Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos

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Summary

Métodos se demuestran para el aislamiento de miocitos nódulo sinoauricular (SAMs) de ratones adultos para estudios de electrofisiología de pinzamiento zonal o de formación de imágenes. Las células aisladas se pueden utilizar directamente o se pueden mantener en cultivo para permitir la expresión de proteínas de interés, tales como la prensa codificados genéticamente.

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Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice. J. Vis. Exp. (116), e54555, doi:10.3791/54555 (2016).

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Abstract

miocitos nodo sinusal (SAMs) actúan como los marcapasos naturales del corazón, iniciando cada latido del corazón mediante la generación de potenciales de acción espontáneos (APs). Estos puntos de acceso de marcapasos reflejan la actividad coordinada de numerosas corrientes de membrana y el ciclo de calcio intracelular. Sin embargo, los mecanismos precisos que impulsan la actividad de marcapasos espontánea en SAMs siendo difícil de alcanzar. Aguda SAMs aisladas son una preparación esencial para experimentos para diseccionar la base molecular de marcapasos cardíaco. Sin embargo, la anatomía indistinto, microdisección compleja, y las condiciones de digestión enzimática meticulosos han impedido el uso generalizado de forma aguda aislada SAM. Además, los métodos no estaban disponibles hasta hace poco para permitir el cultivo a largo plazo de las SAM para estudios de expresión de proteínas. Aquí nos proporcionan una demostración de protocolo y de vídeo paso a paso para el aislamiento de las SAM de ratones adultos. Un método también se demuestra para el mantenimiento de ratón adulto SAMs in vitro y para expressien de proteínas exógenas a través de la infección adenoviral. Aguda aislados y SAMs cultivadas preparadas mediante estos métodos son adecuados para una variedad de estudios electrofisiológicos y de formación de imágenes.

Introduction

miocitos marcapasos en el nodo sinusal del corazón (miocitos sinoauricular, "SAM") generan, los potenciales de acción espontáneos rítmicos (APs) que se propagan a través del miocardio para iniciar cada latido del corazón. Los experimentos utilizando SAMs aisladas de forma aguda a partir de muchas especies han sido esenciales para el esclarecimiento de los mecanismos que contribuyen a la generación de actividad marcapasos. SAM son cardiomiocitos altamente especializadas que difieren sustancialmente de sus contrapartes en el miocardio auricular y ventricular en términos de morfología, función y expresión de la proteína. El sello distintivo de los puntos de acceso espontáneas en SAMs es una despolarización espontánea durante la diástole que impulsa el potencial de membrana de umbral para activar la siguiente AP 1,2. Este "potencial marcapasos" depende de la actividad coordinada de muchos diferentes corrientes de membrana incluyendo la "divertida actual" (I f), T y de tipo L corrientes de calcio, y el curr intercambiador de sodio-calcioent (I NCX), que es impulsada por la liberación de Ca2 + desde el retículo sarcoplásmico 3,4.

Si bien de forma aguda aislado ratón SAMs son una preparación experimental esencial para el estudio de marcapasos, el aislamiento de SAMs de ratones puede ser un método difícil de adoptar porque la anatomía indistinta y el pequeño tamaño del ratón SAN requiere una microdisección matizada y la enzimática combinada y mecánico la disociación de las células requiere una cuidadosa optimización.

Proporcionamos aquí una demostración de vídeo detallada de un protocolo que ha sido utilizado con éxito para aislar SAMs de ratones adultos para las grabaciones de patch clamp 5-8. Hasta donde sabemos, no existe tal demostración visual disponible de cualquier otra fuente. Además, un nuevo método se demuestra en las que los aislados SAMs de ratones adultos se pueden mantener in vitro durante varios días, lo que permite la introducción de proteínas, codificados genéticamenteLas moléculas indicadoras o ARNi a través de la infección por adenovirus 9.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus. El protocolo estándar por debajo se ha optimizado el uso de macho C57BL / 6J de 2-3 meses de edad.

1. Preparar existencias y suministros de soluciones en anticipación de Experimentos

NOTA: Consulte la Tabla materiales para el equipo y los suministros necesarios.

