Metodi per l'isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus
* These authors contributed equally
Biology

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Summary

I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

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Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice. J. Vis. Exp. (116), e54555, doi:10.3791/54555 (2016).

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Abstract

miociti nodo seno-atriale (SAM) agiscono come i pacemaker naturale del cuore, avviando ogni cuore battere generando potenziali d'azione spontanei (AP). Questi punti di accesso pacemaker riflettono l'attività coordinata di numerose correnti di membrana e il ciclismo calcio intracellulare. Tuttavia i meccanismi precisi che guidano l'attività di pacemaker spontanea in SAM rimangono sfuggente. Acutamente SAM isolati sono una preparazione fondamentale per gli esperimenti di sezionare le basi molecolari della pacemaking cardiaco. Tuttavia, l'anatomia indistinto, microdissezione complessa, e le condizioni di digestione enzimatica meticolosi hanno impedito l'uso diffuso di acutamente isolato SAM. Inoltre, i metodi non erano disponibili fino a poco tempo per consentire la cultura a lungo termine di SAM per gli studi di espressione proteica. Qui forniamo un protocollo e video dimostrativo step-by-step per l'isolamento di SAM da topi adulti. Un metodo è dimostrato anche per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro e per espressivosu di proteine ​​esogene tramite infezione da adenovirus. Acutamente isolate e coltivate SAM preparati tramite questi metodi sono adatti per una varietà di studi elettrofisiologici e di imaging.

Introduction

miociti pacemaker nel nodo seno-atriale del cuore (miociti seno-atriale, "SAM") generano, potenziali spontanei ritmiche d'azione (AP) che si propagano attraverso il miocardio di avviare ogni battito cardiaco. Gli esperimenti che utilizzano SAM acutamente isolati da molte specie sono stati fondamentali per la spiegazione dei meccanismi che contribuiscono alla generazione di attività pacemaker. SAM sono cardiomiociti altamente specializzati che differiscono sostanzialmente dalle loro controparti nel miocardio atriale e ventricolare in termini di morfologia, funzione e l'espressione della proteina. Il segno distintivo di AP spontanee SAM è una depolarizzazione spontanea durante la diastole che spinge il potenziale di membrana di soglia per far scattare la prossima AP 1,2. Questa "potenziale pacemaker" dipende dall'attività coordinata di molte diverse correnti di membrana compreso il "divertente di" (I f), correnti di calcio T e L-type, e la sodico-calcico scambiatore current (I NCX), che è guidato da Ca 2+ rilascio dal reticolo sarcoplasmatico 3,4.

Mentre acutamente isolato mouse SAM è una preparazione sperimentale essenziale per lo studio della pacemaking, l'isolamento di SAM da topi può essere un metodo difficile adottare perché l'anatomia indistinto e piccole dimensioni del mouse SAN richiede una microdissezione sfumata e la enzimatica combinata e meccanica dissociazione delle cellule richiede l'ottimizzazione attenta.

Forniamo qui un video dimostrativo dettagliata di un protocollo che è stato usato con successo per isolare SAM da topi adulti per le registrazioni di patch clamp 5-8. A nostra conoscenza, non esiste una dimostrazione visiva disponibile da qualsiasi altra fonte. Inoltre, un nuovo metodo è dimostrato nella quale isolato SAM da topi adulti può essere mantenuto in vitro per diversi giorni, permettendo così l'introduzione di proteine, geneticamente codificatomolecole giornalista o RNAi tramite infezione da adenovirus 9.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Colorado Anschutz Medical Campus. Il protocollo standard di seguito è stato ottimizzato utilizzando maschio C57BL / 6J topi di 2-3 mesi di età.

1. Preparare Azioni e accessori per la soluzione in anticipo di esperimenti

NOTA: vedi Materiali Tavolo per attrezzature e forniture necessarie.

  1. Preparare 1 L ciascuna delle seguenti soluzioni come indicato nella Tabella 1:, basso Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di, Modified Kraft-Brühe (KB) Soluzione e Bovine Serum Albumin (BSA) soluzione completa di Tyrode. Usa ultrapura filtrata acqua deionizzata per tutte le soluzioni. Dividere ogni soluzione in 50 ml aliquote e conservare a 20 ° C per un massimo di sei mesi. Scongelare singole aliquote immediatamente prima degli esperimenti, e conservare per un massimo di una settimana a 46; C.
  2. Preparare 50 ml di 10 mM NaCl e 1,8 mM CaCl 2 Adattamento soluzione sciogliendo NaCl e CaCl 2 in ultrapura filtrata acqua deionizzata (Tabella 1). Conservare a temperatura ambiente per un massimo di sei mesi.
  3. Preparare 4,75 unità di attività enzimatica (U) aliquote di elastasi pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a 4 ° C per un massimo di tre mesi.
  4. Preparare 375 mg aliquote (in ultrapura H 2 O) di collagenasi-proteasi miscela enzimatica pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a -20 ° C per un massimo di tre mesi.
  5. Preparare due pipette ribruciate Pasteur, uno per il trasferimento di tessuto (~ finale diametro di apertura 1,5 millimetri; Figura 1Aiv e Figura 1C) e uno per la dissociazione (~ 2 mm di diametro; Figura 1Aiii e Figura 1C).
    1. Punteggio pipette Pasteur con un cutter vetro e scatto lungo il punteggio di produrre un'apertura leggermente più grande della dimensione desiderata. Fuoco-Polacco la fine del taglio di ogni pipetta per ~ 30-60 sec a fuoco lento su un becco Bunsen per la produzione di una parete spessa e lucida un'apertura del diametro desiderato. Garantire l'apertura del fuoco lucidato è privo di eventuali crepe o asperità.
  6. Preparare due piatti di dissezione con l'aggiunta di ~ 25 ml elastomero di silicone miscelato secondo le istruzioni del produttore per ogni 100 millimetri piastra di Petri (Figura 1AI e Figura 1B). Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 48 ore.
  7. Solo per la cultura: preparare 25-50 ml ogni placcatura Medium e terreno di coltura come da Tabella 2 Store per un massimo di due settimane a 4 ° C..

2. Preparare le soluzioni da utilizzare il giorno di isolamento delle cellule

NOTA: Le seguenti importi per l'isolamento dei miociti seno-atriale da un mouse.

  1. Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode (pH 6.9) a ciascuno dei tre piccoli, tubo a fondo tondo culturaS. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C.
  2. Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca 2+ / a una grande provetta a fondo tondo di Mg 2+ Tyrode. Per questo tubo, aggiungere 1 aliquota (4,75 U) elastasi ed una aliquota (375 mcg) collagenasi-proteasi enzima miscela. Agitare per mescolare. Collocare il tubo nel 35 ± 1 ° C bagnomaria.
  3. Aggiungere 2,5 ml di KB da medio a tre piccoli, tubi di coltura a fondo tondo aggiuntivi e una grande, provetta a fondo tondo aggiuntivo. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C.
  4. Aggiungere ~ 7 ml di soluzione BSA di un grande tubo cultura Bottomed. Mantenere questo tubo a temperatura ambiente.
  5. Posizionare 20-40 ml di soluzione completa di Tyrode in un bicchiere da 50 ml (Figura 1Aii). Aggiungere 10 USP / ml di eparina, turbine a mescolare, e posizionare il bicchiere in bagno d'acqua ° C 35 ± 1.

3. Preparare Altre soluzioni e materiali per colture cellulari (saltare questi passaggi per cellule acutamente isolato)

  1. In una cappa coltura di tessuti sterili, posizionare due 12 millimetri vetrini rotondi per il mouse in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
    NOTA: La piastra 24 e viene utilizzato perché i pozzi sono una dimensione conveniente, che serve a limitare il volume di infezioni virali successive.
  2. Dispensare circa 200 ml di 100 ng / ml soluzione di laminina del mouse diluita in fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ogni vetrino.
  3. Incubare coprioggetto con laminina per la durata dell'isolamento (almeno 1 ora) in un incubatore a 37 ° C.
  4. Pre-caldo la placcatura Medium e terreno di coltura (dal punto 1.7 e tabella 3) a 37 ° C.

