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Immunology and Infection

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Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H. J., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

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Abstract

Introduction

3 - 혈액 - 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS) 1 전신 순환을 분리한다. 그것은 세포의 자유 운동과 수용성 분자의 확산을 억제하고 병원체 및 잠재적 유해 물질로부터 뇌를 보호하는 물리적 장벽을 제공한다. 그 장벽 기능에 더하여, BBB는 신경 조직의 적절한 작동을 보장 뇌 실질 조직에 산소와 영양분의 전달을 가능하게한다. BBB를의 기능적 특성은 높은 고도로 전문화되는 EC는 주요 구조 부재 인 상태의 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 조절된다. BBB를되는 EC의 꽉 접합 (TJ) 착체, fenestrations의 부족 pinocytic 매우 낮은 활성 및 완전히 활성 전송 메커니즘의 존재를 특징으로한다. 내피 세포, 성상 세포 엔드 피트 = 관련된 파를 포함 기타 BBB의 구성 요소 EC 기저막, 혈관 주위 세포enchymal 기저막 또한 BBB 2,4의 개발, 유지 보수 및 기능에 기여 - (6)과 함께 뉴런과 마이크로 글 리아와 상기 CNS (7)의 적절한 기능을 가능하게하는 뇌 혈관 부 (NVU) 형성 - 9.

이러한 신경 변성, 염증 또는 감염 질환과 같은 신경 질환의 다양한에서 BBB의 기능을 손상 2,5,10. TJ 복합체 분자 반송기구의 이상 조절은 BBB 침투성 백혈구 혈관 외 유출, 염증 및 신경 손상을 증가하도록 이끈다. 이러한 병태 생리 학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위해, 다양한 시험 관내 BBB 9,11,12 모델을 확립 하였다. 이들은 장벽 무결성, 투과성뿐만 아니라 전송 메커니즘의 변화에 ​​귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 모델은 인간, 마우스, 쥐, 돼지 또는 b의 내피 세포를 사용양의 기원 13-18; 25 - 기본 내피 세포 또는 세포주 생체 (19)보다 밀접 BBB를 모방하기 위해 혈관 주위 세포 및 / 또는 성상 세포와 단종으로 또는 함께 두 배양한다. 최근 몇 년 동안, transendothelial 전기 저항 (봉사자)의 측정은 내피 차단 성 (26, 27)을 평가하기 위해 널리 허용 도구가되었습니다.

티이은 세포 단층을 가로 질러 이온 플럭스 임피던스를 반영하고 그 감소 손상된 내피 장벽 완전성 따라서 증가 된 투과성 민감한 척도를 제공한다. 30 - 다양한 티이 측정 시스템은 상피 Voltohmmeter (EVOM), 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS), 실시간 세포 분석 15,28 등이 개발되었다. 티이 인접되는 EC의 이온 플럭스 (paracellular 행)에 대한 내성을 반사하고 정비례장벽의 무결성. 임피던스 분광 27,31에서는 복잡한 총 임피던스 (Z)가 CCL을 측정함으로써 배리어의 무결성에 대한 추가 정보를 제공하는 측정된다. CCL은 세포막 (세포 횡단 경로)를 통해 용량 성 전류에 관한 것으로, 셀 층은 막의 양쪽에 전하를 분리하는 등가 전기 회로에 캐패시터와 같은 역할을하고 역 장벽 완전성에 비례한다. 투과성 인서트 상에 성장하면되는 EC가 부착 증식 미다 공막에 걸쳐. 이것은 (자체 커패시터처럼 동작)과 그것의 최소 레벨에 도달 할 때까지, 용량의 감소로 연결 삽입물의 배경 전류 용량 저항. 이것은 TJ의 설립 뒤에 것은 인접되는 EC 사이의 공간 떨어져 그 인감 복합체. 이 paracellular 경로를 통해 이온 플럭스를 제한하고, 그것의 고원에 도달 할 때까지 봉사자는 증가한다. 염증성 조건 하에서, 그러나, endotheli알 배리어가 손상되어 TJ가 방해받을 착물 삽입물의 용량 성 성분이 다시 상승을 CCL 증가로 티이 감소한다.

우리 티이 측정은 자동 세포 모니터링 시스템 (32)을 사용하여 그 임피던스 분광법의 원리를 따르고 이전 어플리케이션을 확장한다. 여기, 우리는 면역 세포와 뇌 내피 세포의 상호 작용을 포함하는 차단 성 연구를 가능하게하는 생체 외 BBB 모델을 설명; 특히 활성화 된 T 세포이다. 37 - 이러한 병태 생리 학적 조건은 다중 경화증 및 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (33)와 CNS의자가 면역 질환에서 관찰된다. 여기서, 중요한 단계는 전역 BBB encephalitogenic, 미엘린 특정 T 세포의 윤회이다. 이것은 뇌 실질에 혈관 주위 공간과 항목에서의 재 활성화 뒤에, 그들은 다른 면역 세포를 모집하고 저 곳diate 염증 및 후속 탈수 초화 1,35,38. 그러나, 이러한 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용의 분자 메커니즘은 BBB의 주성분은 잘 이해되지 않는다. 우리의 프로토콜은이 격차를 작성하고 활성화 된 T 세포와의 직접 접촉하고 복잡한 상호 작용에 따라 내피 세포 (즉, 장벽 무결성 및 투자율)의 결과에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 것을 목표로하고있다.

