Méthodes pour l'isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes

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Summary

Les méthodes sont mises en évidence pour l'isolement des myocytes nœud sino-auriculaire (SAMS) provenant de souris adulte pour les études électrophysiologiques de patch-clamp ou d'imagerie. Les cellules isolées peuvent être utilisés directement ou peuvent être maintenues en culture pour permettre l'expression de protéines d'intérêt, comme rapporteurs codés génétiquement.

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Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice. J. Vis. Exp. (116), e54555, doi:10.3791/54555 (2016).

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Abstract

myocytes nœud sinusal (GSB) agissent comme les stimulateurs cardiaques naturelles du cœur, initiant chaque battement de coeur en générant des potentiels d'action spontanés (AP). Ces points d'accès du stimulateur reflètent l'activité coordonnée de nombreux courants membranaires et intracellulaires vélo de calcium. Cependant, les mécanismes précis qui animent l'activité pacemaker spontanée dans SAMs demeurent insaisissables. Pleinement SAMs isolées sont une préparation essentielle pour les expériences de disséquer la base moléculaire de pacemaker cardiaque. Cependant, l'anatomie indistincte, microdissection complexe, et les conditions de digestion enzymatique tatillonnes ont empêché l'utilisation généralisée de aiguë isolée GSB. En outre, les méthodes ne sont pas disponibles jusqu'à récemment pour permettre la culture à long terme de SAMs pour les études d'expression de protéines. Ici, nous fournissons un protocole et vidéo de démonstration étape par étape pour l'isolement des SAMs de souris adultes. Un procédé est également démontrée pour le maintien de la souris adulte GSB in vitro et pour expressisur des protéines exogènes par une infection adénovirale. Pleinement isolées et cultivées SAMs préparées par ces procédés sont appropriés pour une variété d'études électrophysiologiques et d'imagerie.

Introduction

myocytes pacemakers dans le nœud sinusal du cœur (myocytes sinoatrial, "GSB") génèrent, potentiels spontanés rythmiques d'action (PA) qui se propagent à travers le myocarde pour initier chaque battement de cœur. Des expériences utilisant SAMs aiguë isolées de nombreuses espèces ont été essentiels pour l'élucidation des mécanismes qui contribuent à la génération de l'activité pacemaker. SAMs sont cardiomyocytes hautement spécialisées qui diffèrent sensiblement de leurs homologues de l'auriculaire et ventriculaire myocardique en termes de morphologie, la fonction et l'expression des protéines. La marque de points d' accès spontanés dans GSB est une dépolarisation spontanée pendant la diastole qui conduit le potentiel de membrane au seuil pour déclencher le prochain point d' accès de 1,2. Ce «potentiel de stimulateur" dépend de l'activité coordonnée de nombreux courants différents de la membrane , y compris la «drôle de courant" (I f), T et de type L courants de calcium et le sodium-calcium échangeur current (I NCX), qui est entraîné par Ca la libération du réticulum sarcoplasmique 3,4.

Alors que la souris aiguë isolée SAMs sont une préparation expérimentale essentielle pour l'étude de pacemaker, l'isolement des SAMs de souris peut être une méthode difficile à adopter, car l'anatomie indistincte et la petite taille du SAN souris nécessite une microdissection nuancée et enzymatique combiné et mécanique dissociation des cellules nécessite une optimisation minutieuse.

Nous fournissons ici une vidéo de démonstration détaillée d'un protocole qui a été utilisé avec succès pour isoler SAMs de souris adultes pour les enregistrements de patch clamp 5-8. À notre connaissance, il n'y a pas une telle démonstration visuelle disponible à partir de toute autre source. En outre, une nouvelle méthode est mise en évidence dans laquelle isolé GSB de souris adultes peuvent être maintenues in vitro pendant plusieurs jours, ce qui permet l'introduction de protéines codées génétiquementmolécules reporters ou ARNi via une infection adénovirale 9.

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Protocol

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Colorado Anschutz Medical Campus. Le protocole standard ci-dessous a été optimisé en utilisant mâle C57BL / 6J de 2-3 mois d'âge.

1. Préparer les stocks et les fournitures de solutions à l'avance des expériences

REMARQUE: Se reporter au tableau des matériaux pour le matériel et les fournitures nécessaires.