  1. Preparar 1 L cada una de las soluciones siguientes como se indica en la Tabla 1:, Low Ca 2 + / Mg2 + Tyrode de, Modificado Kraft-Brühe (KB) de soluciones, y albúmina de suero bovino (BSA) Solución completa de Tyrode. Uso ultrapura filtra agua desionizada para todas las soluciones. Dividir cada solución en alícuotas de 50 ml y se almacena a 20 ° C durante un máximo de seis meses. Descongelar alícuotas individuales inmediatamente antes de los experimentos, y almacenar hasta por una semana a 46; C.
  2. Preparar 50 ml de NaCl 10 mM y CaCl 2 mM Solución Adaptación 1,8 disolviendo NaCl y CaCl 2 en ultrapura filtrada agua desionizada (Tabla 1). Almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de seis meses.
  3. Preparar alícuotas 4.75 unidad de actividad enzimática (U) de la elastasa con la pipeta en tubos de microcentrífuga. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de tres meses.
  4. Preparar 375 g alícuotas (en H2O ultrapura) de la mezcla de enzimas colagenasa-proteasa con la pipeta en tubos de microcentrífuga. Almacenar a -20 ° C durante un máximo de tres meses.
  5. Preparar dos pipetas Pasteur pulidas al fuego, uno para la transferencia de tejido (~ 1,5 mm diámetro de la abertura final; Figura 1Aiv y la Figura 1C) y una para la disociación (~ 2 mm de diámetro; Figura 1Aiii y la Figura 1C).
    1. Score pipetas Pasteur con un cortador de vidrio y encajan a presión a lo largo de la puntuación para producir una apertura ligeramente más grande que el tamaño deseado. Fuego-Polaco el extremo cortado de cada pipeta de ~ 30-60 segundos a fuego lento en un mechero Bunsen para producir una pared pulida de espesor y una abertura del diámetro deseado. Asegúrese de que la abertura pulida al fuego está libre de grietas o asperezas.
  6. Preparar dos platos de disección mediante la adición de ~ 25 ml de elastómero de silicona mezclado de acuerdo con las instrucciones del fabricante a cada 100 mm placa de Petri (Figura 1ai y la Figura 1B). Deje curar a temperatura ambiente durante 48 hr.
  7. Para la cultura única: preparar a 25-50 ml cada medio de baño y Medio de cultivo según la Tabla 2 de la tienda para un máximo de dos semanas a 4 ° C..

2. Preparar soluciones que han de utilizarse en el Día de aislamiento de células

NOTA: Las siguientes son las cantidades para el aislamiento de miocitos sinoauricular de un ratón.

  1. Añadir 2,5 ml de bajo Ca 2 + / Mg2 + de Tyrode (pH 6,9) a cada uno de tres tubo de cultivo pequeño, de fondo redondos. Colocar los tubos en baño de agua a 35 ± 1 ° C.
  2. Añadir 2,5 ml de Baja Ca 2+ / a un gran tubo de cultivo de fondo redondo de Mg 2+ Tyrode. Para este tubo, añadir 1 parte alícuota (4,75 T) elastasa y una alícuota (375 mg) mezcla de enzimas colagenasa-proteasa. Agitar para mezclar. Colocar el tubo en el 35 ± 1 ° C baño de agua.
  3. Añadir 2,5 ml de KB medio a tres, tubos de cultivo adicionales pequeñas-de fondo redondo y un tubo adicional grande, de fondo redondo de cultura. Colocar los tubos en baño de agua a 35 ± 1 ° C.
  4. Añadir ~ 7 ml de solución de BSA a una gran tubo de cultivo con fondo. Mantenga este tubo a temperatura ambiente.
  5. Coloque 20-40 ml de solución de Tyrode completo en un vaso de 50 ml (Figura 1Aii). Añadir 10 USP / ml de heparina, agitar para mezclar y colocar el vaso de precipitados en el baño de agua ° C 35 ± 1.

3. Preparar soluciones y materiales adicionales para células cultivadas (omitir estos pasos para células aisladas de forma aguda)

  1. En una campana de cultivo de tejido estéril, colocar dos de 12 mm cubreobjetos de vidrio redondos por ratón en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
    NOTA: La placa de 24 pocillos se utiliza debido a que los pozos son de un tamaño conveniente, que sirve para limitar el volumen de las infecciones virales posteriores.
  2. Pipeta aproximadamente 200 l de una solución de 100 ng / ml de laminina de ratón diluido en tampón fosfato salino (PBS) a cada cubreobjetos.
  3. Incubar cubreobjetos con laminina para la duración del aislamiento (al menos 1 hr) en una incubadora a 37 ° C.
  4. Pre-caliente el medio de baño y medio de cultivo (del Paso 1.7 y en la Tabla 3) a 37 ° C.

4. Aislamiento Sinoatrial Nodo

  1. En una campana de humos químicos, coloca un ratón en una cámara de una caja de dos cámaras y anestesiar con ~ 200 l isoflurano líquido introducido a través de un hisopo de algodón en la otra cámara. Confirmar la anestesia (generalmente dentro de ~ 30-60 seg) con una pizca dedo del pie. La eutanasiaratón por dislocación cervical.
    NOTA: Una caja de punta de la pipeta 1 ml vacío se puede usar para formar la caja de dos cámaras; gire el bastidor boca abajo en la caja para crear el compartimiento separado para el isoflurano para evitar que el ratón entre en contacto con él directamente.
  2. Retire la piel del pecho con las tijeras y la costilla transecto jaula para exponer la cavidad torácica utilizando pinzas externas de tejido (Figura 1Aviii) y tijeras de disección (Figura 1Avix). Bañar la cavidad torácica con ~ 2 ml calentaron completa de Tyrode con heparina usando una pipeta de transferencia.
    NOTA: Continuar cavidad torácica baño cuando sea necesario, no permita que la preparación se seque.
  3. Bajo un microscopio de disección, retirar con cuidado los pulmones y el timo con una tijera internos (Figura 1Avi) y pinza de disección (Figura 1Avii).
  4. Mientras sujeta suavemente el ápice del corazón con las pinzas de disección internos, cortar cuidadosamente la vena cava inferior y la unaorta con las tijeras internos para eliminar el corazón de la cavidad torácica. Transferir el corazón de uno de los platos de disección de silicona y se bañan con ~ 4 ml calentado heparinizada completa de Tyrode usando la pipeta de transferencia.
  5. Oriente el corazón de tal manera que los vasos posteriores son visibles y mirando hacia arriba, con la aurícula derecha del animal a la derecha del experimentador y la aurícula izquierda a la izquierda del experimentador. Una vez orientado, inmovilizar el corazón tras cubrir a través del vértice en el plato de la disección de silicona.
  6. Busque la ranura entre los ventrículos y las aurículas (claro anillo encima de los ventrículos).
  7. Uso de las tijeras de disección internos, hacer una incisión en la ranura, manteniendo más cerca de los ventrículos que las aurículas. Enjuague la ranura y la incisión con Tyrode completa heparinizada calentado adicional de que sea necesario para permitir una visión clara de las aurículas y las válvulas. Continuar el corte a lo largo de la ranura para separar las aurículas de los ventrículos.
  8. Transferir el tejido auricular para el segundo plato de la disección de silicona y bañarse con ~ 3 ml calentado heparinizada completa de Tyrode.
  9. Oriente el tejido de manera que aurícula derecha del animal ya está a la izquierda del experimentador, y la aurícula izquierda está a la derecha.
    NOTA: La aurícula derecha es más transparente, mientras que la aurícula izquierda tiene más de un tono rojo oscuro.
  10. Pin el tejido a través de la vena cava inferior y superior y la derecha y la izquierda apéndices auriculares, que se extiende suavemente la preparación. Eliminar cualquier tejido graso u otro restante para permitir una visión clara de la preparación (tener cuidado de no cortar en la pared auricular, ya que el nodo sinusal es muy delicada y puede dañarse fácilmente).
  11. Abra la pared anterior de la aurícula cortando a través de la vena cava. Vuelva a colocar los pines como sea necesario para visualizar el tabique interauricular.
  12. Corte a lo largo del tabique interauricular para eliminar la aurícula izquierda. Re-Pin la preparación, estirando suavemente.
  13. Retire tque orejuela derecha y liberar el nodo sinusal cortando a lo largo del terminalis crestas, que aparece como una raya de color naranja oscuro bordeando el apéndice auricular.
  14. Vuelva a fijar el tejido ganglionar y cortar lateralmente (perpendicular a la cresta terminal) para producir tres franjas de igual tamaño.

5. Nodo sinoauricular Digestión

  1. Utilizando el estrecho pipeta pulida al fuego (Figura 1Aiv), la transferencia de las tres tiras de tejido nodo sinusal en el primero de los tres pequeño tubo de fondo redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 + / Mg2 + Tyrode en el 35 ± 1 ° C baño de agua. Incubar durante 5 min.
  2. Tiras de tejido de transferencia al segundo tubo inferior pequeño y redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 + / Mg2 + Tyrode en el baño de agua ° C 35 ± 1, utilizando la misma pipeta estrecha. Se lavan las tiras de tejido suave por girar el tubo o pipeteando suavemente con la pipeta estrecha. No Invert el tubo.
  3. Tiras de tejido transferencia al tercer tubo inferior pequeño y redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 + / Mg2 + Tyrode, y repetir la etapa de lavado se describe en el paso 5.2.
  4. Tiras de transferencia en el tubo grande de fondo redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 + / Mg2 + de Tyrode con enzimas (elastasa, más mezcla de colagenasa-proteasa) en el 35 ° C baño de agua. Asegúrese de que las tres tiras de tejido están presentes. Incubar durante 10-15 minutos a 35 ± 1 ° C. Mezclar cada 5 min agitando suavemente el tubo. No invierta el tubo.

6. Nodo sinoauricular miocitos disociación

  1. Después de la digestión con enzimas, utilice el estrecho pipeta pulida al fuego para transferir suavemente las tiras de tejido a la primera pequeño tubo de fondo redondo que contiene 2,5 ml de solución de KB a 35 ± 1 ° C. Lavar el tejido girando suavemente el tubo.
    Nota: Las tiras de tejido por parecer algo translúcidos y pueden agruparse en el thes el punto. Manejar con mucho cuidado después de la digestión enzimática para evitar la pérdida de células.
  2. Transferir el tejido para el segundo tubo de fondo redondo pequeño que contiene 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitar suavemente para lavar.
  3. Transferir el tejido a la tercera pequeño tubo de fondo redondo que contiene 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitar suavemente para lavar.
  4. Transferir el tejido al tubo grande, de fondo redondo que contiene 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C.
  5. Usando la pipeta pulida al fuego más grande (Figura 1Aiii y la Figura 1C), disociar las células en el tubo grande de fondo redondo por trituración constante en aproximadamente 0,5 a 1 Hz durante 5-10 minutos, teniendo cuidado de mantener el tubo de disociación sumergido en el 35 ± 1 ° C baño de agua y para evitar la introducción de burbujas en la solución.
    Nota: El tiempo de trituración varía con el diámetro de la pipeta de la disociación y la fuerza de la pipeta. El tiempo debe ajustarse de modo que las piezas de tejido restante en tél final de la disociación parece delgada, transparente y tenue. Si el tejido retiene cualquier color, la disociación es probable que sea incompleta. Frecuencia (0,5-1 Hz) se determina con la mano.
  6. Retire el tubo de fondo redondo que contiene disociado SAMs del baño de agua y se equilibre a temperatura ambiente durante 5 min.

7. Sinoatrial calcio Nodo Readaptación (Realizado a temperatura ambiente)

NOTA: Para SAMs destinado a los experimentos de cultivo, los procedimientos descritos en la sección siguiente se debe realizar en una campana de cultivo de tejido estéril. Si SAMs se van a utilizar para los experimentos agudos, no hay necesidad de realizar estos pasos en un ambiente estéril.

  1. Añadir 75 l de NaCl / CaCl solución 2 adaptación (Tabla 2). Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 5 minutos.
  2. Añadir 160 l de NaCl / CaCl solución 2 adaptación. Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 5 minutos.
  3. Añadir 390 l de BSA al solution (Tabla 2). Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 4 min.
  4. Añadir 1,25 ml de solución de BSA. Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 4 min.
  5. Añadir 4,37 ml de solución de BSA. Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 4 min.
    Nota: La concentración final de calcio será de 1,8 mM.
  6. Después de calcio readaptación, recoger las SAM, permitiendo que conformarse por gravedad por unos 10 minutos o por centrifugación a 2.000 xg durante ~ 3 min.
    1. Para las células aisladas de forma aguda, suavemente retirar y desechar aproximadamente 5 ml del sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio, dejando las células en un volumen de ~ 2 ml. Almacenar estas células a temperatura ambiente durante un máximo de ~ 8 horas para las grabaciones de patch clamp.
    2. Para las células cultivadas, eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril. Resuspender pellet de células en 1 ml de pre-calentado (37 ° C) Revestimiento del Medio (Tabla 2).

8. Chapado y Cultura de Sinoatrial Myocitos (Saltar de células aisladas de forma aguda)

  1. Retire la solución de laminina de cubreobjetos de la Etapa 3.3 con una pipeta Pasteur. Inmediatamente sembrar 500 l (~ 50-100 células) en cada cubreobjetos recubiertos de laminina (procedente de la etapa 3).
    NOTA: El inhibidor contráctil 2,3-butanodiona monoxima (BDM) está incluido en los medios de comunicación de placas de cultivo y para evitar la contracción, lo que provoca el desgaste de las células 9.
  2. Devolver la placa de 24 pocillos que contiene SAM recién sembrados a la incubadora y mantener a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire / 5% de CO 2. Permitir que las células se adhieran a cubreobjetos durante 4-6 h en medio de siembra (Tabla 2).
  3. Retire con cuidado medio de baño con una pipeta Pasteur estéril. Reemplazar con 500 l por pocillo de pre-calentado (37 ° C) Medio de cultivo (Tabla 2).

9. Transducción adenoviral de adulto Los cultivos de miocitos sinoauricular (Pase de células aisladas de forma aguda)

  1. Estimar el número de ceLLS por cubreobjetos inmediatamente antes de aplicar adenovirus contando las células en un campo de visión en el microscopio, con ajuste de ampliación. Contar todas las células, no sólo SAM.
  2. Diluir adenovirus en un medio 199 y ajustar la dilución para el título viral lo que se requiere que la aplicación de 1 a 10 l para lograr una multiplicidad final de la infección (MOI) de 100 unidades virales por célula. Añadir solución adenoviral de una manera gota a gota directamente sobre SAMs plateado.
  3. Se incuban las células con el medio durante la noche que contiene el virus (~ 12-14 hr). Entonces intercambiar con medio de cultivo fresco. Mantener las células en la incubadora, el cambio de medio de cultivo cada 48 horas, hasta que se obtiene la expresión de proteína deseado.

10. La evaluación funcional de forma aguda aislada o cultivada SAMs

NOTA: El siguiente protocolo es un ejemplo de las evaluaciones funcionales de las SAM aislado utilizando el anfotericina técnica de parche perforado para grabar ambos puntos de acceso espontáneas y yo 9).

  1. Preparar soluciones de grabación como se describe en la Tabla 3.
  2. Preparar una solución madre de 20 mg / ml de anfotericina-B en DMSO fresco en el día de la grabación. Guardar la acción a temperatura ambiente y protegido de la luz. Diluir anfotericina-B de valores en solución intracelular a una concentración final de 200 ug / ml, justo antes del uso. Mantener la solución de la pipeta final sobre hielo y protegerlo de la luz.
    NOTA: La solución de la pipeta que contiene anfotericina-para los experimentos se debe preparar fresco cada hora mediante la dilución de una parte alícuota de la solución madre en la solución intracelular y agitación en vórtex durante al menos 1 min.
  3. Transferir una alícuota de la suspensión celular agudamente disociado SAM o un fragmento de cubreobjetos de vidrio que lleva cultivadas SAMs a una cámara de registro que contiene la solución de Tyrode a 35 ± 1 ° C. Perfundir células con solución de Tyrode durante al menos 2 minutos antes de la recordin electrofisiológicogs para eliminar cualquier BDM residual restante del medio de cultivo.
    NOTA: las contracciones espontáneas deben ser evidentes inmediatamente después de la transferencia a la solución de Tyrode. SAMs para la grabación puede ser identificado por una combinación de características que incluyen la actividad contráctil espontánea, morfología característica (por ejemplo., Figura 2), la falta de estrías, la expresión de la proteína HCN4, la presencia de corriente If, capacitancia de la membrana <50 pF, y espontáneas APs con formas de onda que incluyen una fase de despolarización diastólica y una carrera ascendente lenta.
  4. El uso de pipetas de vidrio de borosilicato con resistencias de 1,5-3,0 mO, llenar la punta con una solución intracelular faltaba anfotericina por inmersión durante 10-30 seg. A continuación, volver a llenar la pipeta con la solución que contiene anfotericina. Una junta unida por células GΩ se debe obtener lo más rápidamente posible. Si la formación del sello es difícil, aumentar el tiempo de llenado en la punta.
    NOTA: La resistencia de acceso debe ser continuamentemonitorizados después de la formación de la junta unida a células, y las grabaciones sólo deben iniciarse después de la obtención de una resistencia acceso estable de <10 mO.
  5. Para grabar los puntos de acceso espontáneas, conmutar el amplificador a modo de corriente-clamp rápido sin inyección de corriente.
    NOTA: 1 nM isoproterenol se incluye en la solución de Tyrode extracelular durante la grabación de los puntos de acceso para estabilizar la tasa de disparo, como se informó anteriormente 10.

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Representative Results

Los protocolos descritos aquí se han empleado anteriormente para aislar SAMs espontáneamente activo a partir de ratones adultos que son adecuados para una variedad de estudios de fijación diferente de parche 5-8. Además, los protocolos permiten SAMs aislados que se pueden mantener en cultivo durante hasta una semana. La transferencia de genes en las células cultivadas se puede lograr a través de la infección adenoviral 9. Los resultados presentados en esta sección se derivan de nuestro trabajo anterior y se muestran aquí como ejemplos de las características de las SAM agudamente aisladas y cultivadas.

Como se muestra en la Figura 2, de forma espontánea activo SAMs se puede mantener en cultivo durante hasta 6 días. Las células cultivadas conservan una morfología general de que es muy similar a la de la forma aguda aislado SAMs, sin cambios significativos en la longitud media, anchura, área de sección transversal, o capacitancia de la membrana de cultivaronlas células en comparación con las células aisladas de forma aguda (Figura 2B - E). Sin embargo, hubo desgaste del número de SAMs viable con el tiempo en cultivo. Por lo tanto, se recomienda que las culturas pueden preparar a partir de células agrupados de varios animales si el diseño experimental requiere extensos conjuntos de datos.

Un objetivo importante en el desarrollo del protocolo para el cultivo de miocitos sinoauricular de ratones adultos era crear un sistema que permita la expresión de proteínas exógenas en el contexto celular natural de adultos SAM. Se muestra un ejemplo de este tipo de expresión de la proteína en la figura 3 para el caso de las células co-infectados con virus que expresan las proteínas marcadoras fluorescentes GFP y mCherry. Se encontró que la expresión de proteínas era claramente evidente dentro de las 24 horas de la infección viral, y fue máxima para las proteínas de prueba dentro de 48 horas (Figura 3). Un MOI viral del 100 dio lugar a casi el 100% infeficiencia reflexión sin evidencia de toxicidad celular. Por el contrario, la transfección usando reactivos basados en lípidos no pudo producir en cualquier transferencia de genes detectables en adultos SAMs, incluso después de 72 h 9.

Caracterización funcional a través de la electrofisiología de pinzamiento zonal es crítica para la evaluación tanto de forma aguda aislaron y cultivaron las SAM. La Figura 4A muestra grabaciones de corriente-clamp típicos de los potenciales de acción espontáneos registrados a partir de las SAM de forma aguda aislada o cultivada utilizando la configuración de grabación de parche perforado anfotericina. Acción formas de onda potenciales fueron similares en los SAM agudamente aisladas y cultivadas y no hubo diferencia en el promedio de la tasa de disparos AP (Figura 4B).