여기에 설명 된 프로토콜은 미세 다공성 멤브레인 투과성 인서트에 단층으로 성장 기본 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포를 사용한다. 내피 세포를 공 배양된다 polyclonally 또는 항원 특이 적 방식으로 어느 사전 - 활성화 될 수있는 CD4 + T 세포와. 활성화 미리 아니지만 나이브 T 세포 MBMECs 공동 배양 티이 감소하고 MBMEC 부전 및 장벽 파괴의 정량적 측정 값을 제공 CCL의 증가를 유도한다. 기술비 침습적이다 : 그것은 내장 대신 EC 단층의 주요 교란을 방지 젓가락 전극의 사용; 세포 마커의 사용없이 장벽 기능을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 이 자동화 된 방식으로 연속적인 계측을 동시에 시간에 따른 두 개의 장벽 파라미터 (티이 및 CCL)의 독립적 인 평가를 가능하게한다. 상기 방법은 또한 다른 T 세포 활성화의 수준 및 EC를 그러한 T 세포의 효과를 구별 할 정도로 민감하다.

그것은 기능 분석의 넓은 범위에서 사용할 수있다 : 염증 과정에 연루 다른 사이토 카인 및 / 또는 케모카인은 MBMECs 및 T 세포의 공동 배양에 첨가 될 수있다; EC의 또는 T 세포 양측에 세포 부착 분자에 대한 차단 항체를 사용할 수있다; 및 T 세포 활성화 마커 또는 세포 용해 특성의 억제제는 T 세포 프라이밍 또는 내장 컴퓨터와의 공동 - 배양 동안 첨가 될 수있다. 분석은 T 세포 윤회에 유용분석법은 T 세포를 첨가하기 전에 MBMEC 단층 무결성 품질 관리 역할을 할 수있다. 이 모든 것은이 방법을 EC 단층 무결성 활성화 T 세포의 효과에 초점을 시험 관내에서 BBB를 연구하는 다용도 공구를 신뢰할 수있다. 이것은 자기 반응성 encephalitogenic T 세포는 BBB를 통과 염증 및 신경 손상을 일으킬 MS 및 동물 모델 EAE 같은자가 면역 질환의 발병 기전에서 BBB 중단의 메커니즘을 이해하는데 특히 중요하다.

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Protocol

동물 보호를위한 독일 가이드 라인에 따라 모든 실험에서, 쥐 사육하고 뮌스터 대학의 중앙 동물 시설에서 특정 병원균이없는 조건에서 유지했다. 모든 실험은 동물 실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행 노르 트라 인베스트 팔렌, 독일 (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217)의 지방 당국에 의해 승인되었다.

1. MBMEC 분리 및 문화

참고 : 이전에 다음과 같이 수정하여 상세 (14)에 설명 된대로 MBMECs을 분리 :

  1. CO 2 흡입 (6-8 주 이전) (20) 성인 C57BL / 6 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는 그들의 죽음을 확인합니다.
  2. 70 % 에탄올로 마우스를 씻어 가위를 사용하여 목을 벨; 집게와 가위를 사용하여 두피를 제거합니다. 난원 매그넘부터 두개골의 좌우에 절개를 만든다. 그것의 꼬리 측과 탁에서 두개골을 들어 올려집게로 뇌를 전자.
  3. 층류 후드 만 피질 유지 페트리 접시에 뇌를 배치하고, 뇌간, 소뇌 및 시상을 제거 무균 핀셋을 사용한다.
    참고 : 현미경의 사용이 단계의 필요하지 않습니다.
  4. 멸균 웨스턴 블로 팅 종이 위에 피질을 놓고 수막 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 핀셋으로 가볍게 롤하지 않습니다.
  5. (프로토콜 14 아래) 기계적 및 효소 분해 후 긴 멸균 바늘과 5 ml의 플런저를 사용하여 밀도 구배에서 내피 세포를 수집한다. 내피 세포는 적혈구와 레드 링 위의 어두운 층으로 나타납니다. 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에이 계층의 양도 20 ~ 25 ml의; DMEM과 튜브를 맨.
  6. 세탁기 (14)의 두 라운드 후, 퓨로 마이신을 함유 MBMEC 매체 (4 μg의 / ㎖)의 용액에 6 세포를 재현 탁하고, 24 웰 플레이트의 웰에 코팅 여섯을 시드; 조직에서 그들을 떠나37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양을 사흘 동안 (여기서부터 "인큐베이터 '이라 함).
    참고 : MBMEC 코팅 용액의 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.
  7. 퓨로 마이신없이 신선한 MBMEC 매체의 각 웰에 1 ml에 첨가하여 배지를 변경; 두 개 더 일 다시 37 ° C와 5 % CO 2의 접시를 넣어.

2. 수확 MBMECs

  1. MBMEC 분리 후 5 일째에, MBMEC 코팅액으로 미리 도포 투과성 인서트 : 인서트 당 용액 80 μl를 첨가하고 3 시간 동안 CO 2, 37 ℃ 그대로두고 5 %.
  2. 조심스럽게 코팅 용액을 피펫 30 분 동안 삽입 자연 건조를 할 수 있습니다. 매체 씻어 MBMECs을 사용하여 웰 플레이트의 각 실온 2 ㎖ (RT) PBS 추가; 이 단계를 반복합니다. 0.05 % 트립신 - EDTA (물론 당 300 μl를) 추가하고 5 ~ 10 분 동안 인큐베이터에서 접시를 둡니다.
  3. 중지 각 웰에 MBMEC 매체의 2 ML을 추가트립신. 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 수집 된 세포를 전송하고 4 ℃에서 8 분 동안 700 XG에 그들을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 퓨로 마이신없이 MBMEC 매체의 1 ml의 세포를 재현 탁.
  4. 세포를 계산; 0.04 % 트리 판 블루 90 μL (세포의 10 배 희석)와 세포 현탁액의 10 μl를 섞는다. 피펫 유리 커버 셀 카운팅 챔버 (혈구) 사이 혼합물 10 μL. 챔버 (N)의 네 사분면에 트리 판 블루 무료 세포를 카운트하고 카운트 세포 (N ')의 평균 수를 결정 다음과 같이 N'= N / 4.
  5. 다음 식을 사용하여 (106 세포 / ㎖로) 세포 농도를 계산 : C = N '× 104는 혈구의 크기에 의해 지정된 10 단계 2.4에서 희석 계수이다 × 10 × 104.
  6. 시드 인서트 당 260 μL의 부피에 2 × 104 세포. 물론 각각의 하부 구획에 MBMEC 매체의 810 μl를 추가. 섹션 4를 진행 준비가 될 때까지 인큐베이터에 삽입와 함께 접시를 놓습니다.
    참고 : 상부 및 하부 구획의 볼륨을 삽입 특정하고 모든 24 웰 형식에 대해 작동하지 않습니다.