  1. Préparer 1 litre chacune des solutions suivantes , comme indiqué dans le tableau 1, faible teneur en Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode, modifié Kraft Brühe (KB) de solutions et de sérumalbumine bovine (BSA) Solution complète Tyrode. Utiliser ultrapure filtrée l'eau déminéralisée pour toutes les solutions. Divisez chaque solution dans 50 ml aliquotes et stocker à 20 ° C pendant jusqu'à six mois. Décongeler aliquotes individuelles immédiatement avant les expériences, et de stocker jusqu'à une semaine à 46; C.
  2. Préparer 50 ml de NaCl 10 mM et 1,8 mM de CaCl 2 Adaptation solution en dissolvant du NaCl et CaCl 2 dans ultrapure filtrée de l' eau déminéralisée (tableau 1). Stocker à température ambiante pendant un maximum de six mois.
  3. Préparer 4,75 unité d'activité enzymatique (U) aliquotes de élastase par pipetage dans des tubes de microcentrifugation. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à trois mois.
  4. Préparer des aliquotes de 375 ug (dans ultrapure H 2 O) de mélange enzymatique de collagénase-protéase par pipetage dans des tubes de microcentrifugation. Conserver à -20 ° C pendant jusqu'à trois mois.
  5. Préparer deux pipettes Pasteur polies au feu, l' un pour le transfert du tissu (~ diamètre d'ouverture finale de 1,5 mm, la figure 1Aiv et la figure 1c) et une pour la dissociation (~ de 2 mm de diamètre, la figure 1Aiii et la figure 1C).
    1. Score pipettes Pasteur avec un coupe-verre et enclenchent le long de la partition pour produire une ouverture légèrement plus grande que la taille souhaitée. Feu-Polonais la fin de chaque pipette de coupe pour ~ 30-60 sec sur une petite flamme sur un brûleur Bunsen pour produire une paroi épaisse et polie d'une ouverture du diamètre désiré. Assurez-vous de l'ouverture polie au feu est exempt de toute fissure ou bords rugueux.
  6. Préparer deux plats de dissection en ajoutant ~ 25 ml d' élastomère de silicone mélangé selon les instructions du fabricant à chaque plat de 100 mm de Pétri (Figure 1AI et la figure 1B). Laisser sécher à la température ambiante pendant 48 heures.
  7. Pour la culture seulement: préparer 25-50 ml chaque Placage moyen et milieu de culture selon le tableau 2 magasin jusqu'à deux semaines à 4 ° C..

2. Préparer des solutions à utiliser sur la Journée de la cellule d'isolement

REMARQUE: Les montants suivants sont pour l'isolement des myocytes sinoatrial d'une souris.

  1. Ajouter 2,5 ml de faible Ca 2+ / Mg 2+ (le pH 6,9) de Tyrode à chacun des trois petits tubes de culture, à fond ronds. Placer les tubes dans un bain d'eau 35 ± 1 ° C.
  2. Ajouter 2,5 ml de faible Ca 2+ / à un grand tube de culture à fond rond de Mg 2+ Tyrode. Pour ce tube, ajoutez 1 aliquote (4,75 U) élastase et une aliquote (375 ug) enzyme de mélange de collagénase-protéase. Agiter pour mélanger. Placer le tube dans 35 ± 1 ° C bain d'eau.
  3. Ajouter 2,5 ml de KB moyenne à trois petits tubes de culture à fond rond supplémentaires et un grand tube supplémentaire, à fond rond culture. Placer les tubes dans un bain d'eau 35 ± 1 ° C.
  4. Ajouter ~ 7 ml de solution de BSA à un grand tube de culture à fond. Gardez ce tube à la température ambiante.
  5. Placer 20-40 ml de solution de Tyrode complète dans un bécher de 50 ml (figure 1Aii). Ajouter 10 USP / ml d'héparine, agiter pour mélanger, et placer le bécher dans le bain ° C de l'eau 35 ± 1.

3. Préparer des solutions et des matériaux supplémentaires pour les cellules cultivées (Passer ces étapes pour les cellules isolées Aiguë)

  1. Dans une culture de tissu hotte stérile, placer deux 12 mm lamelles de verre rondes par souris dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits.
    NOTE: La plaque 24 puits est utilisée parce que les puits sont d'une taille convenable, qui sert à limiter le volume pour les infections virales ultérieures.
  2. Introduire à la pipette environ 200 ul d'une solution à 100 ng / ml de laminine de souris dilué dans du phosphate stérile saline tamponnée (PBS) sur chaque lamelle.
  3. Incuber avec des lamelles couvre-laminine pour la durée de l'isolement (au moins 1 heure) dans un incubateur à 37 ° C.
  4. Préchauffer le Placage moyen et milieu de culture (de l' étape 1.7 et le tableau 3) à 37 ° C.

4. nœud sinusal Isolation

  1. Dans une hotte chimique, placer une souris dans une chambre d'une boîte à deux chambres et anesthésier avec ~ 200 pi isoflurane liquide introduit par l'intermédiaire d'un coton-tige dans l'autre chambre. Confirmer l'anesthésie (généralement dans ~ 30-60 sec) avec une pincée d'orteil. Euthanasiersouris par dislocation cervicale.
    NOTE: Un 1 ml boîte de pointe de la pipette vide peut être utilisé pour former la boîte à deux compartiments; tourner la grille à l'envers dans la boîte pour créer le compartiment séparé pour l'isoflurane pour empêcher la souris de la mise en contact directe.
  2. Retirer la fourrure de la poitrine avec des ciseaux et transect cage thoracique afin d' exposer la cavité thoracique en utilisant des pinces externes de tissus (Figure 1Aviii) et des ciseaux de dissection (Figure 1Avix). Baignez la cavité thoracique avec ~ 2 ml réchauffés complète Tyrode avec Héparine à l'aide d'une pipette de transfert.
    REMARQUE: Continuer la cavité thoracique de baignade lorsque cela est nécessaire, ne permet pas la préparation de sécher.
  3. Sous un microscope à dissection, retirer soigneusement les poumons et le thymus avec des ciseaux internes (Figure 1Avi) et des pinces de dissection (Figure 1Avii).
  4. Tout en tenant délicatement la pointe du cœur avec la pince de dissection internes, découpez soigneusement la veine cave inférieure et unorta avec les ciseaux internes pour retirer le coeur de la cavité thoracique. Transférer le cœur à l'un des plats de dissection de silicone et se baigner avec ~ 4 ml réchauffait les héparinisés complète Tyrode à l'aide de la pipette de transfert.
  5. Orient au cœur de telle sorte que les vaisseaux postérieurs sont visibles et vers le haut, avec l'oreillette droite de l'animal sur le droit de l'expérimentateur et l'oreillette gauche sur la gauche de l'expérimentateur. Une fois orienté, immobiliser le coeur en épinglant par le sommet dans le plat silicone de dissection.
  6. Localisez la rainure entre les ventricules et les oreillettes (anneau clair au- dessus des ventricules).
  7. À l'aide des ciseaux de dissection internes, faire une incision à la gorge, en gardant plus près des ventricules que les oreillettes. Rincer la gorge et incision avec ce que nécessaire supplémentaire réchauffé hépariné Tyrode complète pour permettre une vue dégagée sur les oreillettes et les valves. Continuer à couper le long de la rainure pour séparer les oreillettes des ventricules.
  8. Transférer le tissu auriculaire pour le deuxième plat silicone de dissection et se baigner avec ~ 3 ml réchauffait les héparinisés Tyrode complet de.
  9. Orientez le tissu de telle sorte que l'oreillette droite de l'animal est maintenant sur la gauche de l'expérimentateur et l'oreillette gauche est sur la droite.
    NOTE: L'oreillette droite est plus transparent, tandis que l'oreillette gauche a plus d'un ton rouge foncé.
  10. Pin le tissu à travers la veine cave inférieure et supérieure et le droit et les appendices auriculaires gauche, étirant doucement la préparation. Retirez tout le tissu adipeux ou d'autres restant pour permettre une vision claire de la préparation (attention à ne pas couper dans la paroi de l'oreillette, le nœud sinusal est assez délicate et peut facilement être endommagé).
  11. Ouvrez la paroi antérieure de l'oreillette en coupant à travers des veines caves. Re-positionner les broches que nécessaire pour visualiser le septum interauriculaire.
  12. Couper le long du septum interauriculaire pour enlever l'oreillette gauche. Re-épingler la préparation, étirant doucement.
  13. Retirer til oreillette droite appendice et libérer le nœud sinusal en coupant le long de la terminalis cristae, qui apparaît comme une traînée orange foncé en bordure de l'appendice auriculaire.
  14. Re-épingler le tissu nodal et le couper latéralement (perpendiculairement à la crête terminale) pour produire trois bandes de taille égale.

5. sinusal Nœud Digestion

  1. Utilisation de la poli-feu étroite pipette (Figure 1Aiv), transférer les trois bandes de tissu de nœud sinusal dans le premier de trois petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml de faible teneur en Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode dans le 35 ± 1 ° bain-marie. Incuber pendant 5 min.
  2. Bandes de tissu de transfert au second petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml à faible Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode dans la salle de bain ° C de l' eau 35 ± 1, en utilisant la même pipette étroite. Laver les bandes de tissu en douce tourbillonnant le tube ou en pipetant doucement avec la pipette étroite. Ne invert le tube.
  3. Bandes de tissu de transfert à la troisième petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml à faible Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode, et répéter l'étape de lavage décrite à l' étape 5.2.
  4. Des bandes de transfert dans le grand tube à fond rond contenant 2,5 ml d' une faible teneur en Ca 2+ / Mg 2+ de Tyrode avec des enzymes (élastase ainsi que la collagénase-protéase mélange) dans le bain d'eau à 35 ° C. Veiller à ce que les trois bandes de tissu sont présents. Incuber pendant 10-15 min à 35 ± 1 ° C. Mélanger tous les 5 min en remuant doucement le tube. Ne pas inverser le tube.

6. sinusal Nœud myocytes Dissociation

  1. Suite à la digestion enzymatique, utilisez l'étroite pipette polie au feu pour transférer doucement les bandes de tissu au premier petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml KB solution à 35 ± 1 ° C. Laver le tissu en remuant doucement le tube.
    Remarque: des bandes de tissus apparaissent peu translucides et peuvent se regrouper au thest le point. Poignée très doucement après digestion enzymatique pour éviter de perdre des cellules.
  2. Transférer le tissu au second petit tube à fond rond contenant 2,5 ml KB à 35 ± 1 ° C. Agiter doucement pour se laver.
  3. Transférer le tissu à la troisième petit tube à fond rond contenant 2,5 ml KB à 35 ± 1 ° C. Agiter doucement pour se laver.
  4. Transférer le tissu au tube large, à fond rond contenant 2,5 ml KB à 35 ± 1 ° C.
  5. Utilisation de la plus grande pipette polie au feu (Figure 1Aiii et la figure 1C), dissocier les cellules dans le grand tube à fond rond par trituration constante à environ 0,5-1 Hz pendant 5-10 minutes, en prenant soin de garder le tube de dissociation immergée dans le 35 ± 1 ° C bain d'eau et d'éviter l'introduction de bulles dans la solution.
    Note: Le temps Trituration varie avec le diamètre de la pipette de dissociation et la force de pipetage. Le temps devrait être ajustée de sorte que les morceaux de tissu restant à til fin de la dissociation semble mince, transparent et vaporeux. Si le tissu conserve toutes les couleurs, la dissociation est susceptible d'être incomplète. Fréquence (0,5-1 Hz) est déterminé par la main.
  6. Retirer le tube à fond rond contenant dissocié SAMs du bain d'eau et équilibrer à la température ambiante pendant 5 min.

7. sinusal Nœud Calcium Re-adaptation (Joué à température ambiante)

NOTE: Pour SAMs destiné à des expériences de culture, les procédures décrites dans la section suivante doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile. Si les SAM doivent être utilisés pour des expériences aiguës, il n'y a pas besoin d'effectuer ces opérations dans un environnement stérile.

  1. Ajouter 75 ul de NaCl / CaCl solution d'adaptation 2 (tableau 2). Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 5 min.
  2. Ajouter 160 pi de NaCl / CaCl 2 Solution d'adaptation. Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 5 min.
  3. Ajouter 390 ul de BSA solution (Tableau 2). Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 4 min.
  4. Ajouter 1,25 ml de solution de BSA. Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 4 min.
  5. Ajouter 4,37 ml de solution de BSA. Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 4 min.
    Remarque: La concentration finale en calcium sera de 1,8 mM.
  6. Après calcium ré-adaptation, collecter des SAMs en permettant de régler par gravité pour ~ 10 min ou par centrifugation à ~ 2.000 g pendant 3 min.
    1. Pour les cellules aiguë isolées, retirez délicatement et jeter environ 5 ml du surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur en verre, en laissant les cellules dans un volume de ~ 2 ml. Conservez ces cellules à la température ambiante jusqu'à environ 8 h pour les enregistrements de patch-clamp.
    2. Pour les cellules en culture, retirer autant de surnageant que possible à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml préchauffé (37 ° C) plaquant moyenne (tableau 2).

8. Placage et Culture de sinusal Myocytes (Aller pour les cellules isolés de manière aiguë)

  1. Éliminer la solution de laminine à partir de lamelles de l'étape 3.3 avec une pipette Pasteur. ensemencer immédiatement 500 pi (~ 50-100 cellules) sur chaque lamelle de laminine revêtu (de l'étape 3).
    NOTE: Le 2,3-butanedione monoxime inhibiteur contractile (BDM) est inclus dans les milieux d'étalement et de la culture afin d' éviter la contraction, ce qui provoque l' usure des cellules 9.
  2. Remettre la plaque de 24 puits contenant SAMs nouvellement ensemencées dans l'incubateur et maintenir à 37 ° C dans une atmosphère de 95% d' air / 5% de CO 2. Permettre aux cellules d'adhérer à lamelles pour 4-6 heures dans les médias de placage (tableau 2).
  3. Retirez délicatement Placage moyen à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Remplacer avec 500 pi par puits de pré-chauffé (37 ° C) Milieu de culture (tableau 2).

9. transduction adénovirale des adultes Cultures myocytes sinusal (Aller pour les cellules isolées Aiguë)

  1. Estimer nombre de CEIIs par lamelle couvre-objet immédiatement avant l'application d'adenovirus en comptant les cellules dans un champ de vision sous un microscope, pour ajuster le grossissement. Comptez toutes les cellules, non seulement GSB.
  2. Diluer adénovirus dans du milieu 199 et ajuster la dilution pour le titre viral de telle sorte que l'application de 1 à 10 ul est nécessaire pour obtenir une multiplicité finale d'infection (MOI) de 100 unités virales par cellule. Ajouter la solution adénovirale dans un goutte à goutte directement sur plaqué GSB.
  3. Incuber les cellules avec le milieu pendant une nuit contenant le virus (~ 12-14 h). Puis échanger avec un milieu de culture frais. Maintenir les cellules dans un incubateur, en changeant le milieu de culture toutes les 48 h jusqu'à ce que l'expression de la protéine désirée soit obtenue.

10. Evaluation fonctionnelle des Aiguë Isolated ou Cultured SAMs

NOTE: Le protocole suivant est un exemple des évaluations fonctionnelles des isolés SAMs en utilisant la technique amphotéricine perforé-patch pour enregistrer les deux points d'accès spontanés et moi 9).

  1. Préparer des solutions d'enregistrement comme décrit dans le tableau 3.
  2. Préparer une solution mère de 20 mg / ml d'amphotéricine-B dans le DMSO frais le jour de l'enregistrement. Gardez stock à la température ambiante et protéger de la lumière. Diluer amphotéricine-B disponible en solution intracellulaire à une concentration finale de 200 ug / ml juste avant utilisation. Maintenir la solution de pipette finale sur la glace et protéger de la lumière.
    NOTE: La solution de pipette contenant amphotéricine pour des expériences doit être préparé horaire en diluant une aliquote de la solution mère dans la solution intracellulaire et tourbillonnement pendant au moins 1 min.
  3. Transférer une aliquote de l'acuité dissociées SAM suspension cellulaire ou un fragment de la lamelle de verre portant culture GSB à une chambre d'enregistrement contenant une solution de Tyrode à 35 ± 1 ° C. Perfuser les cellules avec une solution de Tyrode pendant au moins 2 minutes avant recordin électrophysiologiquegs pour éliminer tout MBD résiduel restant à partir du milieu de culture.
    REMARQUE: les contractions spontanées devraient être évidents immédiatement après le transfert à la solution de Tyrode. SAMs pour l' enregistrement peut être identifié par une combinaison de fonctionnalités , y compris l' activité contractile spontanée, morphologie caractéristique (par exemple., Figure 2), le manque de striures, expression de la protéine HCN4, présence de I f courant, membrane capacitance <50 pF, et spontanés AP avec des formes d'onde qui comprennent une phase de dépolarisation diastolique et un upstroke lent.
  4. Utilisation de pipettes en verre borosilicate avec des résistances de 1,5-3,0 MQ, remplir la pointe avec une solution intracellulaire manquant de l'amphotéricine par trempage pour 10-30 sec. Puis retour-remplir la pipette avec la solution contenant de l'amphotéricine. Un joint d'étanchéité joint cellulaire-GQ devrait être obtenue aussi rapidement que possible. Si la formation de joint est difficile, augmenter le temps tip-remplissage.
    NOTE: La résistance d'accès doit être continusurveillés après la formation du joint cellule attachée, et les enregistrements ne devraient être intentées après l'obtention d'une résistance d'accès stable de <10 MQ.
  5. Pour enregistrer les points d'accès spontanés, passer l'amplificateur en mode courant-clamp rapide sans injection de courant.
    NOTE: 1 nM isoprotérénol est inclus dans la solution de Tyrode extracellulaire lors de l' enregistrement des points d' accès pour stabiliser le taux de tir, comme indiqué précédemment 10.

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Representative Results

Les protocoles décrits ici ont été précédemment employés pour isoler GSB spontanément actifs de souris adultes qui sont appropriés pour une variété de brassage de différentes études de blocage 5-8. En outre, les protocoles permettent de SAMs isolés qui peuvent être maintenues en culture pendant jusqu'à une semaine. Transfert de gène dans les cellules en culture peut être réalisée par l' intermédiaire d'une infection adénovirale 9. Les résultats présentés dans cette section proviennent de nos travaux précédents et sont présentés ici comme exemples des caractéristiques de SAMs aiguë isolées et cultivées.

Comme on le voit sur la figure 2, GSB spontanément active peut être maintenue en culture pendant 6 jours. Les cellules cultivées conservent une morphologie globale qui est très similaire à celle de aiguë isolée Sams, avec aucun changement significatif dans la durée moyenne, la largeur, la section transversale région, ou la capacité de la membrane de culturecellules par rapport aux cellules aiguë isolées (Figure 2B - E). Il y avait cependant l'attrition du nombre de GSB viables au fil du temps dans la culture. Par conséquent, il est recommandé que les cultures soient préparées à partir de cellules mises en commun provenant de plusieurs animaux si le modèle expérimental nécessite de nombreuses séries de données.

Un objectif majeur dans le développement du protocole pour la culture des myocytes sinoatrial de souris adultes était de créer un système qui permettrait l'expression de protéines exogènes dans le contexte cellulaire natif de l'adulte GSB. Un exemple de ce type d'expression de la protéine est représentée sur la figure 3 pour le cas des cellules co-infectées par le virus exprimant les protéines marqueurs fluorescents GFP et mCherry. Nous avons constaté que l' expression des protéines était clairement évidente dans les 24 heures de l' infection adénovirale et était maximale pour les protéines de test dans les 48 heures (figure 3). A MOI virale de 100 a donné lieu à près de 100% infefficacité ection avec aucune preuve de toxicité cellulaire. En revanche, la transfection en utilisant des réactifs à base de lipides a échoué à produire en tout transfert de gène détectable dans des adultes Sams, même après 72 h 9.

Caractérisation fonctionnelle via patch-clamp électrophysiologie est essentiel pour l' évaluation des deux aiguë isolées et cultivées SAMs. La figure 4A montre des enregistrements typiques courant-clamp de potentiels d'action spontanés enregistrés à partir aiguë isolée ou de culture SAMs en utilisant la configuration d'enregistrement perforé-patch l'amphotéricine. Action des formes d' onde potentielles étaient similaires dans aiguë isolées et cultivées SAMs et il n'y avait pas de différence dans le taux d' allumage AP moyenne (figure 4B).

I f est une caractéristique de GSB et les canaux qui produisent HCN4 I f sont utilisés comme marqueurs immunocytochimiques du nœud sino - auriculaire. D'où la prEsence de I f dans les enregistrements de patch clamp peut être utilisé pour soutenir l'idée que les cellules sont en effet GSB. Tous les SAMs aiguës et cultivées spontanément actifs décrits ici également exposées I f> 100 pA en réponse à une étape de tension 1 s à -120 mV. Pour les résultats représentatifs présentés ici, les cellules ont été perfusées avec une solution de Tyrode contenant 1 mM de BaCl2 pour bloquer les courants K + (tableau 3) et la dépendance de la tension d'activation I f a été analysée par trois sec échelons de tension hyperpolarisants -60 à -160 mV à partir d' un potentiel de maintien de -50 mV, comme nous l' avons décrit précédemment 5-8. La densité de courant a été évaluée en réponse à 3 s impulsions de test hyperpolarisant à -150 mV à partir d'un potentiel de maintien de -50 mV. Il n'y avait pas de différence significative , soit la tension dépendance de l' activation ou de la I f I f densité de courant entre aiguë isolées et cultivées GSB (Figure 4C - D). Ces co-enregistrements des APs spontanés et je f de SAMs individuels nécessitent environ 9 min au total (y compris un 2 min lavage initial, 30-60 sec des APs spontanées en mode pince de courant, un changement de solution à 2 min, et environ 5 min à recueillir des données de tension de blocage suffisante pour décrire la dépendance en tension d'activation I f). Par conséquent , les données présentées sur la figure 4C illustrent également la robustesse de la préparation cellulaire.

Figure 1
Figure 1: Les instruments de dissection pour l'isolement et la dissociation de la souris GSB (A) i 10 cm Deux boîtes de Petri contenant ~ 25 ml d' élastomère de silicone durci... Chaque plat est préchargé avec 6-10 petites broches de dissection pour les tissus immobilisant. Ii. Bêcher de 100 ml pour la tenue complète Tyrode dans le 35 &# 176;... C bain d'eau iii large (~ 2 mm de diamètre), la dissociation pipette polie au feu iv Narrow (~ 1,5 mm de diamètre) polie au feu pipette de transfert v pipette de transfert en plastique pour la préparation de bain avec Complete Tyrode avec... forceps de tissu, 5,5 po, 1 x 2 dents pour la manipulation des tissus externes héparine. vi. auto-ouverture micro ciseaux pour les procédures de coupe internes. vii. pinces fines (taille de la pointe de 0,06 x 0,02 mm) pour la manipulation des tissus internes. viii.. ix. iris courbés ciseaux 4.3 dans des procédures de coupe externes. (B) Close-up photo mettant en évidence de petites épingles de dissection placés dans un plat de dissection. (C) Close-up photo mettant en évidence le transfert étroite pipette polie au feu ( à gauche) et à large ouverture pipette feu poli pour la trituration mécanique ( à droite). S'il vous plaît , cliquez ici pour afficher une plus grande version de ce chiffre.

Figure 2
. Figure 2: Pleinement isolées et SAMs cultivées sont morphologiquement indiscernables A:. Images lumineuses de représentant SAMs sur le terrain , soit immédiatement après l' isolement (aiguë) ou après 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, ou 6 jours in vitro B - D : moyenne (± SEM) de longueur maximale, la largeur et la zone de section transversale pour aiguë isolée par rapport à 48 h de culture SAMs E:. moyenne (± SEM) capacité de la membrane à partir d' enregistrements voltage-clamp à partir aiguë isolée ou de culture GSB. Toutes les comparaisons ne sont pas significatives: p> 0,05 vs. aiguë. Adapté de la référence 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3: expression adénovirale de protéines exogènes dans cultivés SAMs champ lumineux et images épifluorescence de représentant culture SAMs qui ont été infectées à une MOI de 100 pour les adénovirus exprimant eGFP (vert) et mCherry (rouge), soit à 24 ou 48 heures après. à double infection. Barre d'échelle = 20 pm. Reproduit de référence 9.

Figure 4
Figure 4: Caractérisation électrophysiologique de culture SAMs A:. Représentatifs des enregistrements de serrage actuels de aiguë isolé (noir) ou de culture (gris) SAMs dans une solution de Tyrode contenant 1 nM d' isoprotérénol. Barres d'échelle: 40 mV, 100 msec B:. Moyenne (± SEM) instantanéetir fréquence aiguë isolé (noir; n = 6) ou 48 heures de culture (gris; n = 14) SAMs C:. moyenne Normalisée (± SEM) relations conductance tension pour I f dans aiguë isolé (noir; n = 8) ou de culture (gris; n = 14) SAMs Insets:.. familles actuelles représentatives des aigus (noir) ou de culture SAMs (gris) provoquée par 3 sec impulsions de test hyperpolarisants -60 à -160 mV par incréments de 10 mV D: moyenne ( ± SEM) I densité de courant f à -150 mV aiguë isolé (noir; n = 7) et cultivées (gris; n = 8) GSB. Adapté de la référence 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Complete Tyrode de faible teneur en Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode KB Medium BSA Solution NaCl / CaCl 2 Solution d' adaptation
NaCl 140 140 140 dix
KCl 5.4 5.4 25 5.4
KH 2 PO 4 1.2 1.2 dix 1.2
HEPES 5 5 5 5
glucose 5.55 18,5 20 5.55
MgCl2 1 1
CaCl2 1.8 0,066 1.8 1.8
taurine 50 20
BSA 1 mg / ml 1 mg / ml 1 mg / ml
K-glutamate 100
K-aspartate dix
MgSO4 2
créatine 5
EGTA 0,5
pH ajusté à 7,4 avec du NaOH 6,9 avec du NaOH 7,2 avec du KOH 7,4 avec du NaOH

Tableau 1:. solutions de dissociation Compositions des solutions utilisées dans la dissociation des myocytes de nœud sinusal. Les concentrations sont données en mM, sauf indication contraire.

Placage Medium Milieu de culture
Media199 base base
2,3-butanedione monoxime (BDM) 10 mM, 10 mM,
Sérum fœtal bovin (FBS) 5% -
Albumine de sérum bovin (BSA) 0,1 mg / ml
Insuline 10 pg / ml
transferrine 5,5 pg / ml
Sélénium 5 ng / ml
Pénicilline 100 U / ml 100 U / ml
Streptomycine 100 mg / ml 100 mg / ml

Tableau 2: Placage et culture solutions Compositions de solutions utilisées pour le placage et la culture de myocytes nœud sinusal..

Tyrode PP intracellulaires
NaCl 140 5
KCl 5.4 135
Kh 2 PO 4 1.2
HEPES 5 dix
glucose 5.55
MgCl2 1 1
CaCl2 1.8 0,1
EGTA dix
Mg-ATP 4
Amphotéricine-B 200 pg / ml selon les besoins
isoprotérénol 1 nm au besoin
pH ajusté à 7,4 avec du NaOH 7,2 avec du KOH

Tableau 3: solutions d'enregistrement d'électrophysiologie Compositions de extracellulaire solutions et la intracellulaire (Tyrode) (PP) utilisés pour amphotéricine enregistrements perforé-plaquées de myocytes de nœud sinusal..

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Discussion

Cet article présente des protocoles détaillés pour l'isolement et la culture de complètement différenciées myocytes nœud sinusal de souris adultes. Le protocole d'isolement produit fiable SAMs de souris spontanément actifs appropriés soit pour l'analyse électrophysiologique immédiate ou la culture subséquente. Des protocoles similaires ont été rapportés par de nombreux autres groupes (par exemple, voir les références 11,12,10,13-17). Cependant, notre protocole pour le maintien de la souris adulte GSB in vitro conserve la morphologie caractéristique, l' activité spontanée, et les propriétés électrophysiologiques des cellules et permet la délivrance de protéines adénoviral 9.

Pour la modification et le dépannage des protocoles, quelques étapes critiques doivent être notés. Le premier facteur critique est une importante variabilité beaucoup à beaucoup dans l'activité des enzymes de digestion (étape 1.4), ce qui peut considérablement modifier le nombre et la qualité des SAMs isolé dans un prépar donnéation. Cette variabilité est particulièrement vrai pour l'élastase, qui nécessite généralement une optimisation spécifique du lot, dans lequel les temps de concentration et d'exposition doivent être bracketing au cours de plusieurs préparations (souvent fait en parallèle) pour maximiser le nombre et la santé cellulaire. Certains protocoles pour l'isolement des SAMs de diverses espèces utilisent la collagénase et la protéase enzymes individuels au lieu de l'enzyme mélange de collagénase-protéase dans le présent protocole. Cependant, la variabilité lot à lot pour chacune de ces enzymes est assez élevée (semblable à celui de l'élastase), nécessitant des cycles répétés de co-optimisation. Le mélange d'enzymes fournit plus de cohérence à travers les lots et nécessite moins d'étapes d'optimisation.

Une deuxième critique, et non évidente, le facteur pour le dépannage de l'isolement SAM est l'intégrité de la dissociation de verre pipette polie au feu (figure 1C). Si le rebord de la pipette contient des arêtes vives, des fissures ou c accumuléeellular débris, l'étape de trituration mécanique peut endommager les cellules, ce qui entraîne une toxicité de calcium. La dissociation pipette polie au feu doit être remplacé au moins tous les 2 mois d'utilisation régulière, ou à tout moment que le rendement de la cellule ou de la qualité diminue sensiblement au cours de plusieurs préparations.

Le moment et la force de la dissociation mécanique est une troisième étape essentielle pour le dépannage du protocole d'isolement. La trituration nécessite lente (environ 0,5-1 Hz), mais la turbulence vigoureuse pendant 5-10 min. des vitesses plus rapides et des temps réduits peuvent également être utilisés, mais il est important d'éviter l'introduction de bulles ou de générer la mousse dans la solution. Lorsque les échantillons de nœud sinusal ont été entièrement dissocié, les bandes de tissu restantes devraient apparaître vaporeux et de couleur blanche; subtile coloration rose-ish indique trituration incomplète. Si l'on examine à 200-400X grossissement, les cellules à partir d'échantillons de façon optimale préparés ont des membranes cellulaires lisses, tandis que memb cellulaireranes de plus digéré ou over-trituré échantillons ont une apparence cratered et striés. Dans les cellules saines, les contractions sont observées principalement comme des tics subtil des extrémités des cellules. Des vagues de contraction sont un signe de cellules endommagées, qui peuvent être observés à se contracter vigoureusement pendant une courte période, avant Balling-up. Une pipette de dissociation fissurée est la cause la plus fréquente de tels dommages cellulaires. Dans les échantillons qui ont été sous-digéré ou sous-trituré, les cellules sont présentes sous forme d'amas ou agrégats au lieu de cellules individuelles, et un nombre important de contracter GSB peuvent être observées dans les morceaux de tissus restants.

Chaque utilisateur aura besoin d'optimiser individuellement la dissociation. Bien que les deux doivent être ajustés à la digestion enzymatique et les temps de dissociation mécanique, il est recommandé de garder d'abord le temps de digestion enzymatique constante tout en modifiant le temps de dissociation. réglage fin supplémentaire repose principalement sur la capacité de l'utilisateur à reconnaître l'unppearance des morceaux de tissu restant à la fin de trituration - lorsque les pièces sont vaporeux et de couleur blanchâtre, la trituration doit être arrêté. L'optimisation est également nécessaire de tenir compte des variations dans le nœud sinusal qui accompagnent les différences d'âge, de sexe, ou de la souche de souris. Par exemple, la dissociation des cellules provenant d' animaux âgés de 7 nécessite une réduction à la fois la digestion enzymatique et les temps de dissociation mécanique. En règle générale, une préparation typique d'un vieux 2-3 mois rendements C57BL / 6 souris mâles environ 50-200 SAMs viable, dont peut-être 5-10 peut être avec succès patch-serré dans la session d'un bon jour, en fonction des expériences . Le rendement est considérablement (~ 30%) plus faible lorsque les souris plus âgées sont utilisés 7.

Le succès du protocole de culture repose également sur quelques étapes clés. Tout d'abord, le succès d'une culture de cellules primaires exige une dissociation de haute qualité, tel que discuté ci-dessus. Il est recommandé d'eà la préparation cellulaire aiguë isolée être optimisé avant d'essayer de maintenir les cellules en culture. Un second facteur critique pour les cellules mises en culture réside dans la sélection de cellules pour des enregistrements électrophysiologiques. Pour de meilleurs résultats, SAMs cultivés sélectionnés pour les enregistrements doivent présenter des contractions spontanées immédiatement après lavage du milieu de culture contenant BDM. Un début lent des contractions spontanées sur wash-out de BDM est un signe de cellules malsaines.

Le système de culture SAM ne possède certaines limites, notamment la très petite taille de la souris SAN. Alors que les méthodes démontrées ici permettent le nombre de cellules suffisant pour les études électrophysiologiques et d'imagerie, la quantité limitée de tissu empêche des analyses biochimiques de culture GSB. Une autre limitation de cette technique est que GSB doit être mis en culture en présence de l'inhibiteur réversible de la myosine ATPase, MBD. Ceci est un problème potentiel parce BDM a d'autres effets cellulaires, y comprisnon spécifique de l' activité de la phosphatase, l' inhibition de la transcription des facteurs 19 cardiaque et l' inhibition des canaux sodiques, les canaux de calcium et des 20 récepteurs de la ryanodine. Toutefois, les données montrent que BDM a des effets minimes sur les propriétés morphologiques et électrophysiologiques de SAMs analysés ici.

Dans les applications futures, il semble probable que les méthodes décrites ici pourraient être adaptés pour préparer des cultures SAM de grands mammifères. En association avec un transfert de gène adénoviral, de telles cultures pourraient permettre des manipulations génétiques de pacemaker dans les grands modèles animaux. La capacité à introduire des protéines d'intérêt fournit également pour des applications futures dans lequel les molécules rapporteurs génétiquement codés peuvent être utilisés pour sonder les voies de signalisation intracellulaires en GSB.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgruard/Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes Fisher Scientific 352059
Large, round bottomed culture tubes Corning 14-959-11B
Elastase Worthington Biochemical LS002279
Liberase TM Roche 5401119001 Tissue dissociation solution
Heparin SAGENT Pharmaceuticals  NDC 25021-400-10
Mouse Laminin Corning CB-354232
12 mm round glass coverslips Fisher  12-545-80
24-well culture plate Fisher 08-772-1
Ad-mCherry Vector Biolabs 1767
Ad-eGFP Vector Biolabs 1060
Plastic, disposable transfer pipette Fisher Scientific
Micro scissors Fisher Scientific 17-467-496
Dumont #4 Forceps Roboz Instruments RS-4904
Tissue Forceps Roboz Instruments RS-8164
Dissecting Iris Scissors WPI, Inc. 501264
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
NaCl Sigma 71376
KCl Sigma 60128
KH2PO4 Sigma 60353
HEPES Sigma 54457
glucose Sigma G0350500
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C1016
taurine Sigma T0625
BSA Sigma A2153
K-glutamate Sigma G1501
K-aspartate Sigma A6558
MgSO4 Sigma M7506
creatine Sigma C0780
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
Amphotericin-B Fisher Scientific 1397-89-3
Isoproterenol Calbiochem 420355
Media199 Sigma M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM) Sigma B0753
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A5611
Insulin   Sigma I3146
Transferrin Sigma I3146
Selenium Sigma I3146
Penicillin GE Healthcare SV30010
Streptomycin Hyclone SV30010

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References

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