I f es un sello de SAMs y los canales HCN4 que producen I f se utilizan como marcadores inmunocitoquímicos del nodo sinoauricular. De ahí la presencia de I f en grabaciones de patch clamp se puede utilizar para apoyar la idea de que las células son de hecho SAMs. Todas las SAMs agudas y cultivadas de forma espontánea activos descritos en este documento también exhibieron S i> 100 pA en respuesta a un escalón de tensión 1 seg a -120 mV. Para los resultados representativos se muestran aquí, las células se sometieron a perfusión con solución de Tyrode que contiene 1 mM BaCl 2 para bloquear las corrientes de K + (Tabla 3) y la dependencia del voltaje de la activación de la I f se ensayó por pasos de voltaje de hiperpolarización 3 seg -60--160 mV desde un potencial de mantenimiento de -50 mV, como hemos descrito previamente 5-8. La densidad de corriente se evaluó en respuesta a 3 seg impulsos de prueba de hiperpolarización a -150 mV desde un potencial de mantenimiento de -50 mV. No hubo diferencias significativas en ya sea el voltaje de la dependencia de la activación de la I f o el I f densidad de corriente entre agudamente aisladas y cultivadas SAMs (Figura 4C - D). Estos co-grabaciones de los puntos de acceso espontáneas y me f desde SAMs individuales requieren aproximadamente 9 minutos en total (incluyendo un lavado inicial de 2 min, 30-60 seg de puntos de acceso espontáneas en el modo de fijación de corriente, un cambio de solución de 2 minutos y aproximadamente 5 minutos para recoger suficientes datos de fijación de voltaje para describir la tensión de la dependencia de la activación de I f). Por lo tanto los datos que se muestran en la Figura 4C ilustran también la robustez de la preparación de células.

Figura 1
Figura 1: instrumentos de disección para el aislamiento y la disociación de ratón SAMs (A) Dos i 10 cm placas de Petri que contienen ~ 25 ml curados elastómero de silicona... Cada plato está precargado con 6-10 pequeños pasadores de disección para inmovilizar el tejido. Ii. 100 ml vaso de precipitados para la celebración completa de Tyrode en el 35 &# 176;... C baño de agua iii ancha (~ 2 mm de diámetro), pulido al fuego disociación pipeta iv estrecha (~ 1,5 mm de diámetro) de pipeta de transferencia v pulida al fuego pipeta de transferencia de plástico para la preparación de baño con Tyrode completo con... heparina. VI. Auto-apertura de las tijeras micro para los procedimientos de corte internos. vii. pinzas finas (tamaño de la punta de 0,06 x 0,02 mm) para la manipulación de tejidos internos. viii. fórceps del tejido, 5.5 en, 1 x 2 dientes de manipulación del tejido externo. ix. iris curvas tijeras en 4.3 para los procedimientos de corte externos. (B) Fotos de primer plano de disección destacando pequeños pasadores colocados en el plato de la disección. (C) Primer plano de la foto destacando pipeta de transferencia estrecha pulida al fuego (izquierda) y el fuego-pulido pipeta de boca ancha para la trituración mecánica (a la derecha). Haga clic aquí para ver una versio más granden de esta figura.

Figura 2
. Figura 2: aguda aislados y SAMs cultivadas son morfológicamente indistinguibles A:. Imágenes de campo claro de SAMs representante ya sea inmediatamente después del aislamiento (aguda) o después de 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, o 6 días in vitro B - D : media (± SEM) de longitud máxima, la anchura y el área de la sección transversal de forma aguda aislada frente al 48 hr culta SAM e:. media (± SEM) capacitancia de la membrana de las grabaciones de fijación de voltaje de SAMs aguda aislada o cultivada. Todas las comparaciones no son significativas: p> 0,05 frente aguda. Adaptado de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3: expresión adenoviral de proteínas exógenas en cultivaron SAMs campo brillante y las imágenes epifluorescentes de representante SAMs cultivadas que han sido infectados en una MOI de 100 para los adenovirus que expresan eGFP (verde) y mCherry (rojo), ya sea en 24 o 48 horas después. doble infección. Barra de escala = 20 micras. Reproducido de la referencia 9.

Figura 4
Figura 4: Caracterización electrofisiológica en cultivaron SAM A:. Representativos clamp grabaciones actuales de aislado de forma aguda (negro) o cultivados (gris) SAMs en solución de Tyrode que contenía 1 nM isoproterenol. Las barras de escala: 40 mV, 100 ms. B: media (± SEM) instantáneafrecuencia de disparo en aislados de forma aguda (negro; n = 6) o 48 horas cultivadas (gris; n = 14) SAMs C:. media normalizada (± SEM) relaciones conductancia tensión de S i en forma aguda aislada (negro; n = 8) o cultivados (gris; n = 14) SAMs Inserciones:.. familias actuales representativos de agudo (negro) o SAM cultivadas (gris) provocada por 3 seg pulsos de prueba de hiperpolarización -60 a -160 mV en incrementos de 10 mV D: Normal ( ± SEM) que la densidad de corriente F a -150 mV en forma aguda aislada (negro; n = 7) y cultivadas (gris; n = 8) SAMs. Adaptado de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

T completayrode de bajo Ca2 + / Mg2 + Tyrode Medio KB solución de BSA NaCl / CaCl Solución 2 Adaptación
NaCl 140 140 140 10
KCl 5.4 5.4 25 5.4
KH 2 PO 4 1.2 1.2 10 1.2
HEPES 5 5 5 5
glucosa 5.55 18.5 20 5.55
MgCl 2 1 1
CaCl 2 1.8 0,066 1.8 1.8
taurina 50 20
BSA 1 mg / ml 1 mg / ml 1 mg / ml
K-glutamato 100
K-aspartato 10
MgSO 4 2
creatina 5
EGTA 0,5
pH ajustado a 7,4 con NaOH 6,9 con NaOH 7,2 con KOH 7,4 con NaOH

Tabla 1:. soluciones de disociación Las composiciones de las soluciones utilizadas en la disociación de los miocitos nodo sinusal. Las concentraciones se dan en mm, excepto donde se indique.

Revestimiento del Medio Medio cultural
Media199 base base
monoxima 2,3-butanodiona (BDM) 10 mM 10 mM
Suero bovino fetal (FBS) 5% -
Albúmina de suero bovino (BSA) 0,1 mg / ml
Insulina 10 mg / ml
transferrina 5,5 g / ml
Selenio 5 ng / ml
Penicilina 100 U / ml 100 U / ml
Estreptomicina 100 mg / ml 100 mg / ml

Tabla 2: Revestimiento de cultivo y soluciones Las composiciones de las soluciones utilizadas para la siembra y cultivo de miocitos nodo sinusal..

Tyrode de PP intracelular
NaCl 140 5
KCl 5.4 135
KH 2 PO 4 1.2
HEPES 5 10
glucosa 5.55
MgCl 2 1 1
CaCl 2 1.8 0,1
EGTA 10
Mg-ATP 4
La anfotericina-B 200 mg / ml como necesarios
isoproterenol 1 nM, según sea necesario
pH ajustado a 7,4 con NaOH 7,2 con KOH

Tabla 3: soluciones de grabación de electrofisiología Las composiciones de soluciones extracelular (de Tyrode) e intracelular (PP) que se utilizan para la anfotericina grabaciones-parche perforado de miocitos nodo sinusal..

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Discussion

Este artículo presenta los protocolos detallados para el aislamiento y cultivo de miocitos completamente diferenciadas nodo sinusal a partir de ratones adultos. El protocolo de aislamiento produce de forma fiable SAMs espontáneamente activas de ratón adecuados, ya sea para el análisis electrofisiológico inmediata o posterior cultivo. Protocolos similares han sido reportados por muchos otros grupos (por ejemplo, véanse las referencias 11,12,10,13-17). Sin embargo, nuestro protocolo para el mantenimiento de ratón adulto SAMs in vitro preserva la morfología característica, actividad espontánea, y las propiedades electrofisiológicas de las células y permite la administración adenoviral de proteínas 9.

Para la modificación y resolución de problemas de los protocolos, deben tenerse en cuenta algunos pasos críticos. El primer factor crítico es una significativa variabilidad de lote a lote en la actividad de las enzimas que digieren (paso 1.4), que pueden alterar drásticamente el número y la calidad de las SAM aislado en un determinado preparación. Esta variabilidad es particularmente cierto para la elastasa, que normalmente requiere la optimización específica del lote, en el que los tiempos de concentración y de exposición se deben horquillado en el transcurso de varias preparaciones (a menudo hecho en paralelo) para maximizar el número de células y la salud. Algunos protocolos para el aislamiento de las SAM de diversas especies utilizan colagenasa y proteasa enzimas individuales en lugar de la mezcla de enzimas colagenasa-proteasa en el presente protocolo. Sin embargo, la variabilidad de lote a lote para cada uno de estas enzimas es bastante alta (similar a la de la elastasa), necesitando repetidas rondas de co-optimización. La mezcla de enzimas proporciona más consistencia a través de lotes y requiere menos pasos de optimización.

Una segunda crítica, y no evidente, factor de resolución de problemas del aislamiento SAM es la integridad de la pipeta de la disociación de vidrio pulida al fuego (Figura 1C). Si el borde de la pipeta contiene los bordes afilados, grietas o c acumuladoescombros ellular, la etapa de trituración mecánica puede dañar las células, dando como resultado toxicidad de calcio. La pipeta de disociación pulido al fuego debe ser reemplazado por lo menos cada 2 meses de uso regular, o en cualquier momento que el rendimiento celular o la calidad disminuye notablemente durante el curso de varias preparaciones.

El momento y la fuerza de la disociación mecánica es un tercer paso crítico para la solución de problemas del protocolo de aislamiento. La trituración requiere lenta (aproximadamente 0,5-1 Hz) pero contundente turbulencia durante 5-10 minutos. tasas más rápidas y tiempos reducidos también se pueden utilizar, pero es importante para evitar la introducción de burbujas o la generación de espuma en la solución. Cuando las muestras de nodo sinoauricular han sido completamente disociado, las tiras de tejido restantes deben aparecer tenue y de color blanco; sutil coloración rosa-ish indica la trituración incompleta. Cuando se examina en 200-400X magnificación, las células de las muestras preparadas de manera óptima tienen membranas de las células lisas, mientras que miem celularRanes de más digerida o sobre-trituró muestras tienen un aspecto de cráteres y estriado. En las células sanas, las contracciones se observan principalmente como sutil espasmos de los extremos de las células. Ondas de contracción son una muestra de las células dañadas, que pueden observarse a contraerse vigorosamente durante un breve periodo de tiempo, antes de Balling arriba. Una pipeta de disociación agrietado es la causa más común de este daño celular. En las muestras que han estado bajo digerido o bajo-tritura, las células están presentes como grupos de agregados o en lugar de células individuales, y un número significativo de contraer SAMs se pueden observar en los trozos de tejido restantes.

Cada usuario tendrá que optimizar individualmente la disociación. Aunque la digestión enzimática y los tiempos de disociación mecánica deben ser ajustados tanto, se recomienda mantener inicialmente el tiempo de digestión enzimática constante, mientras que la modificación del tiempo de disociación. ajuste fino adicional se basa principalmente en la capacidad del usuario para reconocer la unappearance de las piezas de tejido restantes en la terminación de la trituración - cuando las piezas son tenue y de color blanquecino, a continuación, la trituración se debe parar. La optimización es también necesaria para dar cabida a las variaciones en el nodo sinusal que acompañan a las diferencias de edad, sexo o raza de ratones. Por ejemplo, la disociación de las células de los animales de más edad 7 requiere reducción tanto en la digestión enzimática y disociación mecánica veces. Como pauta general, una preparación típica de unos 2-3 meses de edad, los rendimientos de sexo masculino C57BL / 6 ratones aproximadamente 50-200 viable Sams, de los cuales quizá 5-10 puede haber éxito patch-sujeta en sesión de un buen día de trabajo, en función de los experimentos . El rendimiento es considerablemente (~ 30%) inferior cuando los ratones más viejos se usan 7.

El éxito del protocolo de cultivo también se basa en unos pocos pasos clave. Ante todo, el éxito de un cultivo celular primario requiere una disociación de alta calidad, como se discutió anteriormente. Se recomienda THen la preparación de células agudamente aislado ser optimizado antes de tratar de mantener las células en cultivo. Un segundo factor crítico para las células cultivadas se encuentra en la selección de las células para los registros electrofisiológicos. Para obtener los mejores resultados, SAMs cultivadas seleccionadas para las grabaciones deben exhibir las contracciones espontáneas inmediatamente después de lavado del medio de cultivo que contiene BDM. Un inicio lento de las contracciones espontáneas sobre lavado de BDM es una muestra de las células enfermas.

El sistema de cultivo SAM tiene algunas limitaciones, más notablemente el tamaño muy pequeño del ratón SAN. Mientras que los métodos demostrados aquí permiten el número de células suficientes para estudios electrofisiológicos y de formación de imágenes, la cantidad limitada de tejido se opone a los análisis bioquímicos de la culta SAMs. Otra limitación de la técnica es que SAMs debe ser cultivadas en presencia del inhibidor de la miosina ATPasa reversible, BDM. Esta es una preocupación potencial porque BDM tiene otros efectos celulares, incluyendono específica actividad de la fosfatasa, la inhibición de la transcripción cardiaca factores de 19, y la inhibición de los canales de sodio, canales de calcio y los receptores de rianodina 20. Sin embargo, los datos muestran que la BDM tiene efectos mínimos sobre las propiedades morfológicas y electrofisiológicas de las SAM ensayadas aquí.

En futuras aplicaciones, parece probable que los métodos descritos aquí podrían adaptarse para preparar cultivos de SAM de mamíferos de mayor tamaño. En combinación con la transferencia de genes de adenovirus, tales cultivos podrían permitir manipulaciones genéticas de marcapasos en modelos animales grandes. La capacidad para introducir las proteínas de interés también proporciona para aplicaciones futuras en las que moléculas informadoras codificados genéticamente se pueden utilizar para sondear vías de señalización intracelular en SAMs.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgruard/Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes Fisher Scientific 352059
Large, round bottomed culture tubes Corning 14-959-11B
Elastase Worthington Biochemical LS002279
Liberase TM Roche 5401119001 Tissue dissociation solution
Heparin SAGENT Pharmaceuticals  NDC 25021-400-10
Mouse Laminin Corning CB-354232
12 mm round glass coverslips Fisher  12-545-80
24-well culture plate Fisher 08-772-1
Ad-mCherry Vector Biolabs 1767
Ad-eGFP Vector Biolabs 1060
Plastic, disposable transfer pipette Fisher Scientific
Micro scissors Fisher Scientific 17-467-496
Dumont #4 Forceps Roboz Instruments RS-4904
Tissue Forceps Roboz Instruments RS-8164
Dissecting Iris Scissors WPI, Inc. 501264
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
NaCl Sigma 71376
KCl Sigma 60128
KH2PO4 Sigma 60353
HEPES Sigma 54457
glucose Sigma G0350500
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C1016
taurine Sigma T0625
BSA Sigma A2153
K-glutamate Sigma G1501
K-aspartate Sigma A6558
MgSO4 Sigma M7506
creatine Sigma C0780
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
Amphotericin-B Fisher Scientific 1397-89-3
Isoproterenol Calbiochem 420355
Media199 Sigma M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM) Sigma B0753
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A5611
Insulin   Sigma I3146
Transferrin Sigma I3146
Selenium Sigma I3146
Penicillin GE Healthcare SV30010
Streptomycin Hyclone SV30010

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References

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  3. Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88, (3), 919-982 (2008).
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