3. CD4 + T 세포의 분리 및 자극

  1. CD4 + T 세포 분리
    1. CO 2 흡입에 의해 (6-8 주 이전) 성인 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는하여 죽음을 확인합니다.
    2. 깨끗한 절개 보드의 뒷면에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 씻어; 비장과 림프절 (사타구니, 겨드랑이, 상완과 자궁 경부를) 복막을 열고 제거 멸균 가위와 집게를 사용; 마지막으로, 얼음 PBS 5 ㎖를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 조직을 옮긴다.
    3. 층류 후드에서 상부에 70 μm의 셀 스트레이너와 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 조직을 PBS로 경사 분리하여 조직을 전송; 균질화스트레이너를 통해 1 ML의 플런저를 눌러 조직.
    4. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기를 30 ML을 추가합니다. 상청액을 폐기하고 FACS 완충액 10ml에 세포를 재현 탁. 튜브에 FACS 버퍼의 또 다른 20 ㎖를 추가, 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 정지를 필터링합니다.
    5. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 그것을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 FACS 버퍼 500 μL의 세포를 재현 탁.
    6. 마우스 CD4 자기 마이크로 비즈의 20 μl를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기를 25 ML을 추가합니다.
    7. 한편, 자석 내로 LS 분리 컬럼을 배치하고 FACS 완충액 3 ㎖로 씻어. 뜨는을 취소하고 FACS 버퍼의 3 ml의 세포를 재현 탁.
    8. 컬럼에 셀을 추가합니다. 세 번 버퍼 FACS 3 ㎖에 열을 씻으십시오. 자석에서 열을 제거하고 새 15 ML의 센트리에 배치fugation 튜브. , FACS 버퍼의 5 ML을 추가 5 분 4 °에 C 500 XG에 열 플런저와 원심 분리기를 가진 레이블 세포를 세척합니다.
    9. 상층 액을 제거하고 T 세포의 배지 3 ㎖에 세포를 재현 탁. 웰당 배지 100 ㎕에 2.4 종자에 1 × 105 세포를 바와 같이 세포를 카운트.
  2. CD4 + T 세포 자극
    1. 클론 성 CD4 + T 세포 자극
      1. 사전 코트 원하는 최종 농도에서 정제 된 항 - 마우스 CD3 항체 PBS에서 (복제 145-2C11)와 둥근 바닥 96 웰 플레이트. 예를 들어, 1 μg의 / ㎖에서 α-CD3와 전체 판 코트를 미리하는 PBS, 소용돌이의 5 ml의 항체의 10 μL (주 농도 = 0.5 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 혼합의 50 μl를 추가 잘 멀티 채널 피펫 각.
      2. 3 시간 동안 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. T 세포를 분리 한 후, PBS로 두 번 프리 코팅 된 플레이트를 세척한다. (복제 정제 된 항 CD28 항체 추가원하는 최종 농도 절연 T 세포 (행 37.51) 예를 들면, 1 μg의 / ㎖)에서; 잘 섞다. T 세포를 시드 및 2-3 일 동안 인큐베이터에서 그들을 떠난다.
    2. 수지상 세포와 항원 특이 적 CD4 + T 세포 자극
      참고 : DC가 항원 제시 세포 (장갑차)로 사용하는 경우, 이러한 예외를 제외하고, T 세포 분리를위한 프로토콜을 따르십시오
      1. 비장을 균질화하기 전에, 0.5 ㎎ / ㎖로 PBS에 콜라게나 형 IA 1 ㎖로 주입하고, 15 mL의 원심 분리 튜브로 옮긴다.
      2. 15 분간 37 ℃ 수조에서 인큐베이션. PBS로 세척 한 후, FACS 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 20 마우스의 CD11c 자성 마이크로 비즈의 μL 대신 CD4 마이크로 비드를 추가합니다.
      3. 석사 분리 컬럼 및 적절한 볼륨을 사용하여 FACS 버퍼 1 ㎖에 열을 씻어; FACS 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 FACS 완충액 3 회 1 ㎖로 칼럼을 세척 하였다.
      4. 광고수지상 세포 (예를 들면, 수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG) AA 35-55 20 μg의 / ㎖)에 대한 선택의 D 항원이 잘 혼합 종자 5 × 104 세포 T 세포 배양액 100 ㎕에 당 96 라운드 - 바텀 잘.
      5. 프로토콜 T에 대한 세포 분리에 기재된 바와 같이, 끝 부분 96 둥근 바닥 웰 당 T 세포 배양액 100 ㎕에 1 × 105 T 세포를 추가한다.
    3. B 세포 항원 특이 적 CD4 + T 세포 자극
      참고 : B 세포 장갑차로 사용하는 경우, 이러한 예외를 제외하고, T 세포 분리를위한 프로토콜을 따르십시오
      1. 누구의 B 세포 (B 세포 특히 MOG 35-55을 인식 예를 들어, IGH MOG (목) 마우스,) 항원 - 특정 형질 전환 마우스에서 비장을 사용합니다.
      2. (TCR MOG (2D2) 생쥐에서 예) 항원 특이 적 T 세포를 사용한다. 마우스 CD19 자기 마이크로 비드 대신 CD4 마이크로 비드의 20 μl를 추가합니다.
      3. 는 B CEL에 선택의 항원을 추가LS (예, 20 μg의 / ㎖에서 MOG 35-55)은 96 둥근 바닥 웰 당 B 세포 배양액 100 ㎕를 5 × 104 세포를 잘 혼합 종자.
      4. 당 T 세포 배양액 100 ㎕에 1 × 105 T 세포를 추가 96 둥근 바닥 웰, T 세포의 분리를위한 프로토콜에 기술 된 바와 같이.

4. 설치 및 봉사자 측정을 수행

  1. 층류 후드 아래 봉사자 상품의 24 웰 모듈을 놓습니다. 집게를 사용하여 기기에 MBMECs으로 뚜껑과 장소 삽입물을 제거합니다.
  2. 모듈 우물의 하부 구획에 새로운 매체의 810 μl를 피펫 : 삽입 잘 모듈의 벽 사이에 조심스럽게 추가합니다.
  3. 뚜껑을 닫고 인큐베이터에서 악기를 배치합니다. 그 컴퓨터에 기기를 연결; 악기 컨트롤러를 켜고 소프트웨어를 엽니 다.
  4. 팝업 창에서 '새로운 측정'을 선택합니다. 체CK '쇼 봉사자'와 '쇼 CCL'상자; 다음 Enter 키를 눌러 '시작'. 첫 번째 측정을 완료 한 후, 모든 봉사자 및 CCL 값을 볼 수있는 '결과'탭에서 '모든 우물을 검사'를 선택합니다.
  5. '파일 이름'> 다른 이름으로 저장> 파일 : 파일을 저장합니다.
    주 : 티이 및 CCL 연속적 자동화 된 방식으로 측정 된 바와 같이, 3 내지 5 일의 기간에 걸쳐 이들 값을 감시한다. 세포 생존 능력이 최적이 아닌 봉사자의 증가의 부족에 의해 시각으로 매체를 변경하면, 필요하지 않습니다.
  6. CCL은 안정 미만 1 μF / cm 2이고, 티이가 최대 레벨에 도달 할 때 T 세포 MBMECs 공동 배양하기위한 시점을 선택한다.
  7. 조심스럽게 절대 봉사자 및 CCL 값을 검사하고 MBMECs는 우물을 취소하여 합류 충분히 단일 층을 개발하지 않은있는 우물을 제외 할 수 있습니다.
  8. 그룹 우물의 나머지 : 잘 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '새 평균 아니라 잘 추가'를 선택합니다. 남팝업 창에 전자; 모든 개별 웰 그룹화하는 동일한 기능을 수행.
  9. 그들 모두가 공동 문화 이전과 같은 초기 조건이 있는지 확인하기 위해 평균 우물을 확인합니다. 어떤 유의 한 차이의 절대 값 티이 있거나 티이 경사면, 또는 표준 오차가 너무 큰 경우, 그룹핑을 다시.
    참고 : 우물의 최적의 그룹 내에서 실험 그룹 사이에 모두 봉사자 값에 최소한의 변화를 제공합니다.
  10. '실험'탭을 눌러 '일시 정지', 악기를 분리하고 인큐베이터 밖으로 가져 가라. 층류 후드 아래에 뚜껑을 제거합니다.
  11. 준비 미리 활성화 원하는, 또는 특정 사이토 카인, 항체 또는 다른 물질없이 그리고 / 또는 나이브 T 세포 : 제조 T 그래피 믹스 NA / LE 래트 항 마우스 IFN-γ 항체 (클론 XGM1.2) 예를 들어 세포의 봉사자 악기의 웰 당 20 μg의 / ㎖에서.
    참고 사항 : 그랜 자임 B 억제제 같은 물질을 사용하는 경우, 그들은되는T 세포 자극의 처음에 T 세포 배양 dded : 예, 그랜 자임 B 억제제 II (Calbiochem 사)를 DMSO 10 μM의 최종 농도 절연 T 세포와 혼합된다. 자세한 내용은 재료 및 장비를 참조하십시오.
  12. 삽입의 매체 (상부 잘 함)의 일부를 제거 (가 MBMEC 단일 층을 방해 할 수있는 모든 매체가 피해야한다 제거) 예를 들어, 조심스럽게 150 μL를 피펫.
  13. 조심스럽게 2 × 10 5 세포 / 삽입을 포함하는 배지 150 μl를 피펫 팅에 의해 MBMECs에 T 세포를 추가합니다.
    주 : 사전 활성화 된 T 세포를 수확하는 경우에만, 트리 판 블루 세포 무 발파를 계산.
  14. 뚜껑을 닫고 다시 인큐베이터에 악기를 배치합니다. 악기를 눌러 '이력서 측정'을 다시 연결합니다. 하고 '실험'탭에서 24 시간을 눌러 '정지'후 파일 (파일> 저장)를 저장합니다.

5. 데이터 내보내기 및 통계 분석

  1. [파일]> [내보내기]를 선택하여 결과를 내 보냅니다.
  2. 팝업 윈도우의 "설정"탭에서 "필드 구분 기호"옵션에서 "소수 구분"옵션 "을 .dot"와 "도표 작성"을 선택합니다.
  3. "내보내기 결과"탭에서, 파일 이름을 모든 우물을 내보낼 확인하고 "데이터 선택"옵션에서 "봉사자"및 "CCL"확인란을 선택합니다.
  4. 보도는 "수출 데이터는"내 보낸 파일을 열고, 스프레드 시트에 데이터를 복사합니다.
  5. 공동 문화 전에 마지막 시점의 설정 봉사자 및 CCL 값을 100 %로 다른 모든 위해 따라 값을 변경 : (각 실행 (측정 주어진 봉사자 및 CCL 값으로, 각 복제으로 분류)) 내 보낸 데이터를 정상화 '100 %'실행에 대해 실행됩니다.
  6. 개별 웰을 이용하여 각 처리 군에 대한 평균의 표준 오차를 표시하는 그래프를 생성하기 원하는 소프트웨어 정규화 된 데이터를 복사한다.
  7. 피선택의 통계 소프트웨어를 사용하여 다중 비교에 대한 페로 니 보정과 양방향 ANOVA 통계 테스트를 erform.

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Representative Results

도 1은 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되는 시험 관내 BBB 모델의 일반적인 개요를 제공한다. 실험은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 뇌 피질에서 기본 MBMECs 단리하고, 5 일 동안 문화이다. 이들이 세포 배양 접시에서 컨 플루 언스에 도달하면 MBMECs는 트립신 처리하고 티이 구에 배치 투과성 인서트로 시드된다. 봉사자와 MBMECs의 CCL은 연속적으로 측정하고 3 ~ 5 일의 기간 동안 모니터링됩니다. 한편, T 세포는 고립 자극 (2 단계), 그리고 2 ~ 5 일, 종류와 자극의 강도 배양. 단계 3에서, T 세포에 첨가하고, CCL 안정된 로우 레벨이고 티이이 최대 레벨 일 때 MBMECs 함께 공동 - 배양 하였다. 봉사자가 고원에서 아직 공동 문화에 대해이 시점을 선택하는 것은 성공을 위해 매우 중요하다전체 측정. 그 T 세포는 ECS에 그들의 첨가시 활성화하여 원하는 레벨에 도달하도록 따라서는 T 세포의 분리 및 자극 시점은 신중하게 선택하는 것이 매우 중요하다. T 세포를 첨가 한 후, 측정을 하루 더 재개하고 그 결과를 분석한다.

초기 5 일간 배양 한 후, MBMECs 쉽게 특성 스핀들 모양의 형태 (그림 2A, 왼쪽 패널)을 표시하고 이러한 PECAM-1과 클라우딘-5 (그림 2A, 중간과 오른쪽 패널)와 같은 내피 세포 특이 적 마커를 표현한다. 그러나, 이것만으로도 그들의 완전한 합류 적절한 배리어 무결성 충분한 증거를 제공하지는 않는다. 임피던스 분광은, 다른 한편으로는, 단층의 무결성 양호한 추정치를 제공하고 잘 기능 분석의 수행 전에 각각의 품질 관리 역할을한다. 도 2b에서, 대부분웰 그 CCL 값 안정 낮았다 MBMECs를 들어, 그들의 티이 값 정체기에 도달 하였다. 이들 웰은 다음 공동 배양 실험에 사용 하였다. 이들은 내 및 그룹 간의 차이는 T 세포 (도 2c)을 추가하기 전에 최소이었다하는 방식으로 분류 하였다. 그들이 모호한 결과 나 데이터의 잘못된 해석으로 이어질 것 같은 그의 봉사자 값 (예 : 그림 2B에 표시된 파란색 곡선 등) 나머지 유의 한 차이 웰은 사용되지 않았다.

MBMEC 문화와 T 세포 자극에 대한 초기 요구 사항이 충족되는지 제공, 임피던스 분광은 T 세포 EC의 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 도 3a 및도 3b에 도시 된 바와 같이 티이 측정은 이러한 상호 작용의 기본 판독 및 T 세포 - 매개 EC 부전의 척도 역할을 할 수있다. 이 경우, MBMECs는 미세 0.4로 삽입에 성장T 세포가 삽입 막을 통과하는 것을 허용하지 않는다 μm의 직경. 도 3a는 자극 것을 보여 주지만, CCL에 티이 감소 및 증가에 의해 결정되지 나이브 T 세포는 EC 장애를 유도 할 수있다. 나이브 T 세포는 이에 나이브 T 세포는 초기 수준에서 유지와 공동 배양시 티이 및 CCL 때문에, 음성 대조군으로서 제공 할 수있다. 예외 (약간 상이한 온도 및 pH 값을 가질 수있다 세포 새로운 배지를 첨가하고, 뚜껑을 닫고, 뚜껑을 해제) 기기를 취급으로 인한 공동 배양의 시작에서의 피크이다. 이 이슈는 봉사자 측정의 모든 종류의 표시 및 분석 중에 무시됩니다. EC 염증을 유도 할 수있는 것으로 알려진 염증성 사이토 카인 IFN-γ과 (100 ~ 500 U / ㎖로) TNF-α의 첨가는 양성 대조군으로 사용할 수있다. 도 3a에, MOG 35-55 특이 적 CD4 (예를 들면, 정제 된 안티 - 마우스 CD28 및 CD3 항체 포함) (도 3B). 여기서, 자극의 길이, T 세포 활성화의 수준은 따라서, 변화 하였다. T 세포는 α-CD3 및 α-CD28 항체를 동일한 양으로 자극하고, 3 일 동안 배양 한 사람 만 이틀 동안 배양 T 세포에 비하여 배리어 방해하는 큰 경향을 발휘 하였다.

상술 MBMEC 단층 분열의 메커니즘을 조사하기 위해, 다양한 방법이 사용될 수있다. 도 3C의 결과는 그 자극 된 T 세포를 보여준다, 그러나 그 상청액 T 세포 MBMECs 직접 접촉은 장벽 파괴에 중요한 것을 나타내는 MBMECs에 상당한 손상을 일으켰다. 또한, 중화 α-I의 추가봉사자 측정시 FN-γ 항체는 약간 IFN-γ이 중단의 주요 원인이되지 않을 수 있음을 시사 MBMEC 배리어 성을 향상시켰다. 한편, T 세포 배양에 첨가 그랜 자임 B 억제제 II (도 3d)는 MBMEC 손상 및 티이 후속 감소를 유발하는 중요한 플레이어로이 세포 용해 분자를 가리키는 큰 정도로 MBMEC 무결성을 복구.

EC 단층 무결성 T 세포의 효과에 대한 기본 판독로서의 용도 외에, 티이 측정은 또한 T 세포 윤회 분석과 같은 다른 분석에 앞서 장벽 완전성의 품질 관리에 사용될 수있다. 직경이 3 μm의 미세 기공이 사용으로이 경우, 삽입합니다. 도 3e에서, 봉사자 측정 MBMEC 단층 후속 transmigratio 대한 T 세포를 첨가하기 전에 모든 웰 무결성 동일한 레벨되었는지 확인하기 위해 수행되었다n 개의 분석. 이것은 transmigrated T 세포의 절대 수를 결정하기 위해 셀 카운트 비드를 사용하여, α-CD4 항체 및 세포 계측 분석 흐름 T 세포를 염색 악기 웰의 하부 구획에서 T 세포의 채취에 의해 수행 하였다; ) 중간과 오른쪽 그림 3E에 도시. 들은도 3a에서와 같이 미리 활성화 되었더라도, 티이의 실질적인 감소를 초래하지 않았다 윤회 사용 T 세포를 자극 참고. 이전 39 관찰되었다 이것은 면역 세포가 윤회하는 동안 사용할 수있는 세포 횡단 노선을 반영 할 수있다. 도 3f에서, MBMECs와 웰의 절반은 IFN-γ 및 TNF-α (염증. uninflamed 대)와 염증하고, 나중에, 나이브 T 세포는 transmigratory 활성의 평가를 하였다. 이 경우, 티이 측정은 T 세포가 transmigratio 첨가되어야하는 강력한 사이토킨과 염증이고 때에 대한 단서를 제공엔.

그림 4는 봉사자 결과의 오해가 발생할 수있는 가장 일반적인 상황의 일부를 보여줍니다. 도 4A에서, 예를 들어, 모든 MBMECs 동시에 완전히 융합 단층을 개발 하였다. 그룹 ( '나이브 T 세포 - 배제') 중 하나는 그 TJ 착체 단지 T 세포를 첨가하기 전에 다른 그룹에 비하여 다른 비율로 성숙되었다 MBMECs를 함유 하였다. 이 그룹은 따라서 실험 기간 동안 100 % 상술 티이 값을 개발하여 상기 분석에서 제외 하였다. 따라서, 실험 전에 티이 곡선 (TJ 성숙 율)의 기울기가 적절한 데이터 해석 티이 절대 값만큼 중요하다. 도 4b는 공동 문화를 시작하는 것이 아니라 너무 일찍뿐만 아니라 너무 늦게 잘못된 결과를 가져올 수 있음을 보여줍니다. 여기서, 자극 T 세포 그룹 및 음성 대조군 모두에서 (중간 창E), 티이 값은 이미 고원을 통과하고 실험 조건에서 독립적으로 감소하기 시작하고, 따라서 전 실험 기간 동안 최적 배양 조건을 지시했다. 이러한 그룹이 분석에 포함되지 않아야한다. 티이 및 CCL 일반적 티이의 큰 감소 CCL의 큰 증가를 수반하는 방식으로 그 값을 변경할 수 있지만, 최종적으로, 이것은 항상 그런 것은 아니다. 도 4c에서, T 세포는 B는 티이에서 크게 감소하지만,이 한 자극 T 세포보다 CCL에 작은 증가를 야기 자극.

그림 1
그림 1 : 기술의 일반 개요. 초기 배양 후 MBMECs은 투과성 인서트 상에 시드되고 자동화 된 전지 모니터에 넣고; 봉사자 및 CCL 4-5 일 동안 매 시간마다 측정한다. 한편, T 세포는 시험 관내에서 활성화 된 (40)으로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : MBMECs는 생체 외 BBB 모델에 적합한 합류 단층을 개발한다. (A) 스핀들 형상의 형태 (왼쪽) 및 PECAM-1 (중간) 및 클라우딘 -5- (오른쪽) MBMEC 분리 후 5 일의 면역 형광 염색. (BC) 봉사자 및 CCL 값 (B) 이전에 개별 우물 후 (C) 그룹, 사전 tT 세포의 O를 추가. 이 잘 MBMECs 다른 우물에서의 높은 봉사자를 개발하지 않았기 때문에 (B)의 파란색 곡선은 실험에 사용되지 않습니다. (C) 쇼의 데이터는 ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 대표 결과. T 세포와의 상호 작용에 따라 MBMEC 부전의 주요 척도로서 봉사자에 (AD) 변경. (A) MOG 특이 T 세포를 5 일 동안 MOG 35-55 펩티드의 존재 MOG 특정 B 세포에 의해 활성화되었다. 나이브 T 세포 및 염증성 사이토 카인 IFN-γ와 TNF-α (100 U / ㎖에서 모두) 각각 음성 및 양성 대조군으로 봉사했다. (B) T 세포 MBMECs에 추가하기 전에, α-CD3 및 α-CD28 항체 (1 μg의이 씩으로) 2-3 일 용으로는 표시 / 자극 하였다. (A (같이 미리 활성화)) (C) T 세포 또는 α-IFN-γ 항체 또는 상응하는 아이소 타입 컨트롤의 존재 하에서 그 상층 액. 그랜 자임 B 억제제 II 또는 희석제 DMSO의 존재 하에서 이틀 동안 ((B)과 미리 활성화) (D) T 세포. (EF) T 세포 윤회 전에 배리어의 무결성을위한 품질 관리로만 사용 티이 측정. MBMECs는 직경이 3 μm의 구멍에 삽입 성장 하였다. (A)에 기재된 바와 같이 (E) T 세포는 18 시간 (왼쪽)에 대해 윤회하도록 자극 할 수 있었다. 이어서, 이들은 셀 카운팅 구슬 (중앙 및 우측)을 사용하여, α-CD4 항체 (클론 RM4-4)에 대한 염색 및 유동 세포 계측법으로 분석 수확 하였다. (F)IFN-γ 및 TNF-α 및 윤회 분석에 대한 T 세포의 후속 첨가의 적절한 시점을 선택 자극에 따라 MBMEC 단층 무결성 모니터링. (AF) 결과 기술 삼중를 보여 3 개의 독립적 인 실험을 각각 대표. 데이터 쇼는 ± SEM을 의미한다. (E, 오른쪽)에서 페어는 학생의 t 테스트를 두 꼬리. **, P <0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 실제적인 고려 사항과 데이터 해석. (A) 한 실험군 (적색 곡선)에서 MBMECs는 다른 다른 GR 비교 한 자신의 접합부 단지의 성숙의 속도 때문에, 분석에서 제외 하였다oups. (B) MBMEC 장애의 적절한 평가를 방지 너무 늦게 T 세포를 추가의 예. 자극 된 T 세포 'A'에 의하여 중단되면 (C) (검정 곡선) MBMECs CCL의 값이 동일한 T 세포에 의한 봉사자에 동반 감소 기대되는 것보다 더 크게 증가 하였다. (AC) T 세포는 이틀 동안 α-CD28 항체 (1 μg의 / ㎖ 각각) α-CD3 자극 하였다. 결과는 기술 삼중를 보여 3 개의 독립적 인 실험을 각각 대표. 데이터 쇼는 ± SEM을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

기술 된 프로토콜의 여러 단계를 성공적으로 실험에 필수적이다. 초기 MBMEC 분리 및 배양 동안, 작업 진균 포자 또는 세균 세포 배양의 오염을 방지하기 위해, 가능한 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요하다. 내장 컴퓨터의 순수 배양을 얻기 위해서는이되는 EC 생존 가능 제 사흘 퓨로 마이신을 함유하는 배지가 아닌 다른 세포 유형 (특히 혈관 주위 세포) (41, 42)을 사용하도록 권장한다. 특별한주의 가치 다른 중요한 단계는 사전 - 활성화 된 T 세포를 추가하는 정확한 시점을 식별한다. 봉사자 측정 MBMECs의 첫 48 시간 동안 투과 삽입에 증식과 서로 간의 간격을 닫습니다. 안정된 낮은 수준 (약 0.6 μF / cm 2)에 도달 할 때까지 따라서, CCL은 감소한다. 이 합류 EC 단층의 첫 징후이지만, 아직 단단한 장벽의 상징이 아니다. 후에 만CCL을은 봉사자가 증가하기 시작 않는 안정적인 수준에 도달했습니다. TJ 착체가 완전히 형성되고 EC 배리어가 완전히 밀폐되면 티이가 최대 레벨에 도달한다. 이 고원은 보통되는 EC 시드 후 3 ~ 5 일에 도달하고 또 다른 24 ~ 36 시간 동안 유지된다. T 세포를 추가하기위한 최선의 시점은 ECS에 여전히 충분히 공 배양 할 수있는 T 세포 생존하도록 보장 고원의 시작이다. T 세포 활성화는 안전하게 예측할 수 공 배양을위한 최적 시점 전에 개시해야 같이,이 타이밍의 유연성을 증가시키기 위해 두 개의 다른 날 T 세포의 두 배치를 촉진하는 것이 바람직 할 수있다. 마지막 MBMECs로 T 세포를 첨가하기 전에 개별 복제 웰 내에 그룹화하고 그룹 간의 변화를 최소화하는 방식으로 수행되어야한다. 이 초기 조건 T 세포 MBMECs의 공동 - 배양 동안 모든 그룹들 중 동일한 것을 보장한다. 우리의 프로토콜은 사전에 활성화 된 CD4 + T 세포와 기본 마우스 뇌되는 EC의 공동 문화 중에 봉사자 측정을 설명합니다. 간단한 형태는 과학적 필요에 따라, 다수의 변형을 허용한다. 예를 들어, 자극의 종류, 강도 및 지속 기간은 변할 수있다. 항원 특이 적 CD4 + T 세포는 적절한 항원 제시 세포 (APC를)의 존재하에 그들의 동족 항원에 의해 활성화 될 수있다; 대안 적으로, T 세포는 polyclonally α-CD3 및 α-CD28 항체에 의해 활성화 될 수있다. T 세포 활성화 상태는 억제제 항체를 차단하는 각종 사이토 카인에 의해 조절 될 수있다. 이 후자의 쇼 덜 제한 TJ 건물 및 높은 투자율은 일차 전지 (43)에 비해 것으로 알려져있다으로 내피 세포 라인과 기본 뇌되는 EC 교체는, 그러나,하지 않는 것이 좋습니다. 기본으로 리드 티이 측정에 더하여,이 프로토콜은 EC의 monolay 좋은 품질 제어를 제공한다T 세포 윤회 분석 (도 3E, F)에 앞서 ER 무결성. 참고로, 봉사자 값은 반드시 MBMECs (그림 3E)에서 T 세포의 윤회 동안 감소하지 않을 수 있습니다 이전에 39,44 관찰 한 바와 같이이 면역 세포가 윤회하는 동안 사용할 수있는 세포 횡단 노선을 반영 할 수있다.

활성화 된 T 세포 공동 배양시 EC 부전을 유발 같이, 티이 동일한 조건의 실험에 걸쳐 유사한 정상 예측 감소를 나타낸다. 티이에서 큰 감소는 일반적으로 큰 CCL 동반 증가를 수반한다. 드문 경우이긴하지만, CCL의 증가는 봉사자 (그림 4C)의 해당 감소에서 예상되는 것보다 더 발음이 될 수 있습니다. 이러한 불일치는 EC 단층 붕괴의 다양한 측면을 반영 할 수있다. 내장 컴퓨터가 장벽 붕괴 동안 형성 격차를 닫으려고, 그들은 동적 변화를 겪을 수 있습니다이러한 돌출부를 형성하고, CCL 극적 급속한 증가에 기여할 수 모두 총 표면적을 증가시키는 등의 형태 및 운동. 이것은 티이의 변화에 ​​비해, CCL의 변화가 적은 예측한다. 따라서, 봉사자의 감소의 수준이 손상 장벽의 무결성의 가장 신뢰할 수있는 대표적인 측정 남아있다.

이 분석은 내피 세포 장벽 특성을 조사하기 위해 다른 기술들에 의해 보완 될 수있다. 그것은 중단 EC 단층 (44)을 통해 확산되는 다양한 크기의 분자의 양을 측정하는 투과성 분석에 선행 할 수있다. 이를 위해, 예컨대 플루오 레세 인 및 텍사스 레드와 같은 형광 표지 덱스 트란 복합체가 사용될 수있다; 다른 분자 추적기도 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 수 크로스, 만니톨, 알부민, 에반스 블루와 고추 냉이 퍼 옥시 다제) 26. 또한, 면역 형광 현미경 단백질 발현의 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다와 TJ과 세포 접착 분자의 세포 지역화. 제시된 BBB 모델은 매우 간단하지만, 얻어진 결과보다 생리적 조건 하에서 상기 분석을 위해 유용한 방향을 제공 할 수있다. 이러한 분석법을 포함 (이에 국한되지 않는다)이 BBB의 전체 복잡성을 고려하여 마우스 생활에 정적 조건에서 에반스 블루 분사 생체 투과성이 분석에서 얻어진 티이 측정 보완 체외 전단 유동 검정.

민감하고 신뢰할 수 있지만, 여기에서 설명하는 방법은 특별한 관심을받을 자격이 특정 제한 사항이 있습니다. 우리의 실험 장치에서 측정 된 최대 봉사자 값은 35 ~ 40의 값 Ωcm 2에 도달한다. 이러한 티이 값은 서로 다른 유형의 세포와 무 세포 성분이 BBB의 무결성에 기여 생체 내에서보다 훨씬 낮은, 그러나 또한 티이 시험관 BBB 모델 다른 달성 값들만큼 높지 않다 <SUP> 26,45,46. (49) - 이는 현저 27,47 배리어 성을 향상시키기 위해 도시 된 EC 매체에 대한 히드로 코르티손의 첨가에 의해 개선 될 수있다. 그러나 이러한 물질의 사용 - 항 염증 및 면역 억제 효과를 갖는 것으로 알려져 - 모든 기능 분석에 적합하지 않다. 특정 프로토콜의 초점 배리어 무결성 EC-T 세포 상호 작용의 결과에있는 바와 같이, 해석 하이드로의 첨가에 의해 방해된다. 그러므로 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 EC 장벽 기능 장애를 일으키는 것으로 자극 T 세포의 진정한 염증성 전위의 평가를 가능하게한다. 이 문헌에보고 된 다른 티이 값을 직접 비교주의 할 것을 주목할 가치가있다. 이러한 값들은 실험 구성에 크게 의존하며, 그들은 (셀 밀도, 미디어, 세포 성장 영역 및 티이 측정 시스템 시드, 다른 세포 유형으로 얻어 예 </ EM> 전극의 디자인 및 크기).

시험관 BBB 모델 복잡한 내장 컴퓨터가 삽입 멤브레인의 대향 측 혈관 주위 세포와 공 배양하는 경우, 확립 된, 더 자세히 생체 상황을 모방하기 위해, 또는 혈관 주위 세포와 성상 세포가 웰의 바닥에 성장되는 곳 12,25,50 - 52. 이러한 공 배양 시스템에서, 상이한 세포 유형 간의 크로스 토크 (cross-talk)는 트리플 공동 배양 물은 생체 내 상황 닮은 따라서 높은 티이 값을 제공하는데 최선 인과 배리어의 강한 조임을 가능하게한다. 이러한 시스템의 복잡성, 다른 한편으로는, 시험관 BBB 모델로서의 넓은 용도에 제한을 야기.

이 모델의 또 다른 제한은 장벽 (53, 54)의 무결성을 개선하기 위해 도시 된 전단 응력의 부족이다. 이 문제를 극복하기 위해 새로운 동적 BBB 모델은 최근에 도입되었다 : ECS는 생체 (55, 56)를 미세 혈관 더 밀접하게 모방, 중공 섬유에서 배양과 맥동 유동 조건을 실시한다.

요약하면,이 프로토콜은 임피던스 분광법에 기초 BBB의 시험 관내 모델을 설명한다. 활성화 된 T 세포를 일차 마우스 뇌 내피 세포의 상호 작용에 초점을 맞추고, 상기 방법은 직접 접촉시 배리어 성 연구를 허용한다. 이 예는 BBB encephalitogenic T 세포와의 상호 작용의 EC 중에 노출되는 것을 특징으로하는 다발성 경화증 및 동물 모델 EAE, CNS 염증성 질환의 발달에 중요한 단계들을 이해하는데 특히 중요하다. 설명 된 분석은 항체, 사이토 카인 및 T 세포 활성화의 억제제로서 차단 물질의 넓은 범위를 사용하여 이러한 상호 작용의 대상이 변조의 결과를 조사 할 수있다. 상기 방법은, 신뢰성 있고 민감한 비 침습적 A는봉사자 및 CCL의 차 측정은 자동화 된 방식으로 수행된다. 이 모든 것이 BBB 모델의 풍부한 바디에 새 레이어를 추가하는 유용하고 다양한 도구가 있습니다. 그것은 구체적으로 MS와 같은자가 면역 질환에서 관찰 병태 생리 학적 조건에서 BBB 속성에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.

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Acknowledgments

우리는 봉사자 측정에 관한 도움이 토론 아니카 Engbers과 우수한 기술 지원을위한 프랭크 커스 박사 마르쿠스 SCHAFER (nanoAnalytics GmbH의)에 감사하고 있습니다. 이 작품은, HW 및 LK, CRC TR128에 SFB1009 프로젝트 A03는 A08 돌출 독일 연구 협회 (DFG)에 의해 지원되었다; Z1 및 B01는 LK 및 LK에 HW 및 (뮌스터의 의료 학부) 임상 연구를위한 학제 ​​간 센터 허가 번호 KL2 / 14분의 2,015합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts - pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

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References

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