Isolamento 4. senoatriale Nodo

  1. In una cappa, posizionare il mouse in una camera di una scatola a due camere e anestetizzare con ~ 200 ml isoflurano liquido introdotto tramite un bastoncino di cotone nell'altra camera. Confermare anestesia (di solito entro 30-60 ~ sec) con un pizzico punta. euthanizemouse dislocazione cervicale.
    NOTA: 1 ml di dialogo punta della pipetta vuoto può essere usato per formare la scatola a due camere; girare la cremagliera a testa in giù nella casella per creare il vano separato per l'isoflurano per evitare che il mouse di contattare direttamente.
  2. Rimuovere pelliccia dal petto con le forbici e transetto gabbia toracica per esporre la cavità toracica con pinze esterni dei tessuti (Figura 1Aviii) e forbici dissezione (Figura 1Avix). Bagnare la cavità toracica con ~ 2 ml riscaldati Completa Tyrode di con eparina con una pipetta di trasferimento.
    NOTA: Continua cavità toracica da bagno quando è necessario, non consentono la preparazione di asciugarsi.
  3. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione i polmoni e timo con le forbici interne (Figura 1Avi) e pinze dissezione (Figura 1Avii).
  4. Tenendo delicatamente l'apice del cuore con le pinze dissezione interni, accuratamente tagliato la vena cava inferiore e l'aorta con le forbici interne per rimuovere il cuore dalla cavità toracica. Trasferire il cuore di uno dei piatti dissezione silicone e fare il bagno con ~ 4 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di usare la pipetta di trasferimento.
  5. Orientare il cuore in modo tale che i vasi posteriori sono visibili e rivolta verso l'alto, con atrio destro dell'animale sulla destra dello sperimentatore e atrio sinistro sulla sinistra dello sperimentatore. Una volta orientato, immobilizzare il cuore appuntando attraverso l'apice nel piatto dissezione silicone.
  6. Individuare il solco tra i ventricoli e gli atri (chiaro anello di sopra del ventricoli).
  7. Utilizzando le forbici dissezione interna, fare un'incisione in corrispondenza della scanalatura, mantenendo più vicino ai ventricoli rispetto atri. Lavare la scanalatura e incisione con ulteriore riscaldato Tyrode Completa eparinizzato di quanto necessario per consentire una visione chiara degli atri e le valvole. Continuare a tagliare lungo la scanalatura per separare gli atri dai ventricoli.
  8. Trasferire il tessuto atriale per il secondo piatto dissezione silicone e fare il bagno con ~ 3 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di.
  9. Orient il tessuto in modo che nell'atrio destro dell'animale è ora sulla sinistra dello sperimentatore, e l'atrio sinistro è sulla destra.
    NOTA: L'atrio destro è più trasparente, mentre l'atrio sinistro ha più di un tono di colore rosso scuro.
  10. Pin il tessuto attraverso la vena cava inferiore e superiore e il diritto e appendici atriale sinistra, si estende la preparazione delicatamente. Rimuovere qualsiasi tessuto grasso o altro residuo per consentire una visione chiara della preparazione (attenzione a non tagliare nella parete atriale, come il nodo seno-atriale è molto delicata e può essere facilmente danneggiato).
  11. Aprire la parete anteriore degli atri tagliando attraverso la vena cava. Riposizionare i perni come necessario per visualizzare il setto interatriale.
  12. Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l'atrio sinistro. Re-pin della preparazione, che si estende dolcemente.
  13. rimuovere tHa ragione atriale appendice e liberare il nodo seno-atriale tagliando lungo la terminalis creste, che appare come una striscia di colore arancione scuro al confine con l'appendice atriale.
  14. Re-pin del tessuto nodale e tagliare lateralmente (perpendicolare al terminalis crista) per la produzione di tre strisce di uguali dimensioni.

5. senoatriale Nodo Digestione

  1. Utilizzando la stretta incendio lucidato pipetta (Figura 1Aiv), trasferire i tre strisce di tessuto nodo seno-atriale nel primo dei tre piccoli, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode del nel 35 ± 1 ° bagnomaria C. Incubare per 5 min.
  2. Strisce di tessuto trasferimento al secondo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di in ° C bagnomaria 35 ± 1, utilizzando la stessa pipetta stretta. Lavare le strisce di tessuto delicatamente roteare il tubo o pipettando delicatamente con la pipetta stretto. Non invert tubo.
  3. Strisce di tessuto trasferimento al terzo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di, e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 5.2.
  4. Strisce trasferimento nella grande tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode con enzimi (elastasi più miscela collagenasi-proteasi) nel bagno d'acqua a 35 ° C. Assicurarsi che tutte le tre strisce di tessuto sono presenti. Incubare per 10-15 minuti a 35 ± 1 ° C. Mescolare ogni 5 minuti agitando delicatamente il tubo. Non invertire il tubo.

6. senoatriale Nodo miociti Dissociazione

  1. Dopo la digestione enzimatica, utilizzare la stretta pipetta incendio lucidato per trasferire delicatamente le strisce di tessuto al primo, il tubo a fondo tondo piccolo contenente 2,5 ml di soluzione KB a 35 ± 1 ° C. Lavare il tessuto agitando delicatamente il tubo.
    Nota: le strisce di tessuto saranno apparire un po 'trasparente e possono raggrupparsi a Thè il punto. Maneggiare molto delicatamente dopo la digestione enzimatica per evitare di perdere le cellule.
  2. Trasferire il tessuto al secondo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare.
  3. Trasferire il tessuto al terzo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare.
  4. Trasferire il tessuto alla grande, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C.
  5. Utilizzando la grande pipetta incendio lucidato (Figura 1Aiii e Figura 1C), dissociare le cellule nel grande tubo a fondo tondo da costante triturazione a circa 0,5-1 Hz per 5-10 minuti, avendo cura di mantenere il tubo di dissociazione sommerso nel 35 ± 1 ° C bagnomaria e per evitare di introdurre bolle nella soluzione.
    Nota: tempo di triturazione varia con diametro della pipetta di dissociazione e la forza di pipettaggio. Il tempo dovrebbe essere regolata in modo che i pezzi di tessuto rimanendo a tegli fine della dissociazione appare sottile, trasparente e ciuffi. Se il tessuto mantiene qualsiasi colore, la dissociazione è probabilmente incompleta. Frequenza (0,5-1 Hz) è determinato a mano.
  6. Rimuovere il tubo a fondo rotondo contenente dissociata SAM dal bagnomaria ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min.

7. senoatriale Nodo calcio riadattamento (Eseguita a temperatura ambiente)

NOTA: Per SAM destinato per esperimenti di coltura, le procedure descritte nella sezione seguente devono essere eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti. Se SAM devono essere usati per esperimenti acuti, non vi è alcuna necessità di eseguire queste operazioni in un ambiente sterile.

  1. Aggiungere 75 ml di NaCl / CaCl 2 soluzione adattamento (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min.
  2. Aggiungere 160 ml di NaCl / CaCl soluzione 2 di adattamento. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min.
  3. Aggiungere 390 ml di BSA solution (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min.
  4. Aggiungere 1,25 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min.
  5. Aggiungere 4,37 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min.
    Nota: La concentrazione finale di calcio sarà 1,8 mM.
  6. A seguito di calcio riadattamento, raccogliere SAM consentendo di risolvere per gravità per ~ 10 minuti o per centrifugazione a ~ 2.000 xg per 3 min.
    1. Per le cellule acutamente isolate, rimuovere delicatamente e scartare circa 5 ml del surnatante con una pipetta Pasteur di vetro, lasciando le cellule in un volume di 2 ml ~. Conservare queste cellule a temperatura ambiente per un massimo di ~ 8 ore per le registrazioni di patch clamp.
    2. Per le cellule in coltura, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile utilizzando una pipetta di vetro sterile Pasteur. Pellet Risospendere cellule in 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) Placcatura Medium (Tabella 2).

8. placcatura e la cultura di senoatriale Myociti (Skip per cellule acutamente isolato)

  1. Rimuovere la soluzione laminina da lamelle dal punto 3.3 con una pipetta Pasteur. seminare Immediatamente 500 microlitri (~ 50-100 cellule) su ogni vetrino laminina rivestite (dal punto 3).
    NOTA: L'inibitore contrattile 2,3-butanedione monoxime (BDM) è incluso nei media placcatura e cultura per prevenire la contrazione, che provoca logoramento delle cellule 9.
  2. Riportare la piastra 24 pozzetti contenente SAM appena seminato al incubatore e mantenere a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO 2. Consentono alle cellule di aderire a lamelle per 4-6 ore nei media placcatura (Tabella 2).
  3. Rimuovere delicatamente placcatura Media utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Sostituire con 500 ml per pozzetto di pre-riscaldato (37 ° C) Culture Media (Tabella 2).

9. trasduzione adenovirale di adulti Culture senoatriali miociti (Vai a cellule acutamente isolato)

  1. Stimare il numero di cells per coprioggetto immediatamente prima dell'applicazione adenovirus contando le cellule in un campo visivo al microscopio, regolando per l'ingrandimento. Contare tutte le cellule, non solo SAM.
  2. Diluire adenovirus in Medium 199 e regolare la diluizione per il titolo virale in modo che l'applicazione di 1-10 microlitri è necessaria per ottenere una molteplicità finale di infezione (MOI) di 100 unità virali per cellula. Aggiungere la soluzione adenovirale in modo gocce direttamente sulla placcato SAM.
  3. Incubare le cellule con il pernottamento medio virus contenente (~ 12-14 ore). Poi scambiare con terreno di coltura fresco. Mantenere le cellule in incubatrice, cambiando la cultura media ogni 48 ore, fino ad ottenere l'espressione della proteina desiderata.

10. La valutazione funzionale del Acutamente isolato o coltivate SAM

NOTA: Il seguente protocollo è un esempio di valutazioni funzionali di SAM isolato utilizzando l'amfotericina tecnica perforato-patch per registrare sia i punti di accesso spontanee e I 9).

  1. Preparare soluzioni di registrazione come descritto nella tabella 3.
  2. Preparare una soluzione stock di 20 mg / ml di amfotericina B-in DMSO fresco il giorno della registrazione. Mantenere magazzino a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Diluire amfotericina B-magazzino in soluzione intracellulare ad una concentrazione finale di 200 ug / ml al momento dell'uso. Mantenere la soluzione pipetta finale sul ghiaccio e al riparo dalla luce.
    NOTA: La soluzione pipetta amfotericina contenente per esperimenti deve essere preparato fresco oraria diluendo una aliquota della soluzione madre nella soluzione intracellulare e vortex per almeno 1 min.
  3. Trasferire una aliquota della acutamente dissociate sospensione cellulare SAM o un frammento di vetro vetrino cuscinetto colta SAM ad una camera di registrazione contenente la soluzione di Tyrode a 35 ± 1 ° C. Profumato cellule con la soluzione di Tyrode per almeno 2 minuti prima recordin elettrofisiologicags per eliminare ogni residuo di BDM rimanente dal terreno di coltura.
    NOTA: contrazioni spontanee dovrebbe essere evidente subito dopo il trasferimento alla soluzione del Tyrode. SAM per la registrazione può essere identificato da una combinazione di funzioni, tra cui attività contrattile spontanea, morfologia caratteristica (ad es., Figura 2), la mancanza di striature, espressione della proteina HCN4, presenza di corrente I f, capacità di membrana <50 pF, e spontanei AP con forme d'onda che includono una fase di depolarizzazione diastolica e una salita lenta.
  4. Usando pipette di vetro borosilicato con resistenze di 1,5-3,0 MW, riempire la punta con la soluzione intracellulare carente amfotericina per immersione per 10-30 sec. Poi di nuovo riempire la pipetta con la soluzione di amfotericina contenente. Una guarnizione cell-attached GΩ dovrebbe essere ottenuto più rapidamente possibile. Se la formazione di tenuta è difficile, aumentare il tempo di punta-fill.
    NOTA: La resistenza accesso dovrebbe essere continuamentemonitorati dopo la formazione del sigillo cellule iscritti, e le registrazioni devono essere avviate solo dopo aver ottenuto una resistenza accesso stabile di <10 MW.
  5. Per registrare i punti di accesso spontanee, commutare l'amplificatore in modalità di corrente-clamp veloce senza iniezione di corrente.
    NOTA: 1 nM isoproterenolo è incluso nella soluzione extracellulare Tyrode durante la registrazione di punti di accesso per stabilizzare il tasso di fuoco, come riportato in precedenza 10.

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Representative Results

I protocolli descritti qui sono stati precedentemente utilizzati per isolare spontaneamente attivi SAM da topi adulti che sono adatti per una varietà di differenti di patch clamp studi 5-8. Inoltre, i protocolli consentono SAM isolati che possono essere mantenute in coltura per fino ad una settimana. Il trasferimento genico nelle cellule in coltura può essere realizzato tramite infezione da adenovirus 9. I risultati presentati in questa sezione derivano dal nostro lavoro precedente e sono mostrati qui come esempi delle caratteristiche di SAM acutamente isolate e coltivate.

Come mostrato in figura 2, spontaneamente attiva SAM può essere mantenuta in coltura per 6 giorni. Le cellule coltivate mantengono una morfologia complessiva che è molto simile a quella di acutamente isolato SAM, senza cambiamenti significativi nella lunghezza media, larghezza, area della sezione trasversale, o capacità della membrana di colturacellule rispetto a cellule acutamente isolate (Figura 2B - E). C'era però logoramento del numero di vitali SAM nel tempo in coltura. Quindi, si raccomanda che le culture essere preparati dalle cellule raccolti da più animali se il disegno sperimentale richiede ampie serie di dati.

Un obiettivo importante nello sviluppo del protocollo per la cultura dei miociti seno-atriale da topi adulti era quello di creare un sistema che permetta l'espressione di proteine ​​esogene nel contesto nativo cellulare di adulti SAM. Un esempio di questo tipo di espressione della proteina è mostrato in Figura 3 per il caso delle cellule co-infettati con virus che esprimono le proteine marker fluorescente GFP e mCherry. Abbiamo scoperto che l'espressione della proteina era chiaramente evidente entro 24 ore di infezione da adenovirus, ed era il massimo per le proteine di prova entro 48 ore (Figura 3). Un MOI virale di 100 comportato quasi il 100% infefficienza essione senza evidenza di tossicità cellulare. Al contrario, trasfezione utilizzando reagenti a base di lipidi non è riuscito a produrre in qualsiasi trasferimento genico rilevabile in adulti SAM, anche dopo 72 ore 9.

Caratterizzazione funzionale tramite elettrofisiologia patch-clamp è un fattore critico per la valutazione di entrambi SAM. Figura 4A acutamente isolate e coltivate mostra le registrazioni tipiche corrente-clamp di potenziali d'azione spontanei registrati da SAM acuto isolato o coltivate utilizzando la configurazione di registrazione perforato-patch amfotericina. Azione potenziali forme d'onda sono stati simili a SAM acuto isolato e colta e non vi era alcuna differenza nel tasso medio AP sparare (Figura 4B).

I f è un segno distintivo della SAM ei canali HCN4 che producono I f sono usati come marcatori immunocitochimiche del nodo seno-atriale. Da qui la presence di I f nelle registrazioni patch clamp può essere utilizzata per sostenere l'idea che le cellule sono infatti SAM. Tutti i SAM acute e coltivate spontaneamente attivo descritto qui esposti anche I f> 100 Pa in risposta ad un gradino di tensione 1 sec a -120 mV. Per i risultati rappresentativi mostrati qui, le cellule sono state perfuse con una soluzione di Tyrode contenente 1 mM BaCl 2 per bloccare K + correnti (Tabella 3) e la dipendenza della tensione di attivazione di I f è stato dosati con 3 sec gradini di tensione iperpolarizzanti da -60 a -160 mV da un potenziale di -50 mV presa a terra, come abbiamo descritto in precedenza 5-8. La densità di corrente è stata valutata in risposta a 3 sec prova hyperpolarizing impulsi a -150 mV da un potenziale di -50 mV in possesso. Non ci sono state differenze significative sia la tensione di dipendenza di attivazione di I f o I f densità di corrente tra acutamente isolato e colta SAM (Figura 4C - D). Questi co-registrazioni di AP spontanee e I f dai singoli SAM richiedono circa 9 minuti in totale (tra cui un lavaggio iniziale 2 min, 30-60 sec di AP spontanee in modalità morsetto corrente, un cambiamento soluzione 2 min, e di circa 5 min a raccogliere dati morsetto tensione sufficienti per descrivere la tensione dipendenza di attivazione I f). Quindi i dati mostrati nella Figura 4C illustrano anche la robustezza della preparazione cellulare.

Figura 1
Figura 1: strumenti di dissezione per l'isolamento e la dissociazione del mouse del SAM (a) i due 10 centimetri piastre Petri contenenti ~ 25 ml curato elastomeri di silicone... Ogni piatto è precaricato con 6-10 piccoli perni dissezione per immobilizzare il tessuto. Ii. 100 ml bicchiere per lo svolgimento completo Tyrode del nel 35 &# 176;... Bagnomaria C III Wide (~ 2 mm di diametro), incendio lucidato dissociazione pipetta iv stretta (circa 1,5 mm di diametro) Sfaccettate di trasferimento pipetta v pipetta di plastica per la preparazione di poppa con Completa Tyrode di con... pinze tessuto, 5.5 in, 1 x 2 denti di manipolazione dei tessuti esterni eparina. VI. self-apertura forbici micro per le procedure di taglio interne. vii. pinza sottile (dimensioni punta 0,06 x 0,02 millimetri) per la manipolazione dei tessuti interni. viii.. ix. iris forbici curve 4,3 a per le procedure di taglio esterni. (B) Foto del primo piano evidenziare piccoli perni dissezione poste nel piatto dissezione. (C) Close-up fotografia evidenziando pipetta stretta trasferimento incendio lucidato (a sinistra) e incendio lucidato pipetta ad imboccatura larga per triturazione meccanica (a destra). Clicca qui per visualizzare un versio più granden di questa figura.

figura 2
. Figura 2: Acutamente isolati e SAM coltivate sono morfologicamente indistinguibili. A: le immagini in campo chiaro di rappresentante SAM o immediatamente dopo l'isolamento (acuta) o dopo 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore, o 6 giorni in vitro B - D : media (± SEM) di lunghezza massima, zona larghezza e trasversale per acutamente isolato rispetto a 48 ore colta SAM e:. media (± SEM) capacità di membrana da registrazioni di tensione-clamp da SAM acuto isolato o coltivate. Tutti i confronti non sono significativi: p> 0.05 vs. acuta. Adattato da riferimento 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 3: espressione adenovirale di proteine esogene in coltura SAM campo chiaro e le immagini epifluorescente di rappresentante colta SAM che sono stati infettati con un MOI di 100 per adenovirus che esprimono eGFP (verde) e mCherry (rosso), sia a 24 o 48 ore dopo. doppia infezione. barra della scala = 20 micron. Tratto da riferimento 9.

Figura 4
Figura 4: caratterizzazione elettrofisiologica di colta SAM A:. Registrazioni corrente con la pinza rappresentativi da acutamente isolato (nero) o coltivate (grigio) SAM in soluzione di Tyrode contenente 1 nM isoproterenolo. Barre di scala: 40 mV, 100 msec. B: Media (± SEM) istantaneasparando frequenza in acuto isolato (nero; n = 6) o 48 ore in coltura (grigio; n = 14) SAM C:. media normalizzato (± SEM) rapporti di conduttanza-tensione per I f a acutamente isolato (nero; n = 8) o coltivate (grigio; n = 14) SAM Insets:.. attuali famiglie rappresentative acuta (nero) o SAM in coltura (in grigio) suscitata da 3 secondi impulsi di prova iperpolarizzanti da -60 a -160 mV con incrementi di 10 mV D: medio ( ± SEM) I f densità di corrente a -150 mV a acutamente isolato (nero; n = 7) e coltivate (grigio; n = 8) SAM. Adattato da riferimento 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

completa Tyrode di basso Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di KB Media BSA Solution NaCl / CaCl 2 Adattamento Soluzione
NaCl 140 140 140 10
KCl 5.4 5.4 25 5.4
KH 2 PO 4 1.2 1.2 10 1.2
HEPES 5 5 5 5
glucosio 5.55 18.5 20 5.55
MgCl 2 1 1
CaCl 2 1.8 0,066 1.8 1.8
taurina 50 20
BSA 1 mg / ml 1 mg / ml 1 mg / ml
K-glutammato 100
K-aspartato 10
MgSO 4 2
creatina 5
EGTA 0.5
pH regolato a 7.4 con NaOH 6.9 con NaOH 7,2 con KOH 7.4 con NaOH

Tabella 1:. Le soluzioni di dissociazione Composizioni di soluzioni utilizzate nella dissociazione dei miociti nodo seno-atriale. Le concentrazioni sono espresse in mm eccetto dove diversamente indicato.

placcatura medio Terreno di coltura
Media199 base base
2,3-butanedione monoxime (BDM) 10 mM 10 mM
Siero fetale bovino (FBS) 5% -
Albumina sierica bovina (BSA) 0,1 mg / ml
Insulina 10 mg / ml
transferrina 5,5 mg / ml
Selenio 5 ng / ml
Penicillina 100 U / ml 100 U / ml
Streptomicina 100 mg / ml 100 mg / ml

Tabella 2: placcatura e cultura soluzioni Composizioni di soluzioni utilizzate per la placcatura e la cultura dei miociti nodo seno-atriale..

Tyrode di PP intracellulare
NaCl 140 5
KCl 5.4 135
Kh 2 PO 4 1.2
HEPES 5 10
glucosio 5.55
MgCl 2 1 1
CaCl 2 1.8 0.1
EGTA 10
Mg-ATP 4
L'amfotericina B- 200 ug / ml in base alle necessità
isoproterenolo 1 nm, se necessario
pH regolato a 7.4 con NaOH 7,2 con KOH

Tabella 3: soluzioni di registrazione elettrofisiologia Composizioni di extracellulare soluzioni (Tyrode) e intracellulare (PP) utilizzati per la amfotericina registrazioni perforato-patch dal miociti nodo seno-atriale..

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Discussion

Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per l'isolamento e la coltura di completamente differenziate miociti nodo seno-atriale da topi adulti. Il protocollo di isolamento produce in modo affidabile SAM spontaneamente attivi del mouse adatti sia per l'analisi elettrofisiologica immediata o successiva cultura. Protocolli simili sono stati riportati da molti altri gruppi (per esempio, vedere riferimenti 11,12,10,13-17). Tuttavia, il protocollo per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro conserva la morfologia caratteristica, attività spontanea e proprietà elettrofisiologiche delle cellule e permette la consegna adenovirale di proteine 9.

Per la modifica e la risoluzione dei problemi dei protocolli, si segnala a pochi passi critici. Il primo fattore critico è un notevole variabilità da lotto a lotto dell'attività degli enzimi digerenti (passo 1.4), che possono drasticamente alterare il numero e la qualità della SAM isolato in un dato preparzione. Questa variabilità è particolarmente vero per l'elastasi, che richiede tipicamente ottimizzazione specifica della carica, in cui i tempi di concentrazione e di esposizione devono essere BRACKETING nel corso di diversi preparati (spesso fatto in parallelo) per massimizzare il numero di cellule e la salute. Alcuni protocolli per l'isolamento di SAM da varie specie di uso individuale collagenasi e della proteasi enzimi al posto della collagenasi-proteasi miscela di enzimi nel presente protocollo. Tuttavia, la variabilità da lotto a lotto per ciascuno di questi enzimi è piuttosto elevato (simile a quello di elastasi), necessitando utilizzate giri di co-ottimizzazione. La miscela di enzimi fornisce più coerenza tra i lotti e richiede un minor numero di passaggi di ottimizzazione.

Una seconda critica, e non ovvio, fattore per risolvere l'isolamento SAM è l'integrità del fuoco lucidato vetro dissociazione pipetta (Figura 1C). Se il bordo della pipetta contiene bordi taglienti, crepe o accumulato cdetriti ellular, la fase di triturazione meccanica può danneggiare le cellule, con conseguente tossicità calcio. La dissociazione pipetta incendio lucidato deve essere sostituita almeno ogni 2 mesi di uso regolare, o in qualsiasi momento che il rendimento delle cellule o la qualità declina sensibilmente nel corso di diversi preparati.

La tempistica e la forza della dissociazione meccanica è un terzo passo fondamentale per la risoluzione dei problemi del protocollo di isolamento. La triturazione richiede lento (circa 0,5-1 Hz), ma la turbolenza forte per 5-10 min. tassi più rapidi e ridotti tempi potrebbero anche essere usate, ma è importante evitare di introdurre bolle o la generazione di schiuma nella soluzione. Quando i campioni del nodo seno-atriale sono stati completamente dissociato, le strisce di tessuto rimanenti dovrebbero apparire esile e di colore bianco; sottile colorazione rosa-ish indica triturazione incompleta. Quando esaminato a 200-400X ingrandimento, le cellule da campioni preparati in modo ottimale hanno le membrane delle cellule lisce, mentre memb cellulareranes provenienti da oltre-digerito o over-triturato campioni hanno un aspetto crateri e striato. In cellule sane, contrazioni si osservano principalmente come sottili spasmi delle estremità delle cellule. Le onde di contrazione sono un segno di cellule danneggiate, che possono essere osservati a contrarsi con forza per un breve periodo, prima di balling-up. Una pipetta di dissociazione incrinato è la causa più comune di tale danno cellulare. Nei campioni che sono stati sotto-digerito o sotto-triturato, le cellule sono presenti come grumi o aggregati invece di singole cellule, e un numero significativo di contrarre SAM possono essere osservati nei pezzi di tessuto rimanenti.

Ogni utente avrà bisogno di ottimizzare singolarmente la dissociazione. Anche se la digestione enzimatica ed i tempi di dissociazione meccanica dovrebbero entrambi essere regolate, si raccomanda di tenere inizialmente il tempo di digestione enzimatica costante mentre la modifica del tempo di dissociazione. messa a punto supplementare multa si basa principalmente sulla capacità dell'utente di riconoscere l'unappearance dei pezzi di tessuto rimanenti al completamento di triturazione - quando i pezzi sono ciuffi e di colore biancastro, poi la triturazione deve essere interrotto. L'ottimizzazione è anche necessario per ospitare le variazioni nel nodo seno-atriale che accompagnano le differenze di età, sesso, o ceppo di topi. Ad esempio, la dissociazione di cellule provenienti da animali più vecchi 7 richiede riduzione sia digestione enzimatica e tempi di dissociazione meccaniche. Come regola generale, una preparazione tipica da 2-3 mesi di età maschi rendimenti C57BL / 6 del mouse circa 50-200 praticabile Sams, di cui forse 5-10 può essere successo patch-bloccato in seduta una buona giornata, a seconda delle sperimentazioni . Il rendimento è notevolmente (~ 30%) più bassa quando i topi più anziani vengono utilizzati 7.

Il successo del protocollo di cultura si basa anche su alcuni passaggi chiave. Primo, il successo di una coltura cellulare primaria richiede una dissociazione di alta qualità, come discusso in precedenza. Si raccomanda thalla preparazione delle cellule acutamente isolata essere ottimizzata prima di tentare di mantenere le cellule in coltura. Un secondo fattore critico per cellule coltivate risiede nella selezione di celle per registrazioni elettrofisiologiche. Per ottenere i migliori risultati, SAM coltivate selezionati per le registrazioni devono mostrare contrazioni spontanee immediatamente dopo dilavamento del terreno di coltura BDM-contenenti. Una lenta insorgenza di contrazioni spontanee su di wash-out di BDM è un segno di cellule non sane.

Il sistema di coltura SAM ha alcune limitazioni, in particolare la dimensione molto piccola del mouse SAN. Mentre i metodi dimostrati qui consentono numero di cellule sufficienti per studi elettrofisiologici e di imaging, la quantità limitata di tessuto preclude analisi biochimiche di colta SAM. Un'altra limitazione della tecnica è che SAM deve essere coltivate in presenza dell'inibitore miosina ATPasi reversibili, BDM. Questo è un potenziale preoccupazione perché BDM ha altri effetti cellulari, tra cuinon specifica attività della fosfatasi, l'inibizione della trascrizione cardiaco fattori 19, e l'inibizione dei canali del sodio, canali del calcio e recettori rianodinici 20. Tuttavia, i dati mostrano che BDM ha effetti minimi sulle proprietà morfologiche ed elettrofisiologiche di SAM testati qui.

Nelle applicazioni future, sembra probabile che i metodi descritti qui potrebbero essere adattati per preparare le culture SAM da grandi mammiferi. In combinazione con il trasferimento di geni adenovirale, tali colture potrebbe consentire manipolazioni genetiche di pacemaking in grandi modelli animali. La possibilità di introdurre proteine ​​di interesse prevede anche per le future applicazioni in cui le molecole giornalista geneticamente codificati possono essere utilizzati per sondare vie di segnalazione intracellulare in SAM.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgruard/Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes Fisher Scientific 352059
Large, round bottomed culture tubes Corning 14-959-11B
Elastase Worthington Biochemical LS002279
Liberase TM Roche 5401119001 Tissue dissociation solution
Heparin SAGENT Pharmaceuticals  NDC 25021-400-10
Mouse Laminin Corning CB-354232
12 mm round glass coverslips Fisher  12-545-80
24-well culture plate Fisher 08-772-1
Ad-mCherry Vector Biolabs 1767
Ad-eGFP Vector Biolabs 1060
Plastic, disposable transfer pipette Fisher Scientific
Micro scissors Fisher Scientific 17-467-496
Dumont #4 Forceps Roboz Instruments RS-4904
Tissue Forceps Roboz Instruments RS-8164
Dissecting Iris Scissors WPI, Inc. 501264
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
NaCl Sigma 71376
KCl Sigma 60128
KH2PO4 Sigma 60353
HEPES Sigma 54457
glucose Sigma G0350500
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C1016
taurine Sigma T0625
BSA Sigma A2153
K-glutamate Sigma G1501
K-aspartate Sigma A6558
MgSO4 Sigma M7506
creatine Sigma C0780
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
Amphotericin-B Fisher Scientific 1397-89-3
Isoproterenol Calbiochem 420355
Media199 Sigma M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM) Sigma B0753
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A5611
Insulin   Sigma I3146
Transferrin Sigma I3146
Selenium Sigma I3146
Penicillin GE Healthcare SV30010
Streptomycin Hyclone SV30010

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References

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