Identifikation af MyoD Interactome Brug Tandem Affinity Rensning Koblet til massespektrometri

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Skeletal muscle terminal differentiering starter med engagement pluripotente mesodermale precursorceller til myoblaster. Disse celler har stadig evnen til at proliferere eller de kan differentiere og tændsatsen ind multinukleerede myotuber, som at modne yderligere til dannelse myofibre. Skeletal muscle terminal differentiering er orkestreret af en koordineret indsats af forskellige transkriptionsfaktorer, især medlemmerne af musklen regulatoriske faktorer eller MRFs (MyoD, myogenin, Myf5, og MRF4), også kaldet den myogene bHLH transkriptionsfaktorer familie. Disse faktorer samarbejder med kromatin-remodeling komplekser inden udførlige transkriptionel regulatorisk netværk for at opnå skeletal myogenese. I denne, er MyoD betragtes master myogene transkriptionsfaktor til at udløse muskel terminal differentiering. Dette begreb styrkes ved evnen af ​​MyoD at konvertere ikke-muskelceller i skeletmuskelceller. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der anvendes til at identificere MyoDprotein partnere i en udtømmende måde for at belyse de forskellige faktorer involveret i skeletmuskulaturen terminal differentiering. Det langsigtede mål er at forstå de epigenetiske mekanismer involveret i reguleringen af skeletmuskulaturen gener, dvs.., MyoD mål. MyoD partnere identificeres ved hjælp af Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) fra en heterolog system, der er koblet til massespektrometri (MS) karakterisering, efterfulgt af validering af den rolle, de relevante partnere i løbet af skeletmuskulatur terminal differentiering. Afvigende former for myogene faktorer eller deres afvigende regulering, er forbundet med en række muskellidelser: medfødt myasthenia, myotonic dystrofi, rabdomyosarkom og defekter i muskel regenerering. Som sådan myogene faktorer giver en pulje af potentielle terapeutiske mål i muskellidelser, både med hensyn til mekanismer, der forårsager sygdom i sig selv, og regenerative mekanismer, der kan forbedre sygdomsbehandling. Således den detaljerede understanding af de intermolekylære interaktioner og de genetiske programmer som kontrolleres af de myogene faktorer er afgørende for rationelt design af effektive terapier.

Introduction

Eukaryote flercellede organismer er sammensat af forskellige organer og væv. Alle de funktionelle væv har et specifikt gen mønster ekspression, som er bestemt ved hvert differentiering trin. Cellulær differentiering involverer aktivering af specifikke gener, vedligeholdelse af deres ekspression og generelt silencing af et sæt af gener, såsom dem, der er involveret i celleproliferation. Skeletmuskel differentiering eller myogenese, er således en multi-trins proces, der begynder med bestemmelsen af ​​mesodermale stamceller til myoblaster, og derefter fører til den terminal differentiering af disse myoblaster i første mono-nukleeret, og derefter multi-nukleeret, myotuber . Således myoblaster er "bestemt" celler, som stadig er i stand til at formere sig, men de er forpligtet til skeletmuskulaturen afstamning, og dermed kan differentiere udelukkende i skeletmuskelceller enten under fosterudviklingen eller i voksen muskel regenerering. Processen med skeletmuskulatur terminal afvigerentiering er organiseret af et specifikt genetisk program, der begynder med den permanente udgang fra cellecyklussen af myoblast precursorceller, der fører til en endelig silencing af spredning associerede gener, såsom E2F målgener 1. Faktisk under processen med terminal differentiering, myoblast proliferationsstandsning er et afgørende skridt, der går forud for ekspression af skeletmuskulaturen specifikke gener og fusionen af myoblaster i myorør 2. Et sådant program tillader voksne muskel stamceller, også kaldet satellitceller, at differentiere under regenereringsprocessen følgende skeletmuskulatur skade.

Pattedyr myogenese er kritisk afhængig af en familie af myogene grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transskription faktorer MyoD, Myf5, MRF4 og myogenin, ofte omtalt som familien af skelet muskler bestemmelse faktorer eller MRFs (Muskel regulatoriske faktorer) 3. Hver af dem spiller en væsentlig rolle med hensyn til specifikation og difrentiering af skeletmuskelceller og har et særligt udtryk M.4 5-7. Aktiveringen af ​​Myf5 og MyoD udgør den bestemmende trin, der forpligter celler til den myogene afstamning, og efterfølgende ekspression af myogenin udløser myogenese med aktivering af skeletmuskulaturen specifikke gener, såsom MCK (Muscle Creatine Kinase). Myogene bHLH transkriptionsfaktorer samarbejder med medlemmer af MEF2 familien i aktiveringen af muskel gener fra tidligere tavse loci 8. De stimulerer også skeletmuskulaturen gentranskription som heterodimerer med allestedsnærværende bHLH proteiner, E12 og E47, kendt som E proteiner, som binder såkaldte E-kasser i forskellige gen-regulatoriske regioner 8. Twist, Id (hæmmer af differentiering) og andre faktorer negativt regulerer denne proces, ved at konkurrere med MyoD til E-proteiner binder 8.

MyoD betragtes som den største aktør i at udløse muskel terminal differentiering 9 10-13. Faktisk tvunget udtryk for MyoD inducerer det transeuropæiske differentiering af forskellige cellulære typer selv dem, der stammer fra en anden embryologic oprindelse 12. For eksempel kan MyoD konvertere hepatocytter, fibroblaster, melanocytter, neuroblaster og adipocyter i muskel-lignende celler. Det transeuropæiske differentierende virkning af MyoD involverer en unormal aktivering af den myogene genetiske program (især dets målgener) i et ikke-muskulære miljø, samtidig med lyddæmpning af den oprindelige genetiske program (især, spredning gener).

I prolifererende myoblaster, er MyoD udtryk men er ikke i stand til at mobilisere de målgener, selv når den binder til deres promotorer 14-16. Derfor kravet om MyoD skal løbende udtrykt i udifferentierede myoblaster stadig temmelig elusive. MyoD kunne undertrykke sine målgener grund rekruttering af repressive kromatin-modificerende enzymer i prolifererende myoblaster før pålæsning af aktiverende kromatin remodeling enzymer 14,17. For eksempel i prolifererende myoblaster, er MyoD forbundet med transkriptionel co-repressor KAP-1, histondeacetylaser (HDAC) og repressive lysin methyltransferaser (KMTs), herunder histon H3 lysin 9 eller H3K9 og H3K27 KMTs, og aktivt undertrykke dets målgener ekspression ved at etablere en lokalt undertrykkende kromatinstruktur 14,17. Vigtigere er det, en nylig rapport viste, at MyoD er selv direkte methyleres af H3K9 KMT G9A resulterer i hæmning af dets transaktiverende aktivitet 16.

De epigenetiske mekanismer involveret i denne trans-differentiering af ikke-muskelceller efter MyoD er stort set ukendte. Især nogle cellelinjer er resistente over for MyoD-induceret trans-differentiering. Således i HeLa-celler, MyoD er enten inaktive ellerselv kan fungere som repressor snarere end aktivator af transkription på grund af manglende ekspression af BAF60C subunit af chromatin remodeling komplekse SWI / SNF 18. Denne model kan således være af valg der bedre karakterisere mekanismerne i MyoD-induceret genrepression. Det er også velegnet til at analysere evnen hos MyoD at inducere undertrykkende chromatinmiljø ved sin målloci med dens tilknyttede partnere og derfor afdække MyoD-afhængige repressive mekanismer i prolifererende myoblaster at finjustere terminal differentiering.

Her beskriver vi protokollen til identifikation af MyoD partnere ved at bruge Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) koblet til massespektrometri (MS) karakterisering. Anvendelsen af ​​HeLa-S3-celler, der stabilt udtrykker Flag-HA-MyoD tilladt at få nok materiale til at oprense MyoD komplekser fra fraktionerede kerneekstrakter. Identifikationen af ​​MyoD partnere i det heterologe system blev efterfulgt af validatipå i et relevant system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af HeLa-S3 Nuclear Salt-ekstraherbare og kromatin-bundne fraktioner

  1. Indsamling af cellerne
    1. Grow HeLa-S3 Flag-HA-MyoD og HeLa-S3 Flag-HA (kontrol-cellelinie) i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (vækst medium) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
      Bemærk: HeLa-S3-celler stabilt udtrykker Flag-HA-MyoD og HeLa-S3-celler transduceret med den tomme vektor (HeLa-S3 Flag-HA) kan enten etableres ved hjælp af protokollen beskrevet i: 19,20, eller leveres af forfatterne.
    2. Forstærk celler op til 10 fuldt sammenflydende 150 mm skåle af hver cellelinje (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD og HeLa-S3 Flag-HA-celler).
    3. Saml supernatanten (indeholder ikke-klæbende delpopulation) i 5 L spinner.
    4. Vask det vedhængende subpopulation med 10 ml PBS pr 150 mm skål, Trypsinisér cellerne i 1 min ved stue temperatur (0,05% trypsin-EDTA-opløsning, 2 ml til en 15 cm skål).
    5. Tilsæt 4 ml af mediet pr 150 mm skål og opsamle cellerne i 50 ml rør.
    6. Kombiner supernatanten fra trin 1.1.3 (i 5 liters spinner), og cellerne fra trin 1.1.5, tilsættes 500 ml frisk forvarmet vækstmedium for hver cellelinie.
    7. Overfør cellesuspensionen i 5 L spinner og vokse celler i mindst 60 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator.
    8. Der tilsættes 500 ml frisk vækstmedium og vokse celler i 24 timer.
    9. Tilsæt 1 liter frisk vækstmedium og vokse celler i 24 timer.
    10. Tag 1 ml af cellesuspensionen at tælle cellerne og kontrollere cellernes levedygtighed. Color 30 pi cellesuspension med 30 pi 0,4% trypanblåt og tæller i live (ikke blå) celler under mikroskop ved hjælp hæmocytometer.
    11. Hold celledensiteten ved 2 - 6 x 10 5 celler / ml ved tilsætning af frisk vækstmedium dagligt; ikke overstiger 1 x 10 6 celler / ml. den maksimalevolumen for en 5 L spinner er 2,5 L.
      Bemærk: For de følgende trin, skal du fortsætte med partier af 2 - 2,5 l kultur med en tæthed 1 x 10 6 celler / ml. Gentag trin 1.1.12 - 1.1.14 at indsamle ca. 20 L (≈ 20 g tør pellet) af hver cellelinje før der fortsættes med næste trin.
    12. Pellet cellerne ved centrifugering ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C og kassér supernatanten.
    13. Resuspender celler i 100 ml iskoldt PBS ved pipettering og der centrifugeres ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C for at vaske pelleten.
    14. Gentag vask ved resuspendering af cellerne med 25 ml iskold PBS, overføre suspensionen til 50 ml rør og centrifugering ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
      Bemærk: Cellepellets kan enten anvendes straks eller frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C i flere dage.
  2. Isolering af Kerner
    Bemærk: Udfør trin 1.2.1 - 1.4.3 i det kolde rum.
    1. Pre-chill buffeRS og homogenisatorer.
    2. Hvis der anvendes frosne materiale, hurtigt tø cellepellets i vandbad ved 37 ° C.
    3. Resuspender 20 g (≈ 20 ml) af celler i 20 ml (en mængde svarende til størrelsen af cellepellet) af hypotonisk buffer A (tabel 3) ved anvendelse af 10 ml af bufferen først, og derefter tilsætte 5 ml, derefter tilsætte yderligere 5 ml. Vask pipetterne godt med frisk buffer at få det maksimale af celler.
    4. Transfer 40 ml cellesuspension ind i den præ-kølet homogenisator med en tætsiddende pistil.
    5. Homogenisere celler med 20 slag i en homogenisator (20 ind og ud bevægelser) og overføre cellesuspensionen i 50 ml rør.
    6. Vask homogenisator med 7 ml saccharose buffer (1/3 af det oprindelige volumen celle, tabel 3) at genvinde den maksimale af celler. Overfør denne suspension hurtigt ind i 50 ml rør fra trin 1.2.5 at bevare kernerne og begrænse lækage.
    7. Farv en 30 pi alikvot med 30 pi 0,4% trypan blå, analysere under mikroskop for at kontrollere lysis virkning (hvis lysen er vellykket, skal alle kerner være blå). Gentag om nødvendigt homogenisering trin.
    8. Centrifuger i 7 min ved 10.000 xg og 4 ° C for at pelletere kernerne. Gemme supernatanten som den cytoplasmatiske fraktion.
  3. Udarbejdelse af Nuclear Salt-ekstraherbare (SE) Fraktion
    1. Resuspender kerner pellet i 8 ml saccharose buffer (en mængde svarende til størrelsen af ​​kerner pellet). Tilføj dråbevis under blanding grundigt på en vortex 8 ml puffer med højt saltindhold (1 kerner pellet volumen, tabel 3) for at få en slutkoncentration på 300 mM NaCl. Der inkuberes i 30 minutter på is og blandes hver 5 min.
    2. Decrease NaCl-koncentrationen til 150 mM ved tilsætning af 8 ml (1/3 af det samlede volumen) saccharose buffer. Centrifuger i 10 minutter ved 13.000 xg og 4 ° C. Opsaml supernatanten (nuklear salt-ekstraherbart fraktion, SE).
      Bemærk: Enten fortsætte til trin 1.3.3 eller forlade SEfraktion på is under fremstillingen af ​​kromatin-bundne fraktion og derefter ultra-centrifuge begge fraktioner samtidigt.
    3. Ultra-centrifuge SE i 30 minutter ved 85.000 xg ved 4 ° C. Tag supernatant (≈ 26 ml).
    4. Frys 100 pi alikvot i flydende nitrogen. Fortsæt til trin 2 "Protein kompleks rensning", ved hjælp af resten af ​​ekstrakten.
      Bemærk: Portionen skal bruges som input kontrol under trin 5.1.1.
  4. Fremstilling af Chromatin-bundne fraktion
    1. Pellet resuspenderes (fra trin 1.3.5.) Grundigt i 7 ml (en mængde svarende til størrelsen af ​​pellet) saccharose buffer.
    2. Tilføj CaCI2 til en slutkoncentration på 1 mM (28 pi 0,5 M CaCl2 i 14 ml suspension) for at aktivere MNase (trin 1.4.4) og blandes.
    3. Pre-varme suspension i 1 min ved 37 ° C.
    4. Tilføj 70 pi micrococcal nuclease (MNase) for at få en slutkoncentration på 0,0025 U / pl (1/200 fortynding fra 0,5U / ul lager) og blandes.
    5. Inkuber nøjagtigt 12 minutter ved 37 ° C. Bland hver 4 min.
    6. Umiddelbart placere reaktionen på is.
    7. For at stoppe MNase aktivitet, tilsættes 112 pi 0,5 M EDTA, pH 8,0 (1/125 fortynding) til en slutkoncentration på 4 mM. Der inkuberes i 5 minutter på is.
    8. Soniker 5 gange i 1 minut ved høj amplitude, mellem to sonications tillade en pause på 1 min (10 min i alt).
    9. Ultracentrifuge i 30 minutter ved 85.000 xg og 4 ° C.
    10. Opsaml supernatanten (nukleosom berigede fraktion, NE, ≈ 12 ml).
    11. Frys 50 pi alikvot i flydende nitrogen. Fortsæt til trin 2 "Protein kompleks rensning", ved hjælp af resten af ​​ekstrakten.
      Bemærk: Portionen skal bruges som input kontrol under trin 5.1.1.

2. Protein Purification Komplekser

Bemærk: Fortsæt i parallelle ekstrakter fra hver cellelinje (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD og kontrol, Hela-S3 Flag-HA).

  1. Flag- baseret Oprensning
    1. Forvask Flag harpiks. Brug 600 pi Flag harpiks (fra det kommercielle 50% lager) for hvert eksperimentelt punkt (SE og NE fraktioner for hver cellelinje).
    2. Transfer harpiks i 15 ml rør, resuspender i 13 ml kold Tegn (tabel 3), der centrifugeres i 2 minutter ved 1.000 xg og fjern supernatanten. Gentag 5 gange. Efter den sidste vask resuspenderes Flag harpiks i samme volumen Tegn (300 pi for hvert eksperimentelt punkt).
    3. For hvert eksperimentelt punkt, bland 600 pi vasket Flag harpiks og de tilsvarende proteinekstrakter (i et 15 ml rør til 12 ml NE og i en 50 ml rør til de 26 ml SE fraktioner, henholdsvis). Inkuber på et roterende hjul natten over ved 4 ° C.
    4. Centrifuger i 2 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C, lægge supernatanten og holde ved 4 ° C, indtil resultatet af rensningseffektiviteten test (2.2).
    5. For SE prøver, resuspender Flag harpiksi 4 ml Tegn og overførsel til en 15 ml rør. Gentag dette trin 3 gange, hver gang de overføres til samme 15 ml rør undgå at miste perler. Centrifuger 2 minutter ved 1.000 xg og 4 ° C og fjern supernatanten.
    6. Wash Flag harpiks 7 gange i en 15 ml rør under anvendelse 13 ml Tegn og centrifugering 2 minutter ved 1.000 xg og 4 ° C.
    7. Efter den sidste vask, resuspenderes i 1 ml Tegn og overførsel til en 1,5 ml lav-bindende rør. Centrifuger 2 minutter ved 1.000 xg og 4 ° C, og supernatanten fjernes.
    8. Resuspender i 200 pi Flag peptidopløsning ved 4 mg / ml ved pH 7,8 for hvert eksperimentelt punkt. Bland perlerne og peptid. Tilsæt 200 pi Tegn puffer og inkuberes ved 4 ° C i mindst 4 timer eller natten over for at eluere bundne proteiner.
    9. Centrifugeres i 2 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C og overføres harpiksen og supernatanten (Flag eluat) til en tom spinkolonne anbragt i et 2 ml rør.
    10. Centrifuger kolonnen, indsamle den venstre-over supernatant i 2 ml rør. Opsaml Flag harpiksen ved tilsætning Tegn buffer til søjlen og videre til anden Flag eluering med 200 pi Flag peptidopløsning (4 mg / ml) natten over ved 4 ° C i hvert eksperimentelt punkt.
    11. Gentag trin 2.1.9 - 2.1.10 at indsamle anden eluering. Kombiner første og anden eluater.
  2. Test af rensningseffektivitet
    Bemærk: Under trin 2.1.11 - 2.1.12, udføre SDS-PAGE og sølvfarvning (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Tage 15 pi af eluaterne, tilsættes 5 pi 4x ladningsbuffer og 2 pi 10x reduktionsmiddel, koges i 5 minutter ved 96 ° C og køre en SDS-polyacrylamid 4 - 12% gel ifølge producentens anvisninger.
    2. Farv gelen ved hjælp sølvfarvning kit (følg producentens anvisninger). Hvis der er klare forskelle i protein mønstre mellem Flag-HA-MyoD og Flag-HA mock eluater, især bandet af Flag-HA MyoD (omkring 50 kDa, figur 1A), fortsætte til næste stes.
  3. Hemagglutinin (HA) -baseret Rensning
    1. Wash HA harpiks ved at overføre i 15 ml rør, resuspendering i 13 ml Tegn og centrifugering 2 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C. Gentag vasketrin 5 gange. Efter sidste vask resuspender perler i samme volumen Tegn buffer.
      Bemærk: Lydstyrken skal justeres i henhold til effektiviteten af ​​Flag-baserede rensning. Start med 300 pi fra den kommercielle 50% lager for hvert eksperimentelt punkt.
    2. Overførsel HA harpiks til hvert eksperimentelt punkt i en 1,5 ml lav binding rør. Centrifuger 2 min ved 1.000 xg ved 4 ° C, fjerne maksimum af vaskebuffer (tabel 3) og tilsæt eluaterne fra Flag-baseret oprensning til HA-harpiks.
    3. Inkubér rør på det roterende hjul natten over ved 4 ° C.
    4. Centrifuger i 2 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C, lægge supernatanten og holde ved 4 ° C, indtil resultatet af rensningseffektiviteten test (2.3.12.).
    5. Resuspendere HA harpiks i 0,5 ml Tegn, overførsel til et nyt lavpunkt bindende 1,5 ml rør. Gentag resuspension gang tilsætning til det samme 1,5 ml rør at undgå at miste perler og centrifugeres 2 minutter ved 1.000 xg og 4 ° C. Fjern supernatanten.
    6. Vask perler 8 gange ved anvendelse af 1 ml Tegn hver gang, centrifugering 2 minutter ved 1.000 xg og 4 ° C og fjernelse supernatant (undgå at miste perler). Efter den sidste vask, overføre perlerne i 0,5 ml rør.
    7. Fjern så meget supernatanten som muligt. Tilsæt 100 pi HA fri peptidopløsning (4 mg / ml) ved pH 7,8 på perler at eluere bundne proteiner. Inkuber på det roterende hjul natten over ved 4 ° C.
      Bemærk: Mængden af ​​HA-peptid skal justeres afhængigt af den overflod af komplekserne.
    8. Centrifugeres i 2 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C og overføres harpiksen og supernatanten (HA eluat) til en tom spinkolonne anbragt i et 2 ml rør.
    9. Centrifugeres søjlen til opsamling af venstre-over supernatant i 2 ml rør. Udfør en anden eluering med 100 pi HA-peptid (4 mg / ml) i hvert eksperimentelt punkt. Inkuber på det roterende hjul natten over ved 4 ° C. Gentag trin 2.3.8 - 2.3.9 til at indsamle anden eluering.
    10. Kombiner første og anden eluater.
    11. Test rensningseffektivitet ved SDS-PAGE og sølvfarvning (se trin 2.2.) (Figur 1A).
    12. Koncentrer HA eluatet til 30 pi under anvendelse centrifugal filteranlæg med en 10 kDa cut-off (nominel molekylvægt grænse, NMWL) ifølge producentens instruktioner.
    13. Opdel koncentrerede prøver i to dele: 22.5 (3/4) og 7,5 (1/4) pi. Snap fryse 1/4 af prøver i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Brug 3/4 del til trin 3.
      Bemærk: 1/4 frosne del skal anvendes til bekræftelse af massespektrometri resultater ved Western blot (se trin 5.1).

3. massespektrometrianalyse

Bemærk: Følgende trin bør drøftes med massespektrometri facilitet, der vil udføre analysen.

  1. Supplement 3/4 (22,5 pi) af prøverne med 7,5 pi 4x ladningsbuffer og 3,3 pi 10x reduktionsmiddel og koges i 5 minutter ved 96 ° C.
  2. Indlæs prøver på en SDS-polyacrylamid 4 - 12% gel. Kør gel ved 150 V konstant i 5 min for at give alle de proteiner, for at komme ind i gelen uden adskillelse.
  3. Vask gelen med vand; fix for 20 - 30 min med fikseringsopløsning (10% eddikesyre, 50% methanol, 40% ultra-rent vand) Derefter vaskes den faste gel 5 gange i ultra-rent vand.
  4. Skær båndene indeholder proteiner, opbevares i 1 ml vand i et 1,5 ml rør og send til massespektrometri facilitet.

4. Data Analysis

Bemærk: Dette er en generel vejledning for analysen. De præcise trin vil afhænge af den bestemte data, som afgives af MS facilitetanvendes til at udføre analysen (fx 21,22).

  1. Sammenlign listen over de identificerede proteiner i "MyoD" eluater med listen opnået fra tilsvarende negativ forberedelse kontrol. Udeluk fra analysen af ​​de proteiner, der findes i begge lister.
  2. Fjern proteiner, der har ≤2 samlede antal identificerede peptider fra resterende liste.
  3. Adgang funktionel annotation og funktionel klassificering af den opnåede liste af proteiner ved hjælp af DAVID Bioinformatik Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) og klassificere listen af proteinerne 23,24.
  4. (Valgfri) Fjern fra listen "blaffere", ladede ikke-nukleare proteiner med stærke utilsigtet bindende for negativt ladet DNA 25. Disse indeholder cytoskeletale, cytoplasmatiske, mitokondrie, membran og receptorproteiner (Protein foldning, Cytoskellet og Diverse gruppe proteiner i tabel 1 og 2). </ Li>
  5. Sammenligne de opnåede lister over de MyoD interaktionskandidater fra SE og NE fraktioner at identificere fælles proteiner og proteiner specifikke for hver fraktion (figur 2).

5. Bekræftelse af Identificerede interaktionskandidater ved Western Blot

  1. Bekræftelse i HeLa-S3 Flag-HA-MyoD og HeLa-S3 Flag-HA
    1. Optø eluat prøver opnået på trin 2.3.14 (7,5 pi) på is. Tilsættes 12 pi Tegn puffer, 10 pi 4x ladningsbuffer og 3 pi 10x reduktionsmiddel. Boil prøver i 5 minutter ved 96 ° C.
    2. Forbered input prøver for western blotting.
      1. Optø portioner fra trin 1.3.9 og 1.4.11 og måle protein koncentration, for eksempel ved hjælp af BCA-kit (følg producentens anvisninger).
      2. Brug 15 ug af proteinet per bane. Mål passende mængde af ekstraktet og justere volumen af ​​prøven op til 15 pi med Tegn buffer.
      3. Tilsæt 5 pi 4x ladningsbuffer og1.5 pi 10x reduktionsmiddel. Boil prøver i 5 minutter ved 96 ° C.
    3. Udfør en western blot analyse med antistoffer af interesse (specifikke for partner kandidat identificeret under MS-analyse) ved hjælp af 15 pi eluat prøver. Brug input ekstrakter som kontrol af endogene protein niveauer (figur 3A).
  2. Bekræftelse i Relevant Cellular System
    1. Fremstilling af samlet kerneekstrakt af C2C12 mus myoblaster.
      1. Grow C2C12 mus myoblaster i DMEM-medium suppleret med 15% føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator. Aldrig overstige 80% celle sammenløb at opretholde celler i proliferativ tilstand.
      2. Vokse mindst to 150 mm skåle i C2C12 for et point (ét antistof) af immunpræcipitering (IP). Aspirer medium, vaske cellerne to gange med 10 ml PBS.
      3. Skrabe cellerne og anbring i 15 ml rør. Centrifuge ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres.
      4. Beregne mængden af cellepelleten (= V celle). Resuspenderes forsigtigt pellet i 3 volumener V celle hypotonisk buffer B at forstyrre cytoplasmatiske membran (tabel 3).
      5. Tilføj 0,44 × V celle volumen på 10% NP-40 for at nå slutkoncentration på 1% (vol / vol). Vend forsigtigt røret flere gange for at blande.
      6. Tilføj 0,89 × V cellevolumen af SR (tabel 3) at bevare kerner integritet. Vend forsigtigt reagensglasset flere gange for at homogenisere suspensionen, og centrifugeres i 5 minutter ved 2.000 xg for at pelletere kernerne.
      7. Fjern supernatanten (cytosol fraktion). Vurdere omfanget af kerner pellet (= V nuc). Resuspender kerner pellet i et volumen V nuc af saccharose buffer.
      8. Tilføj dråbevis under blanding grundigt på en vortex et volumen V nuc af højsaltpuffer at få en slutkoncentration på 300 mMNaCI og inkuberes i 30 minutter på is. Bland hver 5 min.
      9. Tilsæt en volumen V nuc af saccharose buffer (for at reducere NaCI-koncentration til 150 mM) og CaCl2 (slutkoncentration 1 mM). Blande.
      10. Pre-varme suspension i 1 min ved 37 ° C, tilsæt micrococcal nuclease at få endelig koncentration 0,0025 U / pl (1/200 fra lager af 0,5 U / pl). Blande.
      11. Inkuber nøjagtigt 12 minutter ved 37 ° C. Bland hver 3 min.
      12. Anbring straks reaktion på is, og der tilsættes EDTA (slutkoncentration 4 mM) for at stoppe MNase aktivitet. Der inkuberes i 5 minutter på is.
      13. Soniker 5 gange til 0,5 min hver ved høj amplitude. Mellem to sonications, tillade en pause på 0,5 min (5 min i alt).
      14. Ultra-centrifuge i 30 minutter ved 85.000 xg og 4 ° C. Opsaml supernatanten (total kerneekstrakt).
      15. Måle proteinkoncentrationen af ​​den samlede kerneekstrakt, fx under anvendelse BCA kit (følg producentens anvisninger), og fortsæt immediately til trin 5.2.2.
    2. Immunopræcipitering (IP) af endogen MyoD.
      1. Til at pre-klar ekstrakterne, vask 10 pi af protein G agaroseperler for hver IP-punkt.
        1. Overfør den nødvendige volumen af ​​protein G agaroseperler i et 1,5 ml rør, resuspender i 1,4 ml kold Tegn, centrifugeres i 2 minutter ved 1.800 xg og fjern supernatanten. Gentages 3 gange.
      2. Bland forvaskede protein G agaroseperler med den passende mængde af den samlede nukleare ekstrakt. Brug 500 ug totalt kerneekstrakt protein pr IP punkt.
      3. Inkuber på et roterende hjul ved 4 ° C i 2 timer til at pre-rydde ekstrakter.
      4. Centrifuger i 5 minutter ved 1.800 xg ved 4 ° C. Hold supernatant.
      5. Bland 5 ug MyoD Ab eller 5 pg kanin-IgG med 500 ug præ-blokerede samlede kerneekstrakter i 1,5 ml lave bindende rør. Tilføj Tegn buffer op til 1 ml. Inkuber på et roterende hjul ved 4 ° C natten over.
        Bemærk: Udfør following trin under trin 5.2.2.3.
      6. Forvask 7,5 pi protein A / G lager perler opløsning pr IP point.
        1. Overfør den nødvendige volumen af ​​perler i et 1,5 ml rør, resuspendere perlerne i 1 ml Tegn og der centrifugeres ved 1.800 xg ved 4 ° C i 2 min. Fjern supernatanten. Gentages 3 gange.
      7. Resuspender protein A / G-perler i 1,5 ml blokerende opløsning (tabel 3) og inkuber på et roterende hjul natten over ved 4 ° C.
      8. Centrifuge samlede kerneekstrakter inkuberet med Abs (trin 5.2.2.5) ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Hold supernatant.
      9. Centrifuger blokeret protein A / G-harpiks (trin 5.2.2.7) ved 1800 xg i 2 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres og resuspender i 1 ml Tegn puffer. Re-centrifuge ved 1.800 xg i 2 min ved 4 ° C for at udvaske blokerende buffer.
      10. Resuspender blokeret protein A / G-harpiks i 1 ml Tegn puffer og alikvot i nye protein-bindende rør lave til opnåelse 7,5 pi bloflueben protein A / G harpiks pr IP punkt. Der centrifugeres ved 1.800 xg ved 4 ° C i 2 minutter og fjerne så meget som muligt af supernatanten.
      11. Tilføj de samlede kerneekstrakter inkuberet med Abs (eller kontrol IgG) til A / G-harpiks. Blandes og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur (RT) på et roterende hjul.
      12. Centrifuger suspensionen 1.800 xg ved stuetemperatur i 2 min. Supernatanten kasseres, resuspender i 1 ml vaskebuffer og overførsel suspension i nye lave bindende rør. Inkuber ved stuetemperatur på et roterende hjul i 5 min.
      13. Centrifuge suspensionen ved 1.800 xg ved stuetemperatur i 2 minutter, resuspenderes i 1 ml vaskebuffer og inkuberes ved stuetemperatur på et roterende hjul i 5 min. Gentag 4 gange. For den sidste vask overføres til en ny lav bindende rør.
      14. Fjern maksimum af supernatanten. Tilføj 7 pi vaskepuffer, 7 pi 4x ladningsbuffer og 3 pi 10x reduktionsmiddel til perlerne, blandes og koges i 5 minutter ved 96 ° C.
      15. Udfør en Western blot-analyse med antistoffer af intpåløbne renter (specifikt for partner kandidat til immun udfældet protein). Brug 1% (5 mg) af input ekstrakter som en kontrol af endogene protein niveauer (figur 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at forstå reguleringen af ​​MyoD aktivitet, vi foretog den udtømmende karakterisering af MyoD komplekser under anvendelse biokemisk oprensning, baseret på immunrensning af en dobbelt mærket form af MyoD efterfulgt af massespektrometri (MS). Brugen af ​​HeLa-S3-cellelinje udtrykker Flag-HA-mærket MyoD og en kontrol cellelinie udtrykker Flag-HA tilladelser til at få nok materiale til at rense MyoD kompleks ved at udføre dobbelt-affinitetsoprensning af Flag-HA-MyoD.

Vi fraktioneret celleekstrakterne i cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, derefter yderligere fraktioneret den nukleare fraktion til salt-udvindes (nuklear salt-ekstraherbare, SE) og beriget for nukleosomer (nucleosomstørrelse-beriget, NE) fraktioner. TAP-Tag oprensning fra disse separerede nukleare fraktioner (figur 1, tabel 1 og 2) tilladte optrevling partnere, der har relativt lav abundance når lokaliseret på et bestemt subnuclear rum. Desuden blev en sådan strategi udnyttes til at afdække partnere ubundet (SE) versus DNA-bundet (NE) MyoD at få indsigt på MyoD aktivitet regulering.

For TAP-Tag oprensning blev Flag-HA tandem-epitop, der anvendes. Den lille hydrofile Flag og HA-epitoper har minimal interferens med proteinfunktion og er meget tilgængelige for antistof-antigen-interaktion. Anti-Flag og anti-HA-harpiks-baserede sekventiel immunorensning blev udført, efterfulgt af eluering af de immunorenset komplekser under anvendelse Flag og HA-peptider. De eluerede proteiner blev derefter kørt på en SDS-PAGE for at tillade alle proteiner at indtaste gelen. De stykker af gel, der indeholder alle oprensede proteiner blev skåret; proteinerne blev ekstraheret, trypsin-spaltet og identificeret ved massespektrometri (MS).

Som vist i figur 2, (figur 2 og 3) 26-28. Det kaster lys over DNA-bundet MyoD partnere og mulige co-regulatorer, der kan etablere en undertrykkende-kromatin miljø. For eksempel HP1 proteiner, som blev identificeret som MyoD partnere ved beskrevne metode, er kendt for at binde methylerede H3K9 at opretholde gen undertrykkelse og heterochromatin struktur. Faktisk HP1 hæmmer MyoD transkriptionel aktivitet resulterer i forringet gen MyoD target udtryk og muskel terminal differentiering 26.

Yderligere fraktionering afSE og NE MyoD komplekser på glycerol-gradient (som beskrevet i 29) afdækkede MyoD sub-komplekser i de to inde i kernen kamre (figur 1b). Især er SE MyoD fordelt i tre undergrupper komplekser, medens kromatin-bundne MyoD hører hovedsagelig til én kompleks.

Nogle af TAP-tag / MS afslørede interaktionskandidater blev bekræftet ved Western blot på MyoD komplekser. Disse omfatter transskription faktor CBF, EBB, MTG8R og SWI / SNF subunit BAF47 (SNF5) (figur 3A, venstre) og HP1 proteiner (CBX1 og CBX3) (Figur 3A, højre). Vigtigere er det, eftersom HeLa celler ikke muskelceller og udtrykker ikke MyoD, er det nødvendigt at bekræfte interaktioner mellem nyligt identificerede interaktionskandidater og MyoD i myoblaster (figur 3 BD). Især for sådan validering, de samlede nukleare ekstrakter (uden adskillelse på SE og NE) er normalt tilstrækkeligt, which tillader reduktion af mængden af ​​myoblaster anvendes til prøvefremstilling. In vitro interaktion analyser som i 26,27, bidrage til yderligere valideret disse resultater. Endelig bør de funktionelle betydninger af disse interaktioner i muskelceller yderligere behandlet som i 26-28.

Tilsammen præsenterede data viser en samlet oversigt over allestedsnærværende udtrykte MyoD partnere og bane vejen til yderligere funktionelle studier i en mere relevant muskel model.

figur 1
Figur 1: MyoD Komplekser isoleret ved Tandem Affinitetsrensning (A) en sølvfarvning af de dobbelte affinitetsoprensede eMyoD komplekser isoleret fra nuklear salt-ekstraherbart (SE) eller nukleosom-beriget (NE) nukleare fraktioner af HeLa-S3-cellelinier stabilt. udtrykker Flag-HA-MyoD (MyoD kompleks) end kontrol-cellelinie (Mock). MW, molekylvægtmarkør i kilo dalton (kDa). Pil viser Flag-HA-MyoD (eMyoD). Denne forskning blev oprindeligt udgivet i 37. Copyright The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Dette tal er blevet ændret fra 26: banerne med mock oprensninger og eMyoD kompleks isoleret fra SE nukleare fraktioner nu vist. (B) Dobbelte affinitetsoprensede eMyoD komplekser som i (a) blev fraktioneret på glycerol-gradient i området fra 20% til 41%. Fraktioner blev manuelt opsamlet, koncentreret og analyseret ved western blot (WB) under anvendelse af anti-FLAG-antistoffer. Bemærk tilstedeværelsen af flere eMyoD-holdige sub-komplekser i nukleare salt-ekstraherbare (SE) fraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 Figur 2:. Sammenligning af kromatin-bundet (nukleosom beriget, NE) versus Nuclear Opløselig (nuklear salt ekstraherbare, SE) MyoD Partners Top: Venn diagram, der viser overlap mellem eMyoD interaktionskandidater isoleret fra nuklear salt-ekstraherbare (SE) og nukleosom-beriget ( NE) fraktion. De ribosomale proteiner blev translationsinitieringssitet faktorer, DNA reparation faktorer og tubulin isoformer udelukket fra analysen, da de er til stede i forskellige data-sæt fremstillet ved TAP og betragtes som ikke-specifik Nederst:. De MyoD interaktionskandidater findes i både SE og NE fraktioner (fælles) eller specifikke for en af ​​fraktionerne (unikke) blev inddelt i grupper baseret på deres funktionelle anmærkninger. Cytoskelet-relaterede og diverse andre proteiner ikke afbildet. De understregede proteiner er MyoD interaktionskandidater validerede enten i HeLa og / eller i myoblasts med co-immunopræcipitation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Validering af udvalgt sæt af MyoD interaktionskandidater (A) Validering af MyoD interaktionskandidater, identificeret ved massespektrometri, i HeLa-S3-cellelinje stabilt udtrykker Flag-HA-MyoD (eMyoD) Venstre panel:. Western blot analyse af dobbelt affinitet -purified MyoD komplekser isoleret fra nuklear salt-ekstraherbart (SE) eller nucleosomstørrelse-berigede (NE) fraktioner af HeLa-S3-cellelinje stabilt udtrykker eMyoD eller kontrol-cellelinie (Mock) med de angivne antistoffer. MW, molekylvægtmarkør Højre panel:. Western blot-analyse af dobbelt affinitetsoprensede MyoD komplekser isoleret fra nukleare nucleosomstørrelse-berigede fraktioner af HeLa-S3-cellelinie sgåeligt udtrykker eMyoD eller kontrol cellelinie (Mock) med angivne antistoffer. Dette panel blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. Chem. 2008 aug 29; 283 (35): 23.692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Juli 2. Copyright The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Dette tal er blevet ændret fra 26: Politiet type og størrelse blev ændret, og teksten blev roteret at forene mærkningen inden figuren. MyoD var mærket som eMyoD at undgå forveksling med endogene IP præsenteres i de andre paneler. (BD) Validering af MyoD interaktionskandidater i C2C12 mus myoblaster. (B) Nuclear totale ekstrakter fra prolifererende C2C12 myoblaster blev anvendt til immunpræcipitering (IP) med antistoffer rejst mod BAF47 (SNF5) eller MyoD, eller med kontrol-IgG. De resulterende bundfald blev analyseret ved WB with de angivne antistoffer. For anti-MyoD antistoffer længere (lang expo.) Og kortere (kort expo.) Eksponeringstider vises. Input ekstrakter blev indlæst til at vise endogene protein niveauer. Dette panel er blevet offentliggjort i 28 under Creative Commons Attribution (CC BY) licens (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dette tal er blevet ændret fra 28: Politiet type og størrelse blev ændret, og testen blev roteret at forene mærkningen inden figuren. (C) Nuclear totale ekstrakter fra prolifererende C2C12 myoblaster blev anvendt til immunfældning med antistoffer dannet mod MyoD, Suv39h1 (positiv kontrol) eller kontrol IgG (negativ kontrol). De resulterende bundfald blev derefter underkastet WB med de angivne antistoffer. Dette panel blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. Chem. 2008 aug 29; 283(35): 23.692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Juli 2. Copyright The American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Dette tal er blevet ændret fra 26: Politiet type og størrelse blev ændret, og teksten blev roteret at forene mærkningen inden figuren. (D) Nuclear totale ekstrakter fra prolifererende (spredningsrelaterede.) Og differentierende C2C12 myoblaster (48 timer, angivet som Diff.) Blev anvendt til immunpræcipitering (IP) med antistoffer rejst mod MyoD og Myf5, eller med normal kanin IgG og med tomme perler som negativ kontrol. De resulterende bundfald blev analyseret ved WB med de angivne antistoffer. Input ekstrakter blev indlæst til at vise endogene protein niveauer. Dette panel er blevet offentliggjort i 27 under Creative Commons Attribution (CC BY) licens (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dette tal er blevet ændret fra 27: Politiet type og størrelse blev ændret, og teksten blev roteret at forene mærkningen i figur. Panelerne med de opnåede resultater fra prolifererende og differentiere C2C12 adskilles i to i modsætning til den oprindelige figur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1:. Liste af proteiner identificeret ved MS Analyse i Double affinitetsrenset eMyoD komplekser Isoleret fra Nuclear Salt-ekstraherbare Fraktion efter Subtraktion af baggrunden Proteiner (Proteiner identificeret af MS i eluater fra kontrol cellelinje blev betragtet som ikke-specifik baggrund .) dataene repræsenterer summen af fire uafhængige oprensninger. klik her for at downloade denne fil.

Tabel 2: Liste over Proteins Identified af MS Analyse i Double affinitetsrenset eMyoD komplekser Isoleret fra nukleosom fraktion efter Subtraktion af baggrunden Proteiner. Dataene repræsenterer summen af tre uafhængige rensninger. Klik her for at downloade denne fil.

Tabel 3. Buffer Kompositioner. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne procedure tillader udtømmende identifikation af partnere i et transskription faktor, MyoD. Det afsløret MyoD partnere i en heterolog ordning resistent over for MyoD-induceret differentiering, nemlig HeLa-S3-celler. Således ved definition, identificerede MyoD partnere ubikvitært. Disse omfatter generelle og sekvensspecifikke transkriptionsfaktorer, kromatin-modificerende enzymer, RNA-bearbejdning proteiner, kinaser (tabel 1 og 2). Da HeLa-S3-celler er resistente over for MyoD-induceret trans-differentiering, MyoD aktivitet hovedsagelig repressive og de identificerede partnere vil sandsynligvis være MyoD co-repressorer. Dette understreges ved tilstedeværelsen af Id proteiner (tabel 1 og 2, figur 2), der er kendt for at hæmme MyoD transaktivering evne 8. Vigtigt er det, sådan en repressiv svarer til MyoD status i prolifererende myoblaster. Faktisk vi bekræftet, at MyoD interaktioner med CBFβ, et MyoDpartner identificeret ved den beskrevne fremgangsmåde, kan påvises i prolifererende C2C12 myoblaster, men går tabt, når cellerne undergik differentiering (se figur 3D). Det er dog vigtigt at bemærke, at en af ​​de vigtigste begrænsninger præsenterede metode er manglen på MyoD co-aktivatorer identifikation. Konsekvent anvendelse af denne metode ingen af de kendte MyoD co-aktivatorer, såsom histonacetyltransferaser 32 blev identificeret.

Oprensning af MyoD komplekser enten fra den opløselige fraktion (nuklear salt kan ekstraheres, SE) af kernen eller kromatin fraktion (nukleosom beriget, NE) (figur 1A) tjener mindst to hovedfunktioner. For det første er en sådan fraktionering øger repræsentationen af ​​de ikke-støkiometriske partnere, der ville blive maskeret hvis MyoD oprensning udføres fra total kerneekstrakter. Det andet er dette tillader separationen af ​​to funktionelle subpopulationer af MyoD: prædeponeret / EVICTed (SE) og kromatin-bundet (NE). Blandt interaktionskandidater specifikke for DNA-ubundet MyoD, mange kinaser, transkriptionsfaktorer, menneskehandel proteiner samt nogle kromatin remodelers blev identificeret (figur 2). Når den er fuldt valideret, kan et sådant netværk giver et indblik i den tilstand af aktivitet regulering af DNA-ubundet MyoD. Udvidet søgning efter MyoD post-translationelle modifikationer i disse to nukleare rum ved massespektrometri, kunne yderligere udrede MyoD aktivitet regulering. Endelig fraktionering af opløselige og kromatin-bundne MyoD komplekser på en glycerol-gradient afslørede, at mens kromatin-bundne MyoD hovedsageligt er indeholdt i en kompleks, er DNA-ubundet MyoD fordelt i tre sub-komplekser (figur 1b). Karakterisering af disse sub-komplekser med enten MS og / eller western blot mod protein kandidater skal belyse yderligere form for MyoD regulering.

Som understreget ovenfor, behøver HeLa-celler ikke naturligt EXPREss musklen transkriptionsfaktor MyoD. Det var derfor vigtigt at bekræfte de fundne interaktioner i en skeletmuskel model (figur 3). Mange rapporter bekræftet i relevante modeller sådanne funktionelle interaktioner mellem MyoD og nogle af partnerne er identificeret i den præsenterede TAP-tag assay. Dette er for eksempel tilfældet for prohibitin 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26, og SWI / SNF kromatin-remodeling kompleks 36,28,30.

Bemærk at det er muligt at udføre en sådan TAP-tag oprensning fra lav mængde celler, såsom fra myoblaster ved kombination med følsomme MS. Faktisk beskrev en nylig papir MyoD partnere karakterisering efter inducerbar ekspression af Flag-tagget MyoD i myoblaster 30. Da stabil og vedvarende MyoD overekspression i myoblaster er skadelig, vil en alternativ fremgangsmåde være at tilføje Flag-HA-tags i den endogene MyoD allel (er) i myoblasterved hjælp af genom-redigering metoder, såsom CRISPR-Cas9 31. Navnlig kunne tilsætning af tag (s) potentielt ændre proteiners funktioner og / eller associering med bindingspartnere derfor i stedet for tag (N- eller C-terminalen) bør vælges med forsigtighed. En funktionel assay af fusionsproteinet i det relevante system skal udføres før TAP-tag oprensning for at sikre den mærkede protein er funktionelt. Immunopræcipitering af endogene proteiner undgår disse problemer, men det er afhængig af tilgængeligheden af ​​en specifik og høj affinitet antistof, som er sjældent tilgængelige.

En anden merværdi beskrevne fremgangsmåde er muligheden for at identificere post-translationelle modifikationer (PTMS) af selve det oprensede protein og dets rigelige partnere. Derved med denne funktion i TAP-tag rensning er egnet til at identificere ikke kun nye interaktion partnere, men også nye enzymatiske funktioner i forbindelse med proteinet af interesse og / eller dennes partnere. IVed en chromatin-bindende protein (dvs.., transkriptionsfaktorer, enzymer), er denne metode således indrettet til identificering af den tilhørende "histon kode". Faktisk er de aminoterminale histon haler, som er udsat på nukleosom overflade, er genstand for flere kovalente PTMS. Histon PTMS giver en unik signatur til de involverede nukleosomer. En kombination af forskellige modifikationer på histon N-terminale haler kan således ændre chromatinstruktur for at tillade genekspression regulering. Således karakteriserer sådanne ændringer i forbindelse med et givet protein kunne give indsigt i de roller og virkningsmekanismer af de undersøgte kromatin proteiner 22.

Sammenfattende præsenterede metode tillader omfattende identifikation af MyoD partnere. Den TAP-tag rensning giver et alternativ til andre tilgange såsom GST pull-downs, gær to-hybrid assays og fag-display. Selv hvis det af praktiske årsager (production af store mængder af kerneekstrakter) vi nødt til at bruge en heterolog mobilsystem, har vi været i stand til at bekræfte inddragelse af de identificerede MyoD partnere i skeletmuskulatur differentiering. De opnåede data viser, at den MyoD myogene faktor synes at interagere med en overflod af proteiner spænder fra transkriptionelle regulatorer til RNA-bindende proteiner, hvilket antyder de forskellige mekanismer, der regulerer aktiviteten af ​​en transkriptionsfaktor.

Konkluderende kan de samme metoder anvendes til at identificere ubikvitært udtrykt partnere talrige nukleare faktorer, som kan være vanskelige at undersøge i deres specifikke cellulære kontekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23, (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24, (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8, (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11, (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8, (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6, (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40, (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185, (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132, (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47, (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25, (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22, (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31, (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20, (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37, (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8, (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5, (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9, (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29, (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10, (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117, (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11, (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27, (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316, (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics