז סופי של 4 מ"מ. דגירה במשך 5 דקות על קרח.
    8. Sonicate 5 פעמים 1 דקות ב משרעת גבוהה, בין שני sonications לאפשר הפסקה של 1 דק '(10 דק' בסך הכל).
    9. Ultracentrifuge למשך 30 דקות ב 85,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
    10. אסוף את supernatant (חלק מועשר הנוקלאוזום, NE, ≈ 12 מ"ל).
    11. להקפיא 50 aliquot μl בחנקן נוזלי. עבור לשלב 2 "טיהור מורכבת חלבון", באמצעות שאר לחלץ.
      הערה: aliquot היא לשמש פקד קלט במהלך שלב 5.1.1.

2. חלבון טיהור מכלולים

הערה: המשך תמציות במקביל מכל שורת תאים (הלה-S3 דגל-HA-Myod ואת השליטה, הלא-S3 דגל-HA).

  1. טיהור מבוססת Flag-
    1. שרף דגל טרום לשטוף. השתמש 600 μl של דגל שרף (הממלאים המסחריים 50%) עבור כל נקודה ניסיון (SE ו NE שברים עבור כל קו תא).
    2. העברת שרף לתוך 15 מ"ל צינור, resuspend ב 13 מ"ל של קר TEGN (לוח 3), צנטריפוגות במשך 2 דקות XG ב 1000 ולהסיר supernatant. חזור 5 פעמים. אחרי שרף דגל האחרון לשטוף גלולה לתוך נפח שווה של TEGN (300 μl לכל נקודת ניסיוני).
    3. עבור כל נקודה ניסיוני, לערבב 600 μl של שרף דגל שטף תמציות חלבון המתאים (בתוך שפופרת 15 מ"ל עבור NE 12 מ"ל ו בתוך שפופרת 50 מ"ל במשך 26 מ"ל SE שברים, בהתאמה). דגירה על לילה גלגל מסתובב ב 4 ° C..
    4. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C, לשים בצד את supernatant ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד תוצאת מבחן יעילות הטיהור (2.2).
    5. עבור דגימות SE, resuspend שרף דגלב 4 מ"ל של TEGN ולהעביר שפופרת 15 מ"ל. חזור על פעולה זו 3 פעמים, כל פעם מעבירה אל שפופרת 15 מ"ל אותו כדי למנוע אובדן חרוזים. צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C ולהסיר supernatant.
    6. דגל לשטוף שרף 7 פעמים בתוך שפופרת 15 מ"ל באמצעות 13 מ"ל של TEGN ו צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C.
    7. לאחר לשטוף האחרון, resuspend ב 1 מיליליטר TEGN והעביר לתוך צינור 1.5 מיליליטר נמוך מחייב. צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    8. Resuspend ב 200 μl של פתרון פפטיד דגל ב 4 מ"ג / מיליליטר ב- pH 7.8 עבור כל נקודה ניסיון. מערבבים את החרוזים פפטיד. הוסף 200 μl של חיץ TEGN דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה, כדי elute חלבונים כבולים.
    9. צנטריפוגות במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C ולהעביר את שרף supernatant (eluate Flag) לעמודה ספין ריק להציב צינור 2 מ"ל.
    10. צנטריפוגה העמודה, לאסוף שמאל-על supernatant בצינור 2 מ"ל. אסוף שרף הדגל ידי הוספת חיץ TEGN לעמודה ומשך elution הדגל השני עם 200 μl של פתרון פפטיד הדגל (4 מ"ג / מיליליטר) הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך כל נקודה ניסיון.
    11. חזור על שלבים 2.1.9 - 2.1.10 לאסוף elution השני. שלב eluates הראשון והשני.
  2. מבחן של יעילות הטיהור
    הערה: במהלך שלב 2.1.11 - 2.1.12, לבצע SDS-PAGE ו מכתים כסף (2.2.1 - 2.2.2).
    1. קח 15 μl של eluates, להוסיף 5 μl של חיץ טעינת 4x ו -2 μl של 10x סוכן צמצום, להרתיח במשך 5 דקות ב 96 ° C ולהפעיל SDS-polyacrylamide 4 - ג'ל 12% על פי הוראות היצרן.
    2. כתם ג'ל באמצעות ערכת צביעת כסף (בהתאם להוראות היצרן). אם יש הבדלים ברורים בדפוסי חלבון בין דגל-HA-Myod ודגל-HA eluates מדומה, בפרט הלהקה של דגל-HA Myod (סביב 50 kDa, איור 1 א), המשך STE הבאp.
  3. Hemagglutinin (HA) טיהור מבוססת
    1. שרף לשטוף HA על ידי העברת לתוך 15 צינור מ"ל, resuspending ב 13 מ"ל של TEGN ו צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C.. צעד חוזר כביסה 5 פעמים. לאחר לשטוף האחרון חרוזים resuspend בנפח שווה של חיץ TEGN.
      הערה: הנפח חייב להיות מותאם על פי היעילות של טיהור הדגל מבוססת. התחל עם 300 μl ממלאי 50% המסחריים עבור כל נקודה ניסיון.
    2. עבר שרף HA עבור כל נקודה ניסיון לתוך צינור מחייב נמוך 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C, לחסל את המקסימום של החיץ לשטוף (לוח 3) ומוסיפות את eluates מן הטיהור מבוססת דגל שרף HA.
    3. דגירת צינורות על לילה הגלגל מסתובב ב 4 ° C..
    4. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C, לשים בצד את supernatant ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד תוצאת מבחן יעילות הטיהור (2.3.12.).
    5. מִחָדָשׁלהשעות את שרף HA ב 0.5 מ"ל של TEGN, להעביר לשפל חדש מחייב 1.5 מ"ל צינור. חזור resuspension פעם הוספת אל הצינור 1.5 מ"ל אותו כדי למנוע אובדן חרוזים דקות צנטריפוגות 2 XG ב 1000 ו 4 ° C. הסר supernatant.
    6. לשטוף חרוזים 8 פעמים באמצעות 1 מ"ל של TEGN בכל פעם, צנטריפוגה 2 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C והסרת supernatant (להימנע חרוזים לאבד). לאחר לשטוף האחרון, להעביר את החרוזים לתוך צינורות 0.5 מ"ל.
    7. להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. הוספת 100 μl של פתרון פפטיד בחינם HA (4 מ"ג / מ"ל) ב- pH 7.8 על חרוזים elute החלבונים כבול. דגירה על הגלגל מסתובב במשך הלילה ב 4 ° C..
      הערה: הכמות-פפטיד HA צריכה להיות מותאמת תלוי השפע של המתחמים.
    8. צנטריפוגות במשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C ולהעביר את שרף supernatant (eluate HA) לעמודה ספין ריק להציב צינור 2 מ"ל.
    9. צנטריפוגה העמודה לאסוף שמאל-על supernatant בצינור 2 מ"ל. בצע elution שנייה עם 100 μl של פפטיד HA (4 מ"ג / מיליליטר) עבור כל נקודה ניסיון. דגירה על הגלגל מסתובב במשך הלילה ב 4 ° C.. חזור על שלב 2.3.8 - 2.3.9 לאסוף elution השני.
    10. שלב eluates הראשון והשני.
    11. יעילות הבדיקה טיהור על ידי SDS-PAGE ו מכתים כסף (ראה צעדים 2.2.) (איור 1 א).
    12. לרכז את eluate HA 30 μl באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם (מגבלת משקל מולקולרי נומינלית, NMWL) 10 kDa חתוכים על פי הוראות היצרן.
    13. מחלק את הדגימות המרוכזות לשני חלקים: 22.5 (3/4) ו -7.5 (1/4) μl. הצמד להקפיא 1/4 של דגימות בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. השתמש 3/4 חלק לעבור לשלב 3.
      הערה: החלק הקפוא 1/4 הוא לשמש לאישור של תוצאות ספקטרומטריית מסה על ידי כתם מערבי (ראה שלב 5.1).

3. ניתוח ספקטרומטריית מסה

הערה: השלבים הבאים יש לדון עם מתקן ספקטרומטריית מסה כי יבצע את הניתוח.

  1. מוסף 3/4 (22.5 μl) של דגימות עם 7.5 μl של חיץ טעינת 4x ו -3.3 μl של 10x סוכן הפחתת ומרתיחים במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
  2. דגימות טען על SDS-polyacrylamide 4 - ג'ל 12%. ג'ל לרוץ 150 V קבוע במשך 5 דקות כדי לאפשר לכל החלבונים להיכנס ג'ל ללא הפרדה.
  3. שטפו את הג'ל עם מים; לתקן במשך 20 - 30 דקות עם פתרון מקבע (חומצה אצטית 10%, 50% מתנול, 40% מים אולטרה נקיים) ולאחר מכן לשטוף את הג'ל 5 פעמים הקבועות במים אולטרה-נקיים.
  4. חותכים את רצועות המכילים חלבונים, חנות 1 מ"ל של מים בצינור 1.5 מ"ל ולשלוח למתקן ספקטרומטריית מסה.

ניתוח 4. נתונים

הערה: זוהי הנחיה כללית לניתוח. השלבים המדויקים יהיו תלויים במצב המסוים של הנתונים שנמסרו על ידי מתקן MSהמשמש לביצוע הניתוח (למשל, 21,22).

  1. השווה את הרשימה של החלבונים שזוהו "Myod" eluates עם הרשימה המתקבלת מקבילים כן בקרה שלילית. אל תכלול מניתוח החלבונים נמצאו בשתי הרשימות.
  2. סור חלבונים בעלי ≤2 מספר כולל של פפטידים מזוהה מרשימה נותרת.
  3. ביאור גישה תפקודי וסיווג תפקודי של הרשימה של חלבונים שהושגה באמצעות DAVID ביואינפורמטיקה משאבים (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) ולסווג את הרשימה של החלבונים 23,24.
  4. (אופציונאלי) הסרת מהרשימה "טרמפיסטים", טעונה חלבונים שאינם גרעיניים עם בכריכה adventitious חזק טעונים שלילית 25 DNA. אלה מכילים חלבוני cytoskeletal, cytoplasmic, המיטוכונדריה, קרום קולטן (קיפול חלבונים, חלבוני קבוצת נוגדנים ושונים בלוחות 1 ו -2). </ Li>
  5. השווה בין הרשימה שהושגה של interactors Myod מתוך שברי SE ו NE לזהות חלבונים נפוצים חלבונים ספציפיים עבור כל חלק (איור 2).

5. אישור של interactors מזוהה על ידי המערב כתם

  1. אישור ב הלה-S3 דגל-HA-Myod והלה-S3 דגל-HA
    1. דגימות eluate הפשרה המתקבל הצעד 2.3.14 (7.5 μl) על קרח. להוסיף 12 μl של חיץ TEGN, 10 μl של חיץ טעינת 4x ו -3 μl של 10x צמצום סוכן. מרתיחים דגימות במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו דגימות קלט עבור המערבי סופג.
      1. להפשיר aliquots ממדרגות 1.3.9 ו 1.4.11 ולמדוד ריכוז חלבון, למשל באמצעות ערכת BCA (אחרי הוראות היצרן).
      2. השתמש 15 מיקרוגרם של חלבון לכל נתיב. מדוד את הכמות המתאימה של תמצית ולהתאים את עוצמת הקול של המדגם עד 15 μl עם חיץ TEGN.
      3. הוסף חוצץ טעינת 4x 5 μl ו1.5 μl 10x צמצום סוכן. מרתיחים דגימות במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
    3. ביצוע ניתוח כתם מערבי עם נוגדני עניין (ספציפיים עבור מועמד שותף שזוהה במהלך ניתוח MS) באמצעות 15 μl של דגימות eluate. השתמש תמציות קלט כביקורת של רמות חלבון אנדוגני (איור 3 א).
  2. אישור במערכת הסלולרית הרלוונטית
    1. הכנת התמצית גרעינית הכוללת של myoblasts עכבר C2C12.
      1. לגדול myoblasts העכבר C2C12 במדיום DMEM בתוספת 15% נסיוב עגל עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל ו סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולח. אין לחרוג 80% תא מפגש לשמור תאי מדינת שגשוג.
      2. לגדול לפחות שני 150 מנות מ"מ של C2C12 עבור נקודה אחת (נוגדן אחד) של immunoprecipitation (IP). לשאוב את המדיום, לשטוף תאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS.
      3. גרדו את התאים ולאסוף לתוך צינור 15 מ"ל. לִספִירַת הַנוֹצרִיםntrifuge ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant מחק.
      4. לאמוד את היקף התא הגלול (= תא V). בעדינות resuspend גלולה בתא 3 כרכים V של B חיץ hypotonic לשבש הממברנה cytoplasmic (לוח 3).
      5. להוסיף נפח תא V 0.44 x 10% NP-40 כדי להגיע לריכוז סופי של 1% (v / v). בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב.
      6. להוסיף נפח תא V 0.89 x של SR (לוח 3) כדי לשמור על שלמות הגרעינים. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי homogenize ההשעיה, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 2,000 XG כדי גלולה גרעינים.
      7. הסר את supernatant (חלק cytosolic). לאמוד את ההיקף גלול גרעינים (= nuc V). גלולת גרעינים גלולה ב nuc V נפח אחד של חיץ סוכרוז.
      8. הוסף טיפה אחר טיפה תוך ערבוב ביסודיות על nuc V נפח מערבולת אחד חיץ מלח גבוהה כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מ"מNaCl, דגירה במשך 30 דקות על הקרח. מערבבים כל 5 דקות.
      9. להוסיף nuc V נפח אחד של חיץ סוכרוז (כדי להקטין ריכוז NaCl 150 מ"מ) ו CaCl 2 (הריכוז הסופי 1 מ"מ). לְעַרְבֵּב.
      10. השעיה טרום חום 1 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף nuclease micrococcal להגיע סופי של ריכוז 0.0025 U / μl (1/200 ממלאים של 0.5 U / μl). לְעַרְבֵּב.
      11. דגירה בדיוק 12 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מערבבים כל 3 דקות.
      12. מייד למקום תגובה על קרח ולהוסיף EDTA (ריכוז סופי 4 מ"מ) כדי להפסיק פעילות MNase. דגירה במשך 5 דקות על קרח.
      13. Sonicate 5 פעמים עבור 0.5 דקות כל אחד ב משרעת גבוהה. בין שני sonications, לאפשר הפסקה של 0.5 דקות (5 דקות בסך הכל).
      14. Ultra-צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 85,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. אסוף את supernatant (תמצית גרעינית כוללת).
      15. מדוד ריכוז חלבון של תמצית הכולל הגרעינית, למשל באמצעות ערכת BCA (אחרי הוראות יצרן) והמשך immediatאיליי לשלב 5.2.2.
    2. Immunoprecipitation (IP) של Myod אנדוגני.
      1. טרום ברור תמציות, לשטוף 10 μl של חרוזים agarose חלבון G עבור כל נקודה IP.
        1. מעבירים את נפח הדרושים של חרוזים agarose חלבון G לתוך צינור 1.5 מ"ל, resuspend ב 1.4 מ"ל של TEGN קר, צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1,800 XG ולהסיר supernatant. חזור 3 פעמים.
      2. מערבבי חרוזי agarose G החלבון מראש שטף עם הנפח המתאים של תמצית גרעינית הכולל. השתמש 500 מיקרוגרם של חלבון תמצית הכולל גרעינית לכל נקודת IP.
      3. לדגור על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות מראש לנקות את התמציות.
      4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1800 XG ב 4 מעלות צלזיוס. שמור supernatant.
      5. מערבבי 5 מיקרוגרם של Myod Ab או 5 מיקרוגרם של IgG ארנב עם 500 מיקרוגרם תמציות גרעיניות הכוללות מראש פינה ב 1.5 מיליליטר צינורות מחייב נמוכים. להוסיף TEGN חיץ עד 1 מ"ל. לדגור על גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
        הערה: בצע את following צעדים במהלך שלב 5.2.2.3.
      6. חלבון טרום לשטוף 7.5 μl / G פתרון חרוזי מניות לכל נקודת IP.
        1. מעבירים את נפח הדרושים של חרוזים לתוך צינור 1.5 מ"ל, חרוזים resuspend ב 1 מ"ל של TEGN צנטריפוגות ב 1,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הסר את supernatant. חזור 3 פעמים.
      7. חרוזי חלבון Resuspend / G ב 1.5 מיליליטר חסימת פתרון (לוח 3) לדגור על גלגל מסתובב הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      8. תמציות גרעיניות הכוללות צנטריפוגה מודגרות עם ABS (שלב 5.2.2.5) ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. שמור supernatant.
      9. צנטריפוגה חסמה חלבון A / G שרף (שלב 5.2.2.7) 1,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של חיץ TEGN. Re-צנטריפוגות ב 1,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את חסימת חיץ.
      10. Resuspend חסמו חלבון / G שרף ב 1 מ"ל של TEGN חיץ aliquot לתוך צינורות-חלבון מחייב לשפל חדש להשיג 7.5 blo μlחלבון A / G שרף cked לכל נקודה IP. צנטריפוגה ב 1,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולהסיר ככל האפשר של supernatant.
      11. מוסיף את התמציות הגרעיניות הכוללות מודגרות עם שרירי הבטן (או לשלוט IgG) שרף A / G. מערבבים דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר (RT) על גלגל מסתובב.
      12. צנטריפוגה ההשעיה 1,800 XG ב RT במשך 2 דקות. בטל supernatant, resuspend ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף ההשעיה העברת לתוך צינורות מחייב לשפל חדש. לדגור על RT על גלגל מסתובב במשך 5 דקות.
      13. צנטריפוגה ההשעיה על 1,800 XG ב RT במשך 2 דקות, resuspend ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף דגירה ב RT על גלגל מסתובב במשך 5 דקות. חזור 4 פעמים. להעברת לשטוף האחרונה לצינור מחייב לשפל חדש.
      14. סר מרבי של supernatant. להוסיף 7 μl של חיץ לשטוף, 7 μl של חיץ טעינת 4x ו -3 μl של 10x צמצום סוכן על חרוזים, לערבב ומרתיחים במשך 5 דקות ב 96 מעלות צלזיוס.
      15. ביצוע ניתוח כתם מערבי עם נוגדנים של interest (ספציפי עבור מועמד שותף עבור החיסון זרז חלבון). השתמש 1% (5 מיקרוגרם) של תמציות קלט כביקורת של רמות חלבון אנדוגני (איור 3 ב).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להבין את הסדרת פעילות Myod, ניטלנו האפיון הממצה של מתחמי Myod באמצעות טיהור ביוכימיים, מבוסס על immunopurification של צורה מתויגת כפולה של Myod ואחריו ספקטרומטריית מסה (MS). השימוש קו תא הלה-S3 להביע Myod דגל-HA-tagged וקו תאים בלתי מבוקרת להביע היתרי דגל-HA להשיג מספיק חומר כדי לטהר את מורכבות Myod ידי ביצוע טיהור פעמיים זיקה של דגל-HA-Myod.

אנחנו מופרדים תמציות התא לשבריריים ציטופלסמית וגרעיני, אז עוד מופרדי השבר הגרעיני חילוץ מלח (מלח-שניתן להפיק גרעיני, SE) והעשיר עבור נוקלאוזום (מועשר הנוקלאוזום, NE) שברים. טיהור TAP-Tag מתוך שברים גרעיניים המופרדים אלה (איור 1, לוחות 1 ו -2) מותר נפרמי שותפים שיש יחסית נמוך abundance כאשר נקודות תא subnuclear ספציפי אחד. יתר על כן, אסטרטגיה כזו נוצלה לחשוף שותפים של מאוגד (SE) לעומת הנכנס DNA (NE) Myod לקבל תובנות על ויסות פעילות Myod.

עבור טיהור TAP-Tag, מערכת epitope טנדם דגל-HA היה בשימוש. הדגל הידרופילי קטן אפיטופים HA להיות התערבות מינימלית עם תפקוד החלבון והם נגישים מאוד לאינטראקציה נוגדן-אנטיגן. Anti-Flag immunopurification הרציף אנטי-HA מבוסס השרף בוצע, ואחריו elution של מתחמי immunopurified באמצעות פפטידים דגל HA. חלבוני eluted היו אז לרוץ על עמוד-SDS לאפשר לכל החלבונים להיכנס ג'ל. פיסות ג'ל המכילות את כל החלבונים המטוהרים קוצצו; החלבונים חולצו, טריפסין-מתעכל וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה (MS).

כפי שניתן לראות בתרשים 2, (איור 2 ו -3) 26-28. זה שופך אור על שותפי Myod הנכנס דנ"א וסת שיתוף אפשרי שיכול להקים סביבת דיכוי-הכרומטין. לדוגמה, חלבונים HP1, אשר זוהו כשותפים Myod ידי המתודולוגיה המתוארת, ידועים לאגד H3K9 מפוגל לשמור הדחקה הגן והמבנה heterochromatin. ואכן, HP1 מעכב פעילות תעתיק Myod וכתוצאה מכך ביטוי גן המטרה Myod לקוי והבחנה מסוף שרירים 26.

חלוקה נוספת שלמתחמי Myod SE ו NE על שיפוע גליצרול (כמתואר 29) חשפו את תת-מתחמי Myod בשני התאים subnuclear (איור 1B). בפרט, SE Myod מופץ בשלושה תתי-מתחמים, בעוד Myod הנכנס הכרומטין שייך בעיקר מורכב אחד.

חלק TAP-tag / MS חשף interactors אושרו על ידי כתם המערבי על מתחמי Myod. אלה כוללים את CBF גורם שעתוק, גאות, MTG8R ואת BAF47 למקטע SWI / SNF (SNF5) (איור 3 א, משמאל) וחלבונים HP1 (CBX1 ו CBX3) (איור 3 א, מימין). יודגש, כי בגלל תאים הלה אינם תאים שרירים אינם מבטאים Myod, יש צורך לאשר אינטראקציות בין interactors מזוהה החדש Myod ב myoblasts (איור 3 BD). יש לציין, עבור אימות כזה, התמציות הגרעיניות הכוללות (ללא הפרדה על SE ו NE) הן בדרך כלל מספיק, which מתיר הקטנת סכום של myoblasts משמש להכנת המדגם. מבחני האינטראקציה במבחנה כמו 26,27, עוזרים תוקף נוסף ממצאים אלה. לבסוף, המשמעויות התפקודיות של אינטראקציות אלה בתאי שריר להתייחס נוסף כמו 26-28.

יחדיו, הציג נתונים מראים בראיה גלובלית של שותפי Myod הביעו בכל מקום בגוף ולסלול את הדרך למחקרים תפקודיים נוסף מודל שריר רלוונטי יותר.

איור 1
איור 1: מכלולי Myod מבודדים על ידי טנדם זיקת טיהור (א) צביעת כסף של מתחמי eMyoD זיקה-מטוהרים הכפולים המבודדים מלח-שניתן להפיק גרעיני (SE) או מועשר הנוקלאוזום (NE) שברים גרעיניים של שורות תאים הלה-S3 ביציבות. דגל-HA-Myod (מורכבים Myod) הבעתקו תאים בלתי מבוקרים ד (מוק). MW, סמן משקל מולקולרי בדלתון קילו (KDA). החץ מצביע על דגל-HA-Myod (eMyoD). מחקר זה פורסם במקור ב -37. זכויות יוצרים האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. נתון זה יש הבדל בין 26: הנתיבים עם purifications המדומה eMyoD מורכב מבודדים שברים גרעיניים SE מוצגים כעת. זיקה-מטוהרים זוגיים (B) מתחמי eMyoD כמו ב (א) היו מופרדים על שיפוע גליצרול הנע בין 20% ל -41%. שברים נאספו באופן ידני, מרוכזים ונותחו על ידי כתם המערבי (WB) באמצעות נוגדנים אנטי-דגל. הערת הנוכחות של מספר eMyoD המכיל תת-מתחם-שניתן להפיק מלח גרעיני (SE) שבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 איור 2:. השוואה של הכרומטין הנכנס (הנוקלאוזום מועשר, NE) לעומת מסיסים גרעיני (מלח גרעיני שניתן להפיק, SE) Myod שותפים למעלה: דיאגרמת ון מראה חפיפה בין interactors eMyoD מבודד מלח-שניתן להפיק גרעיני (SE) ו הנוקלאוזום מועשר ( חלק NE). החלבונים ריבוזומלי, גורמי תרגום-ייזום, גורמי תיקון DNA ואת isoforms טובולין לא נכללו בניתוח כפי שהם נוכחים-ערכות נתונים שונות מתקבלות על ידי TAP ונחשבו הלא ספציפי תחתון:. Interactors Myod נמצא בשני SE ושברי NE (משותפים) או ספציפיים אחת של השברים (הייחודיים) חולקו בקבוצות מבוססות על הערות הפעילות שלהן. נוגדנים הקשורים וחלבונים שונים אחרים לא מתוארים. החלבונים הדגיש הם interactors Myod תוקף בין אם הלה ו / או myoblasts ידי שיתוף immunoprecipitation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. תיקוף קבוצה נבחרת של Myod interactors (א) אימות של interactors Myod, שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה, בתור תא הלה-S3 להביע ביציבות דגל-HA-Myod (eMyoD) פאנל שמאל:. ניתוח כתם המערבי של זיקה כפולה מתחמי Myod -purified מבודדים מלח-שניתן להפיק גרעיני (SE) או מועשר הנוקלאוזום (NE) שברים של קו תא הלה-S3 להביע קו eMyoD או תאים בלתי מבוקרים ביציבות (מוק) עם נוגדנים המצוינים. MW, סמן משקל מולקולרי פנל ימני:. ניתוח כתם המערבי של מתחמי Myod זיקה-מטוהרים כפולים מבודד שברי הנוקלאוזום מועשר גרעין של ים קו תא הלה-S3tably להביע שורת תאי eMyoD או שליטה (מוק) עם נוגדנים מצוינים. פאנל זה פורסם במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית. Yahi H, פריטש L, פיליפו O, Guasconi V, Souidi M, רובין P, A Polesskaya, Losson R, הראל-Bellan A, איט-סי-עלי ס J Biol Chem. 2008 29 Aug; 283 (35): 23,692-700. doi: 10.1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 2. יולי זכויות יוצרים האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. נתון זה יש הבדל בין 26: השיטור וגודל שונה והטקסט היה מסובב לאחד את התיוג בתוך הדמות. Myod היה מתויג בתור eMyoD כדי למנוע את הבלבול עם IP אנדוגני המוצגים לוחות אחרים. (BD) אימות של interactors Myod ב myoblasts העכבר C2C12. (ב) תמציות הכולל מגרעיני מתרבים myoblasts C2C12 שימשו immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים שהועלו כנגד BAF47 (SNF5) או Myod, או עם IgG שליטה. משקעים וכתוצאה מכך נותחו על ידי שנינות WBh הנוגדנים המצוינים. לנוגדנים מסוג anti-Myod יותר (אקספו ארוך.) ו (אקספו קצר.) קצר פעמי חשיפה מוצגות. תמציות קלט הועמסו להראות רמות חלבון אנדוגני. פאנל זה כבר פורסם ב 28 תחת רישיון Creative Commons (CC BY) רישיון (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). דמות זו שונתה מ -28: השיטור וגודל שונה והמבחן היה מסובב לאחד את התיוג בתוך הדמות. (C) תמציות הכוללות מגרעיני מתרבה myoblasts C2C12 שמשו immunoprecipitation עם נוגדנים שהועלו כנגד Myod, Suv39h1 (בקרה חיובית), או לשלוט IgG (שליטה שלילית). המשקעים וכתוצאה מכן היו נתוני WB עם נוגדנים המצוינים. פאנל זה פורסם במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית. Yahi H, פריטש L, פיליפו O, Guasconi V, Souidi M, רובין P, A Polesskaya, Losson R, הראל-Bellan A, איט-סי-עלי ס J Biol Chem. 2008 29 Aug; 283(35): 23,692-700. doi: 10.1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 2. יולי זכויות יוצרים האגודה האמריקאית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. נתון זה יש הבדל בין 26: השיטור וגודל שונה והטקסט היה מסובב לאחד את התיוג בתוך הדמות. (ד) תמציות הכוללות מגרעיני מתרבה (prolif.) ו C2C12 myoblasts ההבחנה (48 שעות, הצביעו כפי Diff.) שמשו immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים שהועלו כנגד Myod ו Myf5, או עם IgG ארנב רגיל עם חרוזים ריקים כמו בקרה שלילית. המשקעים וכתוצאה מכך נותחו על ידי WB עם נוגדנים המצוינים. תמציות קלט הועמסו להראות רמות חלבון אנדוגני. פאנל זה כבר פורסם ב 27 תחת רישיון Creative Commons (CC BY) רישיון (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). נתון זה יש הבדל בין 27: השיטור וגודל שונה והטקסט היה מסובב לאחד את התיוג בתוך figure. הפאנלים עם התוצאות שהתקבלו מתרבים ומבדל C2C12 מופרדים בשני בניגוד לצורה המקורית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1:. רשימה של חלבונים זוהו באמצעות ניתוח MS ב זוגי זיקה-מטוהרי eMyoD המכלולים המבודדים מן שבר מלח-שניתן להפיק גרעיני לאחר החיסור של חלבוני הרקע (חלבונים המזוהים על ידי MS ב eluates מקו תאים בלתי מבוקרים נחשבו הלא ספציפי רקע ה.) הנתונים מייצגים הסכום של ארבעה purifications העצמאי. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה 2: רשימת חלבונים ליdentified ידי ניתוח MS ב זוגי זיקה-מטוהרי eMyoD המכלולים המבודדים מן שבר מועשר הנוקלאוזום לאחר החיסור של חלבוני הרקע. הנתונים מייצגים הסכום של שלושה purifications העצמאי. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

לוח 3. הצפת קומפוזיציות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת מאפשרת זיהוי ממצה של שותפים של גורם שעתוק, Myod. הוא גילה שותפי Myod במערכת Heterologous עמידה בידול נגרם Myod, כלומר תאי הלה-S3. לפיכך, על פי הגדרתו, שותפי Myod מזוהים באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף. אלה כוללים גורמי שעתוק בכלל רצף ספציפי, אנזימי שינוי-הכרומטין, חלבוני עיבוד RNA, קינאזות (לוחות 1 ו -2). מאחר ותאי הלה-S3 עמידים בידול-trans-induced Myod, פעילות Myod היא בעיקר דכאניים השותפים המזוהים צפויים להיות-repressors שיתוף Myod. העניין הזה מודגש על ידי נוכחות של חלבונים עיד (לוחות 1 ו -2, איור 2), ידוע כמעכב transactivation Myod היכולת 8. חשוב לציין, מדינה מדכאת כזאת תואמת את מצב Myod ב מתרבים myoblasts. ואכן, אנו מאשרים כי אינטראקציות Myod עם CBFβ, Myodשותף שזוהו על ידי השיטה המתוארת, ניתן לאתר מתרבים myoblasts C2C12, אבל הולכים לאיבוד כאשר תאים שעברו התמיינות (ראה איור 3D). עם זאת, חשוב לציין כי אחת המגבלות העיקריות של המתודולוגיה המוצג הינו חוסר הזדהות שיתוף activators Myod. באופן עקבי, באמצעות אף שיטה זו של שיתוף activators Myod הידוע, כגון היסטון acetyltransferases 32 זוהו.

טיהור של מתחמי Myod גם מן השבר המסיס (המלח גרעיני שניתן להפיק, SE) של הגרעין או השבר מועשר הכרומטין (הנוקלאוזום המועשר, NE) (איור 1A) משמשת לפחות שתי פונקציות עיקריות. ראשית, חלוקה כזו מגדילה את בייצוג השותפים הלא stoichiometric זה יהיה רעול פנים אם טיהור Myod בצעה מתמציות גרעיניות הכוללת. שנית, זה מאפשר הפרדה בין שתי תת-אוכלוסיות תפקודיות של Myod: טרום שהופקד / evicטד (SE) ו נכנס הכרומטין (NE). בין interactors הספציפית Myod DNA-מאוגד, רבים קינאזות, גורמי שעתוק, סחר בבני אדם חלבונים, כמו גם כמה remodelers הכרומטין זוהה (איור 2). לאחר אימות מלאה, כגון רשת יכולה לספק תובנה המצב של ויסות פעילות של Myod מאוגד-DNA. חיפוש נוסף עבור Myod שלאחר translational שינויים בשני אלה תאים גרעיניים על ידי ספקטרומטריית מסה, יכול עוד לפענח רגולצית פעילות Myod. לבסוף, חלוקה של מתחמי Myod מסיסים וכרוך-הכרומטין על שיפוע גליצרול גילתה כי בעוד Myod נכנס הכרומטין הוא הכיל בעיקר במתחם אחד, מאוגד-DNA Myod מופץ בשלושה תתי-מתחמים (איור 1B). אפיון של תת-קומפלקסים אלה או על ידי MS ו / או כתם המערבי נגד מועמדים חלבון צריך להבהיר עוד יותר את מצב הרגולציה Myod.

כמו הדגיש לעיל, תאים הלה לא טבעי express Myod גורם שעתוק שריר. זה היה לפיכך חשוב לאשר את האינטראקציות נמצאות מודל שרירי שלד (איור 3). דיווחים רבים אשרו במודלים רלוונטיים אינטראקציות תפקודיות כגון בין Myod וחלק השותפים שזוהו assay TAP-התג שהוצג. זהו למשל המקרה של prohibitin 33, 34 DDX17, 35 Meis1, 27 CBF, HP1 26, ו SWI / SNF-הכרומטין שיפוץ 36,28,30 מורכבים.

שים לב כי ניתן לבצע טיהור TAP-תג כזה סכום נמוך של תאים, כגון מן myoblasts, בשילוב ל- MS רגיש. ואכן, נייר אחרון תאר אפיון שותפי Myod לאחר ביטוי מושרה של Myod הדגל-מתויג myoblasts 30. מאז ביטוי יתר Myod יציב ומתמשך myoblasts הוא מזיק, גישה חלופית תהיה הוספת תגי הדגל-HA לתוך אלל Myod אנדוגני (הים) ב myoblastsבאמצעות שיטות עריכת הגנום, כגון CRISPR-Cas9 31. יש לציין, תוספת של התג (הים) עלולה לשנות את תפקוד חלבון ו / או בשיתוף עם שותפים מחייבים, ולכן המקום של התג (N- או C- סופי) צריך להיבחר בזהירות. Assay תפקודית של חלבון ההיתוך במערכת רלוונטית חייבת להתבצע לפני סטפס תג טיהור כדי להבטיח את החלבון המתויג הוא פונקציונלי. Immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים ימנע בעיות אלה, עם זאת, היא מסתמכת על זמינותו של נוגדן זיקה ספציפית גבוהה, דבר שקורה לעתים רחוקות זמין.

עוד ערך מוסף של הגישה המתוארת הוא האפשרות לזהות שינויים שלאחר translational (PTMs) של החלבון המטוהר עוצמה ושל שותפיה בשפע. ובכך, עם תכונה זו טיהור TAP-התג מתאימה לזהות שותפי אינטראקציה חדשים לא רק אלא גם פונקציות האנזימטית חדשות הקשורים לחלבון ריבית ו / או שותפיה. בבמקרה של חלבון קושר הכרומטין (כלומר., גורמי שעתוק, אנזימים), שיטה זו ובכך מותאמת לצורך זיהוי של "קוד היסטונים" הקשור. ואכן, זנבות היסטון מסוף-אמינו, אשר נחשפים על פני השטח הנוקלאוזום, כפופים PTMs קוולנטיים מרובים. PTMs היסטון להעניק חתימה ייחודית נוקלאוזום מעורב. שילוב של שינויים שונים על זנבות היסטון-מסוף N ולכן יכול לשנות את מבנה הכרומטין לאפשר ויסות ביטוי גנים. לפיכך, אפיון שינויים כאלה הקשורים לחלבון נתון יכול לספק תובנות התפקידים ומנגנוני פעולה של החלבונים למדו מחייב הכרומטין 22.

לסיכום, המתודולוגיה הציג ניתן לזהות מקיף של שותפי Myod. טיהור TAP-התג מספקת אלטרנטיבה לגישות אחרות כגון ומורדות למשוך GST, שמרים מבחני השני היברידי ותצוגה הפאג. גם אם מסיבות מעשיות (production של כמות גדולה של תמציות גרעיני) אנחנו צריכים להשתמש במערכת התאית Heterologous, הצלחנו לאשר את מעורבותם של השותפים Myod מזוהים בידול שרירי השלד. הנתונים המתקבלים מראה כי הגורם myogenic Myod נראה אינטראקציה עם שפע של חלבונים החל הרגולטורים תעתיק לחלבונים RNA מחייב, דבר המצביע על מנגנונים שונים המסדירים את הפעילות של גורם שעתוק.

לסיכום, אותה הגישה המתודולוגית יכולה לשמש כדי לזהות שותפים הביעו בכל מקום בגוף גורמים גרעיניים רבים שיכולים להיות קשה ללמוד בהקשר הסלולר הספציפי שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23, (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24, (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8, (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11, (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8, (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6, (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40, (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185, (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132, (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47, (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25, (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22, (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31, (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20, (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37, (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8, (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5, (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9, (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29, (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10, (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117, (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11, (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27, (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316, (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics