Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

Developmental Biology

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Summary

du tissu cardiaque humain héberge des populations de cellules précurseurs pluripotentes périvasculaires qui peuvent être appropriés pour la régénération du myocarde. La technique décrite ici permet l'isolement et la purification simultanée de deux populations de cellules stromales pluripotentes associées aux vaisseaux sanguins d' origine, c. -à- CD146 + CD34 - péricytes et les cellules CD34 + CD146 - cellules de l' adventice, du myocarde humain.

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Baily, J. E., Chen, W. C., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

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Abstract

Introduction

Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotique. Cependant, des études récentes ont démontré la présence du chiffre d'affaires de cardiomyocytes limitée dans les cœurs humains adultes 1. Cellules autochtones souches / progénitrices avec cardiomyocytes potentiel de différenciation ont également été identifiés dans le myocarde chez les rongeurs adultes et les cœurs humains, y compris Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere formation et , plus récemment, les cellules précurseurs périvasculaires 2,3. Ces cellules représentent des candidats attrayants pour les thérapies visant à améliorer cardiaque réparation / régénération par la transplantation de cellules ou de stimulation de la prolifération in situ.

Mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) ont été isolés à partir de presque tous les tissus humains 4,5 essais cliniques des applications thérapeutiques de MSC ont été réalisées pour de multiples états pathologiques tels que la réparation cardiovasculaire 6, la réaction du greffon contre l'hôte maladie 7 8. Les effets bénéfiques ont été attribués à la capacité des cellules souches mésenchymateuses à: la maison aux sites d'inflammation 9; différencier en types 10 de cellules différentes; sécréter des molécules pro-réparatrices 11; et moduler des réponses immunitaires 12 hôtes. L'isolement des cellules souches mésenchymateuses a toujours compté sur leur adhésion préférentielle à des substrats en plastique. Cependant, la population de cellules résultante est typiquement sensiblement hétérogène 13. En utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec une combinaison de marqueurs clés de cellules périvasculaires, nous avons été en mesure d'isoler et de purifier un multipotentes population précurseur MSC-like (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) à partir de de multiples tissus humains , y compris des adultes du muscle squelettique et la graisse blanche 14.

populations de cellules périvasculaires dans divers tissus non cardiaques se sont avérés avoir des propriétés souches / cellules progénitrices ae sont à l'étude pour une utilisation clinique dans le cadre cardiovasculaire. Péricytes, l' un des sous - ensembles les cellules périvasculaires les plus connus, sont une population hétérogène qui jouent plusieurs rôles physiopathologiques , y compris dans le développement de nouveaux vaisseaux 15, la régulation de la pression artérielle 16, et le maintien de l' intégrité vasculaire 17,18. Comme indiqué dans plusieurs tissus, des sous - ensembles spécifiques de péricytes expriment nativement des antigènes de MSC et de soutenir leurs phénotypes MSC comme dans la culture primaire après FACS purification 14. De plus, ces cellules maintiennent de manière stable leurs phénotypes à long terme au sein de la culture et présentent un potentiel de différenciation multi-lignée, semblable à MSCs 19,20. Ces résultats suggèrent que les péricytes sont une des origines du MSC insaisissable 14. Le potentiel thérapeutique des péricytes a été démontrée par une réduction de la cicatrisation du myocarde et l'amélioration de la fonction cardiaque après une transplantation dans lésé par une ischémiecoeurs 21. Récemment, nous avons purifié avec succès pericytes du myocarde humain et démontré leurs phénotypes MSC-like et multipotence (adipogenèse, chondrogenèse et ostéogenèse) avec l'absence de myogenèse squelettique 3. En outre, les péricytes myocardiques exposées différentielles capacités potentielles et angiogéniques cardiomyogéniques en comparaison avec leurs homologues purifiés à partir d'autres organes.

Une deuxième population de cellules souches / progénitrices multipotentes périvasculaires, la cellule adventice, a été isolé à partir de veines saphènes humaines sur la base de l' expression de CD34 positif 22. Les cellules de l' adventice veineuses ont été montrés comme ayant un potentiel clonogénique, la capacité de différenciation mésodermique et le potentiel pro - angiogénique in vitro. La transplantation de ces cellules dans les cœurs lésés par une ischémie des souris a entraîné une réduction de la fibrose interstitielle, une augmentation de l'angiogénèse et du flux sanguin myocardique, une réduction ventriculaire diltion, et l' éjection cardiaque augmenté la fraction 23. Fait intéressant, les cellules de l' adventice adipeux a été démontré que l' expression de perdre le CD34 et le CD146 upregulate expression dans la culture en réponse au traitement angiopoïétine II, ce qui suggère l'adoption d'un phénotype de péricytes avec une stimulation 24. À l'intérieur du coeur, cependant, la population de cellules de l'adventice n'a pas encore été purifiées par FACS de manière prospective et / ou bien caractérisée. En utilisant les procédures d'isolement cellulaire décrits dans les sections suivantes, nous sommes actuellement caractérisons cellules adventice du myocarde et d'enquêter sur leur potentiel pour les applications régénératives.

Nous décrivons ici un procédé pour isoler et purifier les deux sous-populations de cellules souches / progénitrices du myocarde périvasculaire adultes ou fœtaux humains. Cette méthode d'isolement cellulaire prospective permettra aux chercheurs d'obtenir des sous-ensembles de cellules souches / progénitrices périvasculaires isogéniques à partir de biopsies cardiaques humaines pour des études comparatives et further explorer leur potentiel thérapeutique dans divers états pathologiques cardiaques.

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Protocol

1. Traitement des Cardiac Human Sample

  1. Veiller à ce que tous les fluides, les conteneurs, les instruments et la zone opérationnelle dédiée sont stériles.
  2. Placer l'échantillon de tissu cardiaque (acquis par la banque de tissus ou de l'équipe chirurgicale) dans un milieu de stockage composé de Eagle modifié le milieu de réfrigéré Dulbecco (DMEM) contenant 20% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) sur la glace 3 pour le transport.
  3. Retirer l'échantillon cardiaque à partir du support de stockage et laver avec un agent de lavage composé d'un tampon phosphate salin (PBS) supplémenté avec 2% de FBS et 1% P / S. Lors de la manipulation de l'échantillon, utilisez une pince fine à pointe pour saisir les grands navires ou péricarde et minimiser l'écrasement du myocarde.
  4. Immerger l'échantillon dans un milieu de lavage dans une boîte de Pétri et enlever le péricarde, l' endocarde et gros vaisseaux sanguins avec stérilisées iris ciseaux et des pinces à pointe fine comme décrit 3.
  5. Couper le reste myocardium en petits morceaux d'environ 1 mm 3 en utilisant une seule lame de rasoir de côté ou une paire de ciseaux pointus iris. Note: Les plus hauts rendements cellulaires seront obtenus si les échantillons sont traités immédiatement. Si le retard est inévitable, le stockage du tissu cardiaque traité dans le support de stockage fraîche (> 5 ml par 1 cm 3 de tissu) à 4 ° C pendant jusqu'à 72 heures est possible, cependant vraisemblablement avec une diminution associée au rendement cellulaire.

2. La digestion du tissu et des cellules d'isolement

  1. Fraîchement préparer la solution de digestion comprenant 1,5 ml chacune de collagénase I, collagénase II, et de la collagénase IV (tous à 0,5 mg / ml dans DMEM) et chaude à 37 ° C dans un bain-marie.
    Note: Le volume et la concentration de collagénase sont appropriés pour des échantillons d'environ 1 cm3.
  2. Filtrer les morceaux de tissu en suspension à travers un tamis de 100 um et laver deux fois avec du PBS. Transférer les morceaux de tissu dans un récipient de 30 ml stérilesun couvercle étanche.
    Remarque: pots larges courtes plutôt que de tubes hautes et étroites donnent de meilleurs résultats. Vous pouvez aussi mettre des morceaux de tissus dans un tube de 50 ml stérile et placer horizontalement si un conteneur de 30 ml ne sont pas disponibles.
  3. Ajouter toutes les solutions de digestion (4,5 ml au total) et placez le récipient dans un sac en plastique scellé dans un secouant bain à 37 ° C de l'eau fixé à 120 rpm. Sinon, sceller le récipient avec un film de paraffine et placer dans un agitateur orbital chauffé réglé à 120 rpm.
  4. Après 15 minutes, retirer et retourner le pot à trois reprises avant de remplacer pendant encore 15 min. Retirer et étancher les collagénases avec 5 ml de DMEM supplémenté avec 20% de FBS et 1% P / S.
  5. Triturer le digest par pipetage dix à vingt fois avec une pipette de 10 ml sérologique pour briser les mottes de tissus. Filtrer la suspension séquentielle à 100 um, 70 um et enfin 40 crépines de cellules um pour éliminer les matières non digérées et d'obtenir une suspension cellulaire unique.
    Remarque:Ne pas rincer entre crépines de cellules pour éviter la cellule debrisgenerated par le processus de digestion enzymatique.
  6. Centrifuger la suspension de cellules à 200 g pendant 4 minutes, décante avec soin le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges pendant 2 minutes à la température ambiante avant de le diluer avec 4 ml de milieu de lavage.
  7. Répéter l'étape de centrifugation et remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de lavage. Bien mélanger et prendre 10 pi de la suspension cellulaire pour le comptage des cellules.
  8. Mélanger 10 ul de la suspension cellulaire avec 10 pi de bleu trypan et de placer la tache 10 ul du mélange sur un hémocytomètre standard pour le comptage des cellules. Comptez le nombre de cellules lumineuses, rondes présents dans les quatre cases de coin (chacun subdivisé en seize petits carrés) et diviser par 4 pour obtenir la moyenne par carré de coin. Multipliez la moyenne de 2 pour tenir compte du facteur de dilution tache, puis par 10 4 pour obtenir le nombre total de cellules par 1 ml d'échantillon.

  1. Ajouter 50 ul de sérum de souris à la suspension cellulaire et on incube à 4 ° C pendant 20 minutes pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique.
  2. Centrifuger la suspension de cellules avec du sérum de souris à 200 g pendant 4 mn, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de lavage à une concentration de 1 x 10 6 cellules par 100 pi.
  3. Aliquote de 50 ul de chaque suspension cellulaire pour le contrôle isotypique et non colorées en deux polystyrène à fond rond de cytométrie de flux des tubes puis placer le volume restant dans un troisième tube destiné à la coloration multi-couleurs.
  4. Ajouter CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, et des anticorps CD146-AF647 (tous 1: 100) à la suspension cellulaire unique pour multi-couleur coloration. Pour le contrôle isotypique, ajouter des volumes équivalents de PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- et des anticorps isotypiques AF647 conjugués. Doucement une pipette pour mélanger les anticorps avec les cellules et incuber tous les tubes à 4 ° C pendant 20min dans l'obscurité.
  5. Préparer des perles de commande de compensation en ajoutant une goutte de billes positives à 100 ul de milieu de lavage dans cinq polystyrène tubes ronds cytométrie de flux de fond. Ajouter CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, PerCP-CD144-Cy5.5 et des anticorps CD146 (AF647-tout 1: 100) individuellement à chacun des 5 tubes. Incuber tous les tubes à 4 ° C pendant 20 min dans l'obscurité.
  6. Pendant l'incubation, préparer des tubes de prélèvement de cellules chacune avec 500 pi de croissance endothélial Moyen-2 (EGM-2) milieu de culture et lieu à 4 ° C.
  7. Après anticorps incubation, ajouter 5 ml de milieu de lavage pour laver les cellules et les perles afin d'éliminer l'anticorps non lié. Centrifuger tous les tubes à 200 g pendant 4 min. Répéter l'étape de lavage et la centrifugation. Décanter avec soin le surnageant et la pipette doucement lorsque les cellules remise en suspension.
  8. Remettre en suspension dans un milieu de lavage à une concentration d'environ 1 x 10 6 cellules par 250 pi. Remettre en suspension les billes dans 100 pl de lavage moyen.
  9. Transport toutes les cellules et perles suspensions à la trieuse de cellules sur la glace dans l'obscurité. Ajouter 1 goutte de perles négatives pour les tubes de commande de compensation de perles positives et les utiliser pour régler la compensation de fluorescence.
  10. Exécutez les cellules témoins non colorées selon les instructions du fabricant pour établir la fluorescence de fond et de régler les tensions sur les points suivants: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. Exécuter les contrôles isotypes selon les instructions du fabricant pour établir les seuils de fond de fluorescence liés à la liaison non spécifique. Exécutez le multi-couleur échantillon coloré et recueillir les péricytes et les populations de cellules adventice dans les tubes de prélèvement (Figure 1).
    REMARQUE: Les rendements de cellules viables optimales sont d'environ 3% de la dissociation totale des cellules vivantes pour les péricytes et 4% pour les cellules de l'adventice.

4. Culture cellulaire

  1. Sélectionnez appropriés des plaques de culture de taille en fonction du résultat du tri FACS. Ajouter 100 ul d' une solution stérile de gélatine à 0,2% par cm 2 de surface de croissance et agiter manuellement pour recouvrir la totalité du puits. Incuber les plaques à 4 ° C pendant 10 min et éliminer la solution de gélatine complètement. Gardez les cellules recueillies sur la glace lors de la préparation des plaques de culture.
    Note: péricytes fraîchement triées et des cellules adventices poussent bien si elles sont ensemencées à une densité de 30.000 à 40.000 cellules / cm 2 sur la surface de culture revêtues de gélatine.
  2. Centrifugeuse cellules fraîchement recueillies à 200 xg pendant 4 min et doucement remettre en suspension le culot cellulaire dans une quantité appropriée d'EGM-2.Seed les cellules sur des plaques revêtues de gélatine.
    Note: Le nombre réel de cellules pour ensemencer chaque puits et la quantité d'EGM-2 à ajouter dépendent de la sélection de la plaque. Par exemple, 0,5 ml et 1 ml d'EGM-2 sont nécessaires par puits pour les plaques 48 et 24 puits, respectivement.
  3. Échange EGM-2 pour le milieu de croissance des cellules périvasculaires (DMEM supplémenté avec 20% de FBS et 1% de P / S) pour les péricytes et les cellules de l'adventice fois que les cellules sont installées et collé à la plaque (après au moins 72 heures). Changer les médias tous les 72 heures à partir de là. Effectuer les incubations subséquentes initiales et tous à 5% de CO 2 et à 37 ° C.
  4. Dissocier les cellules en utilisant 0,05% de trypsine EDTA lorsque péricytes et les cellules de l'adventice peut atteindre 80 à 90% de confluence. Étancher avec 20% de FBS dans du PBS, centrifuger à 200 g pendant 4 minutes, remise en suspension dans un milieu de croissance des cellules périvasculaires, puis passage des cellules à un rapport 1: 3 non revêtues sur des plaques de culture en polystyrène. A partir de passage 2 et suivantes, les cellules de passage à un rapport 1: 5 (ou à environ 7000 cellules / cm2) sur des plaques ou flacons de culture en polystyrène non revêtues.

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Representative Results

Les cellules individuelles ont été distinguées des débris et des doublets sur la base de l'avant et une diffusion latérale de distribution. Les cellules vivantes ont été identifiés par leur incapacité à prendre le colorant DAPI. La stratégie d'ouverture de porte a été choisie sur la base du marquage de contrôle d'isotype de ce temps réel, la dissociation des cellules entières cardiaque (figure 1). A partir des cellules vivantes, cellules CD45 + ont d' abord été déclenchés, suivie d'CD56 + cellules. Les cellules endothéliales CD144 + ont ensuite été retirées de la CD56 - fraction. De cette population finale, CD146 + / CD34 - péricytes et CD146 - cellules CD34 + / adventice ont été sélectionnés et ensuite recueillies (Figure 2). Immédiatement après le prélèvement de cellules, un petit échantillon de chaque sous-population (500-1000 cellules) a été ré-exécuter à travers le trieur pour confirmer que la distribution cellulaire était aussi enregistrée dans le tri initial. peric de l'infarctus du FACS purifié YTES et des cellules adventitielles présentent toutes deux un axe de morphologie stellaire des cellules en culture (Figure 3).

Figure 1
Figure 1: Stratégie. Gating FACS points représentatifs des parcelles de contrôle isotypique marqué dissociées cellules cardiaques humaines illustrent le positionnement des portes de tri .. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: FACS Purification de cellules myocardiques périvasculaires tri représentatif des deux sous - populations de cellules précurseurs périvasculaires cardiaques à partir d' un seul échantillon du myocarde humain..es / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Périvasculaire Morphologie des cellules en culture Les deux populations périvasculaires cardiaques de cellules précurseurs, péricytes (panneau de gauche) et les cellules adventice ( à droite) ont été classifiées jusqu'à homogénéité par purification FACS et encore élargi dans la culture (au passage 3, barres d'échelle = 50 pm ). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Des preuves croissantes supporte une capacité de régénération limitée du cœur humain adulte après une blessure. Identification et caractérisation des cellules précurseurs natifs responsables de ces réactions de régénération dans les cœurs blessés sont essentiels tant pour la compréhension des mécanismes et voies de signalisation associées et le développement d'approches à utiliser ces cellules thérapeutiquement.

Protocoles précédents ont décrit l'isolement des périvasculaires sous - ensembles de cellules précurseurs du muscle squelettique humain 25. Toutefois, l'application directe de ces techniques aux tissus cardiaques entraîne souvent des rendements cellulaires très médiocres. Par conséquent, nous avons fait des ajustements majeurs dans le protocole afin d'enrichir deux sous-populations distinctes de cellules précurseurs périvasculaires, à savoir les péricytes et les cellules adventice, des biopsies myocardiques humaines et de faciliter la purification simultanée des deux sous-ensembles. L'isolement des deux populations de cellules à partir des séchantillon amme non seulement optimise l'utilisation de biopsies de tissu cardiaque précieux, mais permet également une comparaison directe des sous-ensembles de cellules périvasculaires distinctes.

Afin d'obtenir le rendement maximal de cellules, la fraîcheur de l'échantillon de tissu est d'une importance critique. Les rendements maximaux de cellules viables pour les péricytes et les cellules de l'adventice est d'environ 3% et 4% de la dissociation totale des cellules vivantes, respectivement. Les rendements peuvent varier considérablement d'environ 30.000 à 400.000 cellules par sous-ensemble et sont fortement tributaires d'un certain nombre de facteurs, y compris la quantité et la qualité du tissu de départ et la durée de conservation. les cellules périvasculaires sont relativement délicate; échantillons présentant des signes de changement autolytique donnent invariablement faible nombre de cellules après FACS. De même, les cellules périvasculaires sont sensibles aux techniques de digestion dure et plus digestion entraînera également un rendement en cellules viables réduite. ajustements sur mesure du temps de digestion et de la vitesse d'agitation peut être nécessaire par individual laboratoires. Enfin, l'âge du donneur et la taille de l'échantillon auront également un impact majeur sur le rendement des cellules.

Nous avons largement caractérisées péricytes cardiaques obtenues de cette manière 3. Ces cellules ont démontré une homogénéité dans la culture sans contamination des cellules endothéliales. Population fois d'environ 60 heures entre les passages 3 et 12 doublement ont été notés avec l'expression cohérente des deux marqueurs de péricytes communs (la phosphatase alcaline, NG2 et α-SMA) et des marqueurs de MSC classiques (CD44, CD73, CD90 et CD105) au cours de cette période. Curieusement, il a été constaté que, après déméthylation, une fraction de péricytes cardiaque exprimé la transcription cardiomyogénique Facteurs et Nkx2.5 GATA4. Lors de la co-cultivées avec des cardiomyocytes de rat nouveau-né, une fraction de péricytes cardiaque déméthylés exprimé les marqueurs de protéine alpha-actinine et sarcomère troponine cardiaque T, avec un groupe mineur présentant en outre des flux spontanés de calcium cytoplasmiques. Pris ensemble, ces résultats Suggest qu'une sous-population de péricytes cardiaques possède un potentiel cardiomyogénique et peut donc jouer un rôle dans le processus de réparation du myocarde intrinsèque. En comparaison avec les péricytes, cellules adventice cardiaques restent largement non caractérisés. Nos données préliminaires non publiées suggèrent que les cellules cardiaques adventice expriment certains marqueurs de péricytes, tels que PDGFR-β et NG2, quoique à des niveaux inférieurs à ceux péricytes cardiaques, tandis que la perte de CD34 dans la culture. Ces cellules expriment également des marqueurs de MSC classiques et montrent ostéogénique et le potentiel de différenciation adipocytaire. D'autres études de cellules adventice cardiaques, y compris des propriétés angiogéniques et pro-cardiogénique sont en cours.

Le protocole décrit ici permet simultanément, la purification prospective des pericytes et des cellules cardiaques adventice à partir d'un seul échantillon de tissu cardiaque humain. Ces cellules représentent les populations de cellules précurseurs cardiaques nouveaux ayant des propriétés cardiomyogéniques potentiels qui peuvent se révéler appropriée candidates pour les futures thérapies cellulaires.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

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References

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