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Immunology and Infection

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Kuzmanov, I., Herrmann, A. M., Galla, H. J., Meuth, S. G., Wiendl, H., Klotz, L. An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction. J. Vis. Exp. (118), e54592, doi:10.3791/54592 (2016).

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Abstract

Introduction

La barrera sangre-cerebro separa la circulación sistémica desde el sistema nervioso central (CNS) 1-3. Proporciona una barrera física que impide la libre circulación de las células y la difusión de las moléculas solubles en agua y protege al cerebro de los agentes patógenos y sustancias potencialmente dañinas. Además de su función de barrera, la acreditación permite la entrega de oxígeno y nutrientes a la parénquima cerebral, lo que garantiza el correcto funcionamiento del tejido neuronal. Propiedades funcionales de la BHE son altamente reguladas por sus componentes celulares y acelulares, con muy especializado EC siendo su principal elemento estructural. ECs de la BBB se caracterizan por la presencia de uniones estrechas (TJ) complejos, la falta de fenestraciones, extremadamente baja actividad de pinocitosis, y los mecanismos de transporte permanentemente activos. Otros componentes de la acreditación de la membrana basal CE, pericitos incrustar el endotelio, pies terminales astrocíticos y = par asociadoenchymal membrana basal también contribuir al desarrollo, el mantenimiento y la función de la BBB 2,4 - 6 y, junto con las neuronas y la microglia, forman la unidad neurovascular (NVU), que permite buen funcionamiento del CNS 7-9.

En una variedad de enfermedades neurológicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias o infecciosas, la función de la BBB se ve comprometida 2,5,10. La desregulación de TJ complejos y mecanismos de transporte molecular conduce a una mayor permeabilidad de la BHE, la extravasación de leucocitos, la inflamación y el daño neuronal. Con el fin de estudiar BBB propiedades bajo tales condiciones fisiopatológicas, varios modelos de BBB in vitro han establecido 9,11,12. Juntos han proporcionado información valiosa sobre los cambios de la integridad de la barrera, permeabilidad, así como mecanismos de transporte. Estos modelos emplean células endoteliales de los humanos, de ratón, rata, porcino o b13 de origen ovino - 18; células endoteliales primarias o líneas de células son cultivadas, ya sea como un monocultivo o junto con los pericitos y / o los astrocitos en el fin de imitar más de cerca la BBB in vivo 19-25. En los últimos años, la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se ha convertido en una herramienta ampliamente aceptada para evaluar las propiedades de barrera endotelial 26,27.

TEER refleja la impedancia al flujo de iones a través de la monocapa celular y su disminución proporciona una medida sensible de la integridad de la barrera endotelial en peligro y, por consiguiente aumento de la permeabilidad. Varios sistemas de medida de TEER se han desarrollado, incluyendo epitelial Voltohmmeter (Evom), eléctrica de la célula-sustrato Impedance Sensing (IEM), y el análisis de células en tiempo real 15,28 - 30. TEER refleja la resistencia al flujo de iones entre ECs adyacentes (ruta paracelular) y es directamente proporcional a laintegridad de la barrera. En espectroscopía de impedancia 27,31, se mide la impedancia total del complejo (Z), que proporciona información adicional acerca de la integridad de la barrera midiendo CCL. Ccl se refiere a la corriente capacitiva a través de la membrana celular (ruta transcelular): la capa de células actúa como un condensador en el circuito eléctrico equivalente, la separación de las cargas en ambos lados de la membrana y es inversamente proporcional a la integridad de la barrera. Cuando se cultiva en insertos permeables, EC se adhieren, proliferan y se extiende sobre la membrana microporosa. Esto se opone a la corriente capacitiva de fondo del inserto (que a su vez actúa como un condensador) y conduce a una disminución de la capacitancia hasta que alcanza su nivel mínimo. Esto es seguido por el establecimiento de TJ complejos que sellar el espacio entre ECs adyacentes. Esto restringe el flujo de iones a través de la ruta paracelular, y TEER aumenta hasta que alcanza su meseta. Bajo condiciones inflamatorias, sin embargo, el endothelial barrera se ve comprometida: TEER disminuye como complejos de conseguir interrumpido TJ y Ccl aumenta a medida que el componente capacitivo de la pieza de inserción se eleva de nuevo.

Nuestra medición TEER utiliza el sistema automatizado de monitoreo de células 32: se sigue el principio de la espectroscopia de impedancia y se extiende sus aplicaciones anteriores. Aquí, se describe un modelo in vitro en la acreditación que permite el estudio de las propiedades de barrera, incluyendo la interacción de endotelio cerebral con células inmunes; en las células T activadas específicas. Tales condiciones fisiopatológicas se observan en las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central, tales como la esclerosis múltiple y su modelo animal experimental la encefalomielitis autoinmune 33-37. Aquí, un paso crucial es la transmigración de las células T encefalitogénicas, específicas para la mielina a través de la barrera hematoencefálica. Esto es seguido por su reactivación en el espacio perivascular y entrada en el parénquima cerebral, donde se reclutan otras células inmunes y mela inflamación y la posterior desmielinización inme- 1,35,38. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la interacción entre tales células T y las células endoteliales, los principales constituyentes de la BBB, no están bien comprendidos. Nuestro protocolo pretende llenar este vacío y dar nuevos conocimientos sobre las consecuencias sobre las células endoteliales (es decir, integridad de la barrera y permeabilidad) tras su contacto directo y compleja interacción con células T activadas.

El protocolo descrito aquí hace uso de células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón primario, cultivadas como una monocapa en insertos permeables con membranas microporosas. Las células endoteliales son co-cultivadas con células T CD4 +, que se pueden pre-activadas policlonal o de una manera específica de antígeno. Co-cultivo de MBMECs con células T pre-activadas, pero no ingenua induce una disminución de la TEER y un aumento en Ccl, que proporciona una medida cuantitativa de la disfunción y la perturbación de la barrera MBMEC. La técnicaes no invasiva: utiliza una función de lugar de electrodos palillos, que impiden importante perturbación de la monocapa CE; que puede ser utilizado para controlar la función de barrera sin el uso de marcadores de células. Se realiza mediciones continuas de forma automatizada y permite una evaluación independiente de los dos parámetros de barrera (TEER y CCL) de forma simultánea en el tiempo. El método también es lo suficientemente sensible para distinguir entre diferentes niveles de activación de las células T y los efectos de tales células T en ECs.

Se puede utilizar en una amplia gama de ensayos funcionales: diferentes citocinas y / o quimiocinas implicadas en los procesos inflamatorios se pueden añadir a la co-cultivo de MBMECs y las células T; bloquea anticuerpos contra moléculas de adhesión celular ya sea en el lado de la CE o de células T se pueden utilizar; e inhibidores de los marcadores de activación de células T o de sus propiedades citolíticas se pueden añadir durante el cebado de células T o de su co-cultivo con ECs. El ensayo también es útil para la transmigración de las células Tensayos, ya que puede servir como un control de calidad de la integridad de la monocapa MBMEC antes de la adición de las células T. Todo esto hace que este método una herramienta versátil y fiable para estudiar la acreditación in vitro, con un enfoque en el efecto de las células T activadas en la integridad de la monocapa CE. Esto es de particular importancia para la comprensión de los mecanismos de la disrupción de la BHE en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes, como la esclerosis múltiple y su modelo animal de EAE, donde las células autorreactivas, encefalitogénicas T cruzan la barrera hematoencefálica y causan inflamación y daño neuronal.

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Protocol

Para todos los experimentos, los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos en la instalación central de los animales en la Universidad de Münster, de acuerdo con las directrices alemanas para el cuidado de animales. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comité de ética de los animales experimentales y aprobados por las autoridades locales de Renania del Norte-Westfalia, Alemania (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC Aislamiento y cultivo

NOTA: Aislar MBMECs como se ha descrito anteriormente en detalle 14 con las siguientes modificaciones:

  1. Sacrificar 20 adultos ratones C57BL / 6 (6-8 semanas de edad) mediante inhalación de CO2 y confirmar su muerte mediante la determinación de un paro cardíaco y respiratorio.
  2. Enjuague el ratón con un 70% de etanol y decapitar a ella con unas tijeras; quitar el cuero cabelludo con pinzas y tijeras. Hacer incisiones en el lado izquierdo y derecho del cráneo, a partir del foramen magnum. Levantar el cráneo de su lado caudal y take el cerebro con fórceps.
  3. Bajo una campana de flujo laminar, el uso de fórceps estériles para colocar el cerebro en una placa de Petri y quitar el tallo cerebral, el cerebelo y tálamo, manteniendo sólo la corteza.
    NOTA: El uso de un microscopio no es necesaria para cualquiera de estos pasos.
  4. Coloque la corteza en un pedazo de papel de Western Blot estéril y rodar suavemente con unas pinzas hasta las meninges ya no son visibles.
  5. Después de la digestión mecánica y enzimática (siguiendo el protocolo 14), recoger las células endoteliales de la gradiente de densidad mediante el uso de una aguja estéril de largo y un émbolo 5 ml. Las células endoteliales aparecen como una capa turbia por encima del anillo rojo con eritrocitos. Transferencia de 20 a 25 ml de esta capa en un nuevo tubo de 50 ml de la centrifugación; llenar el tubo con DMEM.
  6. Después de dos rondas de lavado 14, volver a suspender las células en 6 ml de medio MBMEC que contiene puromicina (4 mg / ml) y sembrarlos en seis pocillos recubiertos de una placa de 24 pocillos; dejarlos en un tejidoincubadora de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 (referido como 'incubadora' de aquí en adelante) durante tres días.
    NOTA: Para obtener información detallada de solución de revestimiento MBMEC, ver Tabla de Materiales.
  7. Cambiar el medio mediante la adición de 1 ml a cada pocillo de medio fresco sin MBMEC puromicina; poner la placa posterior a 37 ° C y 5% de CO2 durante dos días más.

2. La recolección MBMECs

  1. En el quinto día después del aislamiento MBMEC, pre-capa insertos permeables con MBMEC solución de revestimiento: añaden 80 l de solución por cada inserto y se dejan a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 3 horas.
  2. pipetear con cuidado de la solución de revestimiento y dejar que el aire seco insertos durante 30 minutos. Añadir 2 ml de la temperatura ambiente (RT) PBS a cada pocillo de la placa, utilizando MBMECs para lavar el medio; repita este paso. Añadir 0,05% de tripsina-EDTA (300 l por pocillo) y se deja la placa en la incubadora durante 5 a 10 min.
  3. Añadir 2 ml de medio MBMEC a cada pocillo para detenertripsinización. Transferencia de las células recogidas a un tubo de 15 ml centrifugación y centrifugar a 700 xg ellos durante 8 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio MBMEC sin puromicina.
  4. Contar las células; mezclar 10 l de suspensión de células con 90 l de 0,04% de azul de tripano (10X de dilución de las células). Pipeta de 10 l de esta mezcla entre la cubierta de vidrio y la cámara de recuento de células (hemocitómetro). Contar las células Trypan Blue-libres en los cuatro cuadrantes de la cámara (N) y determinar el número medio de células contadas (N ') de la siguiente manera: N' = N / 4.
  5. Calcular la concentración de células (en 10 6 células / ml) usando la siguiente fórmula: C = N 'x 10 4 x 10, donde 10 4 está dado por las dimensiones del hemocitómetro y 10 es el factor de dilución de la etapa 2.4.
  6. Seed 2 x 10 4 células en un volumen de 260 l por inserción. Añadir 810 l de medio MBMEC al compartimiento inferior de cada pocillo. Coloque la placa con inserciones en la incubadora hasta que esté listo para proceder con la sección 4.
    NOTA: Los volúmenes para el compartimiento superior e inferior son de inserción-específica y no funcionan para todos los formatos de 24 pocillos.

3. T CD4 + aislamiento de células y Estimulación

  1. Aislamiento de células T CD4 +
    1. Sacrificar a un ratón adulto (6-8 semanas de edad) mediante inhalación de CO2 y confirme su muerte mediante la determinación de un paro cardíaco y respiratorio.
    2. Coloca el ratón sobre su espalda en una tabla de disección limpia y enjuague con etanol al 70%; utilizar tijeras y pinzas estériles para abrir el peritoneo y quitar el bazo y los ganglios inguinales (, axilar, braquial y cervicales); finalmente, transferir el tejido en un tubo de 15 ml de la centrifugación que contiene 5 ml de PBS en hielo.
    3. Bajo la campana de flujo laminar, transferir el tejido por decantación PBS con el tejido en un tubo de centrifugación de 50 ml con un filtro de 70 micras de células en la parte superior; homogenizarel tejido presionando con un émbolo de 1 ml a través del filtro.
    4. Añadir 30 ml de tampón de FACS y se centrifuga que a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de tampón de FACS. Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 40 m, añadir otros 20 ml de tampón FACS para el tubo.
    5. Centrifugar que a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón de FACS.
    6. Añadir 20 l de microperlas magnéticas ratón CD4, mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C. Añadir 25 ml de tampón de FACS y se centrifuga que a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Mientras tanto, colocar una columna de separación de LS en el imán y enjuagarlo con 3 ml de tampón FACS. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de tampón de FACS.
    8. Añadir células a la columna. Lavar la columna con 3 ml de tampón FACS tres veces. Retirar la columna del imán y colocarlo en un nuevo 15 ml centrifugation tubo. Añadir 5 ml de tampón FACS, eliminar las células marcadas con el émbolo de la columna y centrifugar a 500 xg durante 5 min 4 ° C.
    9. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de medio de células T. Contar las células como se describe en 2.4 y semilla de 1 x 10 5 células en 100 l de medio por pocillo.
  2. Estimulación de células T CD4 +
    1. La estimulación de células T policlonales CD4 +
      1. Pre-recubrir una placa de 96 pocillos de fondo redondo con purificada anticuerpo anti-CD3 de ratón (clon 145-2C11) en PBS, a una concentración final deseada. Por ejemplo, para pre-capa de la placa llena con α-CD3 a 1 g / ml, mezclar 10 l de anticuerpo (concentración stock = 0,5 mg / ml) con 5 ml de PBS, vórtice y añadir 50 l de la mezcla de cada pocillo con una pipeta multicanal.
      2. Deja la placa en la incubadora durante 3 horas. Después de aislar las células T, se lava la placa pre-recubierto dos veces con PBS. Añadir anticuerpo anti-CD28 purificado (clon37,51) a células aisladas T a una concentración final deseada (por ejemplo, en 1 mg / ml); mezclar bien. Sembrar las células T y los dejan en la incubadora durante dos o tres días.
    2. La estimulación de las células T CD4 + específicas de antígeno con las células dendríticas (DC)
      NOTA: Si se utilizan los DC como células presentadoras de antígeno (APC), siga el Protocolo para el aislamiento de células T, con las siguientes excepciones:
      1. Antes de la homogeneización del bazo, inyectar con 1 ml de colagenasa tipo IA en PBS a 0,5 mg / ml y la transfiere a un tubo de centrifugación de 15 ml.
      2. Incubar en baño de agua a 37 ° C durante 15 minutos. Después de lavar con PBS, resuspender el precipitado en tampón FACS y se añaden 20 l de microperlas magnéticas CD11c ratón, en lugar de las microperlas de CD4.
      3. Utilice una columna de separación de la EM y los volúmenes apropiados: lavar la columna con 1 ml de tampón de FACS; Resuspender las células en 1 ml de tampón de FACS y se lava la columna con 1 ml de tampón FACS tres veces.
      4. Anunciod antígeno de elección a los DC (por ejemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) aa 35 a 55 a 20 g / ml), mezclar bien y semillas 5 x 10 4 células en 100 l de medio de cultivo de células T por 96-round-bottom bien.
      5. Añadir 1 x 10 5 T células en 100 l de medio de cultivo de células T por 96-de fondo redondo de pocillos al final, como se describe en el Protocolo para el aislamiento de células T.
    3. La estimulación de células T CD4 + específicas de antígeno con las células B
      NOTA: Si se utilizan las células B como APC, seguir el Protocolo para el aislamiento de células T, con las siguientes excepciones:
      1. Utilice el bazo de los ratones transgénicos cuyas células B son antígeno-específica (por ejemplo, ratones, CIB MOG (Th), cuyas células B reconocen específicamente MOG 35-55).
      2. Utilizar las células T específicas de antígeno (por ejemplo, a partir de TCR MOG (2D2) ratones). Añadir 20 l de microperlas magnéticas CD19 de ratón en lugar de microesferas de CD4.
      3. Añadir el antígeno de elección para el cel Bls (por ejemplo, MOG 35-55 a 20 mg / ml), se mezclan bien y la semilla 5 x 10 4 células en 100 l de medio de cultivo de células B por 96-de fondo redondo de pocillos.
      4. Añadir 1 x 10 5 células T en 100 l de medio de cultivo de células T por 96 de fondo redondo, bueno, tal como se describe en el Protocolo para el aislamiento de células T.

4. Configuración y realización de Medición TEER

  1. Coloque el módulo de 24 pocillos del instrumento TEER bajo la campana de flujo laminar. Retire las tapas y colocar insertos con MBMECs en el instrumento utilizando fórceps.
  2. Pipetear 810 l de medio fresco para el compartimiento inferior de los pozos del módulo: añadir con cuidado entre la inserción y la pared del módulo también.
  3. Cierre las tapas y colocar el instrumento en la incubadora. Conectar el instrumento a su equipo; encienda el controlador del instrumento y abrir el software.
  4. Seleccione 'nueva medición "en la ventana emergente. Check 'mostrar TEER "y cajas" mostrar Ccl'; a continuación, pulse 'start'. Después de completar la primera medición, seleccione 'comprobar todos los pozos "en la pestaña" resultados "para ver todos los valores de TEER y CCL.
  5. Guarde el archivo: Archivo> Guardar como> 'el nombre de su archivo'.
    NOTA: Como TEER y CCL se miden continuamente de forma automatizada, monitorear sus valores durante un período de tres a cinco días. Cambiar el medio no es necesario, a menos que la viabilidad celular no es óptima, como se visualiza por una falta de aumento de la TEER.
  6. Elija el punto de tiempo para co-cultivo con células T MBMECs cuando Ccl es estable y menor que 1 mF / cm 2 y TEER ha alcanzado su nivel máximo.
  7. Inspeccione cuidadosamente los valores absolutos de TEER y CCL y excluir a los pocillos en los que no se han desarrollado MBMECs confluentes suficientes monocapas desactivando dichos pozos.
  8. Grupo el resto de los pozos: haga clic derecho en un pozo y seleccione 'poner así al nuevo pozo promedio ". Name en la ventana emergente; hacer lo mismo para todos los pozos individuales a agruparse.
  9. Compruebe todos los pozos promedio confirmar que todos ellos tienen las mismas condiciones iniciales antes de la co-cultivo. Si algunos tienen significativamente diferentes valores absolutos de TEER o TEER pistas, o los errores estándar son demasiado grandes, rehacer la agrupación.
    NOTA: La agrupación óptima de pozos proporciona una mínima variación en los valores de TEER, tanto dentro como entre los grupos experimentales.
  10. En la pestaña "experimento", presione "pausa", desconecte el instrumento y lo saca de la incubadora. Retire las tapas bajo la campana de flujo laminar.
  11. Preparar pre-activado y / o células T ingenuas, con o sin citoquinas, anticuerpos específicos u otras sustancias, según se desee: Por ejemplo: Mezcla purificada de rata NA / LE anticuerpo anti-ratón de IFN-γ (XGM1.2 clon) con preparados T células, en 20 mg / ml por pocillo de la TEER instrumento.
    NOTA: Si se utilizan sustancias como el inhibidor de la granzima B, que son unadded para el cultivo de células T al comienzo de la estimulación de células T: por ejemplo, granzima B Inhibitor II (Calbiochem) se mezcla con las células T aisladas a una concentración final de 10 mM en DMSO. Ver Materiales y Equipos para más detalles.
  12. Eliminar parte del medio de la inserción (el compartimiento del pozo superior): por ejemplo, cuidado de la pipeta 150 l (quitar todo el medio debe evitarse, como puede perturbar la monocapa MBMEC).
  13. Añadir las células T para MBMECs pipeteando cuidadosamente 150 ml de medio que contenía 2 x 10 5 células / inserto.
    NOTA: En la cosecha de células T pre-activadas, contar sólo la voladura, células de azul de tripano-libres.
  14. Cierre las tapas y colocar el instrumento de vuelta a la incubadora. Vuelva a conectar el instrumento y pulse 'reanudar mediciones'. Después de 24 horas, pulse "stop" en la pestaña "experimento" y guardar el archivo (Archivo> Guardar).

5. Exportación de datos y análisis estadístico

  1. Exportar los resultados seleccionando Archivo> Exportar.
  2. En la pestaña "Configuración" de la ventana emergente, seleccione ".dot" en la opción "separador decimal" y "tabulador" en la opción "delimitador de campo".
  3. En la pestaña "resultados de exportación", nombre del archivo, comprobar todos los pozos destinados a la exportación, y comprobar el "TEER" y cajas "Ccl" en la opción "elegir de datos".
  4. Pulse "exportar datos", abra el archivo exportado, y copiar los datos a una hoja de cálculo.
  5. Normalizar los datos exportados (ordenados por cada réplica, con valores de TEER y CCL dadas para cada ejecución (medición)): los valores Conjunto de TEER y CCL del último punto de tiempo antes de que el co-cultivo de 100% y modificar en consecuencia los valores de todos los demás carreras, con relación a la carrera '100%'.
  6. Copiar los datos normalizados a un software de elección para generar un gráfico, utilizando pozos individuales y mostrar el error estándar de la media para cada grupo de tratamiento.
  7. PAGealice de dos vías prueba estadística ANOVA con la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples, usando el software estadístico de elección.

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Representative Results

La Figura 1 proporciona una visión general del modelo in vitro acreditación utilizado para estudiar la interacción entre las células T y las células endoteliales. El experimento consiste en tres pasos principales. El primer paso es el aislamiento de MBMECs primarios a partir de cortezas cerebrales y su cultura durante cinco días. Cuando alcanzan la confluencia en la placa de cultivo celular, MBMECs se tratan con tripsina y se sembraron de nuevo en insertos permeables, que luego se colocan en el instrumento TEER. La TEER y CCL de MBMECs se mide y supervisa continuamente durante un período de tres a cinco días. Mientras tanto, las células T son aisladas, estimulado (paso 2), y se cultivaron durante dos a cinco días, el tipo y la fuerza del estímulo. En el paso 3, se añaden las células T para y co-cultivadas con MBMECs cuando Ccl está en un nivel bajo y estable y la TEER se encuentra en su nivel máximo. La elección de este punto en el tiempo para el co-cultivo cuando la TEER se encuentra todavía en su meseta es crucial para el éxitode toda la medición. Por lo tanto, es extremadamente importante que el punto de tiempo para el aislamiento de células T y la estimulación es cuidadosamente elegido, de modo que las células T alcanzan el nivel deseado de activación en el momento de su adición a la ECs. Después de la adición de las células T, la medición se reanudó durante un día más y se analizan los resultados.

Después de que el cultivo inicial de cinco días, MBMECs fácilmente muestran morfología característica en forma de huso (Figura 2A, panel izquierdo) y expresan marcadores específicos de células endoteliales, tales como (paneles de la derecha la figura 2A, medio e) PECAM-1 y Claudín-5. Sin embargo, esto por sí solo no proporciona pruebas suficientes de su confluencia completa y adecuada integridad de la barrera. espectroscopía de impedancia, por otra parte, da una buena estimación de la integridad de la monocapa y sirve como un control de calidad de cada pocillo antes de la actuación de un ensayo funcional. En la Figura 2B, la mayor parte de lapozos contenía MBMECs cuyos valores de TCC se baja y estable, y sus valores de TEER llegó a una meseta. Estos pozos se utilizaron para los experimentos de co-cultivo posterior. Se agruparon de tal manera que la varianza dentro de y entre los grupos fue mínimo antes de añadir las células T (Figura 2C). Los pozos cuyos valores TEER difería significativamente del resto (por ejemplo, la curva azul indica en la figura 2B) no se utilizaron, ya que daría lugar a resultados ambiguos o mala interpretación de los datos.

Siempre que se hayan cumplido los requisitos iniciales para la cultura MBMEC y la estimulación de las células T, espectroscopía de impedancia puede dar información valiosa sobre la interacción de las células T-CE. Medición TEER puede servir como la lectura principal de tal interacción y una medida de la disfunción CE mediada por células T, como se muestra en la Figura 3A y 3B. En este caso, MBMECs se cultivan en insertos con microporos 0,4m de diámetro, que no permite a las células T para pasar a través de la membrana de inserción. La Figura 3A muestra que sólo estimula, pero no las células T ingenuas son capaces de inducir la disfunción CE, como se determina por una disminución de la TEER y aumento de Ccl. Naïve células T pueden por lo tanto servir como un control negativo, ya que la TEER y CCL durante el co-cultivo con células T vírgenes permanecen en sus niveles iniciales. La excepción es el pico en el comienzo de la co-cultivo, causado por la manipulación del instrumento (los párpados, la adición de medio nuevo con células que pueden tener ligeramente diferentes temperaturas y valores de pH, y el cierre de las tapas). Este artefacto aparece con todo tipo de mediciones de TEER y se ignora durante el análisis. La adición de las citoquinas pro-inflamatorias IFN-gamma y TNF-a (a 100-500 U / ml), que se sabe que son capaces de inducir la inflamación CE, se puede utilizar como control positivo. En la Figura 3A, MOG 35-55 CD4 específicos de (por ejemplo, con purificada anti-CD3 de ratón y los anticuerpos CD28) (Figura 3B). Aquí, la longitud del estímulo, y en consecuencia el nivel de activación de las células T, se varió. Las células T se estimularon por la misma cantidad de anticuerpos a-CD28 α-CD3 y, y las cultivadas durante tres días mostraron una mayor propensión a la ruptura de la barrera en comparación con las células T cultivadas durante sólo dos días.

Con el fin de investigar los mecanismos de la alteración de las monocapas MBMEC descrito, varios enfoques pueden ser utilizados. Resultados en la Figura 3C muestran que las células T estimuladas, pero no sus sobrenadantes causaron un daño sustancial a los MBMECs, lo que indica que el contacto directo entre las células T y MBMECs es crítico para la alteración de la barrera. Por otra parte, la adición de una neutralización de α-Ianticuerpo FN-γ durante la medición TEER sólo ligeramente mejores propiedades de barrera MBMEC, lo que sugiere que el IFN-γ puede no ser la causa principal de esta interrupción. Por otro lado, la adición de la granzima B Inhibitor II para el cultivo de células T (Figura 3D) restauró la integridad MBMEC en mayor medida, que apunta a esta molécula citolítica como un jugador importante en la causa de daños MBMEC y la posterior disminución de la TEER.

Además de su uso como una lectura principal para el efecto de las células T en integridad de la monocapa CE, la medición de la TEER también se puede utilizar como un control de calidad de integridad de la barrera antes de otros ensayos, tales como ensayo de transmigración de células T. En este caso, se inserta con se utilizan microporos de 3 micras de diámetro. En la Figura 3E, la medición de la TEER se realizó con el fin de asegurar que MBMEC monocapa era del mismo nivel de integridad en todos los pocillos antes de la adición de las células T para transmigratio subsiguienteEnsayo n. Esto fue seguido por la recolección de las células T de el compartimiento inferior de los pocillos de instrumentos, la tinción de células T con anticuerpo α-CD4 y análisis de citometría de flujo, usando perlas de recuento de células para determinar el número absoluto de células T transmigradas; se muestra en la Figura 3E, central y derecho). Tenga en cuenta que estimula las células T utilizadas para la transmigración no causó una disminución sustancial en la TEER, aunque fueron pre-activadas como en la Figura 3A. Esto podría reflejar la ruta transcelular células inmunes pueden utilizar durante la transmigración, como se ha observado previamente 39. En la Figura 3F, la mitad de los pocillos con MBMECs se inflama con IFN-γ y TNF-α (no inflamada vs. Inflamado), y más tarde, se añadieron células T vírgenes para la evaluación de la actividad transmigratoria. En este caso, la medición de la TEER proporcionó una pista en cuanto a qué tan fuerte es la inflamación con citoquinas era y cuando se deben añadir las células T para la transmigrationorte.

La figura 4 muestra algunas de las situaciones más comunes que pueden conducir a una interpretación errónea de los resultados de TEER. En la figura 4A, por ejemplo, no todos los MBMECs desarrollaron una monocapa confluente totalmente al mismo tiempo. Uno de los grupos ( "células T ingenuas - excluidos") contenía MBMECs cuyos complejos TJ fueron madurando a un ritmo diferente en comparación con los otros grupos justo antes de la adición de las células T. Este grupo desarrolló en consecuencia los valores de TEER encima del 100% durante el experimento y se excluyó del análisis adicional. Por lo tanto, la pendiente de la curva de TEER (tasa de maduración TJ) antes del experimento es tan importante como valores absolutos de TEER para la interpretación apropiada de datos. La Figura 4B muestra que a partir del co-cultivo no sólo demasiado pronto, pero también demasiado tarde puede dar lugar a resultados falsos. Aquí, tanto en el grupo con células T estimuladas y el grupo de control negativo (medio change), los valores de TEER ya han pasado su meseta y comenzó a disminuir de forma independiente de la condición experimental, por lo tanto, que indica las condiciones de cultivo subóptimas antes y durante el experimento. Tales grupos no deben ser incluidos en el análisis. Por último, aunque TEER y Ccl suelen cambiar sus valores de tal manera que una mayor disminución de la TEER se acompaña de un mayor aumento de Ccl, esto puede no ser siempre el caso. En la Figura 4C, células T estimuladas B causaron una disminución más grande en TEER, pero un aumento menor en Ccl que las células T estimuladas un DID.

Figura 1
Figura 1: Visión general de la técnica. Después del cultivo inicial, MBMECs se volvieron a sembrar en insertos permeables y se colocan en el monitor automático de células; TEER y CCL se miden cada hora durante 4-5 días. Mientras tanto, las células T se activan in vitro 40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: MBMECs desarrollar una monocapa confluente adecuada para un modelo in vitro de la acreditación. (A) la morfología del huso-forma (izquierda) y la tinción de inmunofluorescencia de PECAM-1 (medio) y Claudín-5 (derecha) cinco días después del aislamiento MBMEC. (B y C) los valores de TEER y CCL antes de (B) y después (C) grupos de pocillos individuales, t anteso adición de células T. La curva azul en (B) no se utiliza para el experimento, ya que en este MBMECs bien no han desarrollado TEER tan alta como en los otros pocillos. Los datos de demostración (C) Media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Los resultados representativos. (AD) Los cambios en la TEER como una medida primaria de la disfunción MBMEC tras la interacción con las células T. Células T-MOG específico (A) se activaron por las células B MOG-específicas en presencia de MOG 35-55 péptido durante cinco días. células T vírgenes y las citoquinas pro-inflamatorias IFN-gamma y TNF-alfa (ambos a 100 U / ml) sirvieron como control negativo y positivo, respectivamente. (B) las células T se estimularon con anticuerpos α-CD28 (1 mg / ml cada uno) durante dos o tres días, como se indica α-CD3 y, antes de agregarlos a MBMECs. Células (C) T (pre-activadas como en (A)) o sus sobrenadantes, en presencia de anticuerpo α-IFN-γ o el control de isotipo correspondiente. Células (D) T (pre-activadas como en (B)) durante dos días, en presencia de inhibidor de la granzima B II o su DMSO diluyente. (E y F) de medición TEER utilizado sólo como un control de calidad para integridad de la barrera antes de la transmigración de células T. MBMECs se cultivaron en insertos con poros de 3 m de diámetro. Células (E) T, estimulados como se describe en (A), se dejó que transmigrar durante 18 horas (a la izquierda). A continuación, se recogieron, se tiñeron para el anticuerpo α-CD4 (clon RM4-4) y se analizaron por citometría de flujo, usando perlas de recuento de células (medio y derecha). (F)El monitoreo de integridad de la monocapa MBMEC a la estimulación con IFN-γ y TNF-α, y eligiendo el punto de tiempo apropiado para la adición posterior de las células T para el ensayo de transmigración. (AF) Los resultados muestran triplicados técnicas y son representativos de tres experimentos independientes cada una. Los datos muestran la media ± SEM. (E, derecha) no pareada, prueba de la t de Student de dos colas. **, P <0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Consideraciones prácticas y la interpretación de datos. (A) MBMECs de un grupo experimental (curva roja) fueron excluidos del análisis, ya que la tasa de maduración de sus complejos de unión era diferente en comparación con otros groups. (B) Un ejemplo de la adición de las células T demasiado tarde, lo que impidió una evaluación adecuada de la disfunción MBMEC. (C) Después de la interrupción por "A" células T estimuladas (curva negro), los valores de Ccl MBMECs mostró un aumento más dramático que sería de esperar de la disminución concomitante en la TEER causada por las mismas células T. Células (AC) T se estimularon con α-CD3 y anticuerpos α-CD28 (1 mg / ml cada uno) durante dos días. Los resultados muestran triplicados técnicas y son representativos de tres experimentos independientes cada una. Los datos muestran la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Varios pasos del protocolo descrito son esenciales para un experimento exitoso. Durante el aislamiento MBMEC inicial y la cultura, es crucial que el trabajo se realiza en condiciones estériles tanto como sea posible, para evitar la contaminación del cultivo celular con esporas de hongos o bacterias. Con el fin de obtener un cultivo puro de ECs, se recomienda el uso de un medio que contiene puromicina durante los tres primeros días, lo que permite la supervivencia de ECs, pero no otros tipos de células (especialmente pericitos) 41,42. Otro paso crítico que merece especial atención es la identificación del punto de tiempo correcto para la adición de las células T activadas previamente. Durante las primeras 48 h de MBMECs de medida de TEER proliferar en insertos permeables y cerrar las brechas entre sí. Por lo tanto, Ccl disminuye hasta que alcanza un nivel estable y baja (alrededor de 0,6 mF / cm 2). Este es el primer signo de una monocapa confluente CE, pero todavía no es un signo de una barrera apretada. Solo despuésLa LCC ha alcanzado un nivel estable hace la TEER comienzan a aumentar. Cuando los complejos TJ están completamente formados y la barrera CE está completamente cerrada, la TEER alcanza su nivel máximo. Esta meseta se alcanza por lo general de tres a cinco días después de la resiembra el ECs y se mantiene durante otra 24-36 hr. El mejor punto de tiempo para la adición de las células T está en el inicio de la meseta, que asegura que la EC siguen siendo viables suficiente para ser co-cultivadas con las células T. Como debe ser iniciado antes del punto de tiempo óptimo para el co-cultivo se puede predecir con seguridad la activación de las células T, puede ser ventajoso para estimular dos lotes de células T en dos días diferentes con el fin de aumentar la flexibilidad de este tiempo. Por último, la agrupación de pocillos replicados individuales antes de añadir las células T a las MBMECs necesita ser hecho de tal manera que la variabilidad dentro y entre los grupos es mínima. Esto garantiza que las condiciones iniciales son iguales en todos los grupos durante el co-cultivo de las células T y MBMECs. Nuestro protocolo describe la medición TEER durante el co-cultivo de cerebro principal del ratón ECs con las células T CD4 + pre-activadas. Su forma simple permite múltiples modificaciones, de acuerdo con las necesidades científicas. Por ejemplo, el tipo, la fuerza y ​​duración del estímulo se pueden variar. Células T CD4 + específicas de antígeno pueden ser activadas por su antígeno cognado, en presencia de células adecuadas presentadoras de antígeno (APCs); Alternativamente, las células T pueden ser activadas por policlonal anticuerpos α-CD28 α-CD3 y. El estado de activación de células T puede ser modulada por varias citoquinas, anticuerpos bloqueantes, inhibidores. No se recomienda la sustitución de los EC cerebrales primarios con líneas de células endoteliales, sin embargo, ya se sabe que en estos se presenta menos restrictiva complejos TJ y mayor permeabilidad en comparación con las células primarias 43. Además de medir la TEER como la lectura primaria, este protocolo proporciona un buen control de calidad de la monolay CEintegridad er antes del ensayo de transmigración de las células T (Figura 3E, F). Es de destacar que los valores de TEER no necesariamente pueden disminuir durante la transmigración de las células T a través de los MBMECs (Figura 3E): esto podría reflejar la ruta transcelular células inmunes pueden utilizar durante la transmigración, como se ha observado previamente 39,44.

A medida que las células T activadas inducen disfunción CE durante el co-cultivo, TEER muestra, disminución constante predecible, comparables a través de experimentos con las mismas condiciones. Una mayor disminución de la TEER suele ir acompañado de un mayor aumento concomitante de la CCL. En raras ocasiones, sin embargo, un aumento en Ccl puede ser más pronunciado de lo esperado a partir de la correspondiente disminución de la TEER (Figura 4C). Esta discrepancia puede reflejar diferentes aspectos de la alteración de las monocapas CE. Como EC intente cerrar los huecos que se forman durante la ruptura de la barrera, pueden sufrir cambios dinámicos enla morfología y la motilidad tales como la formación de protuberancias y el aumento de su superficie total, todo lo cual puede contribuir a un incremento rápido y dramático en Ccl. Esto hace que los cambios en Ccl menos predecible, en comparación con los cambios en la TEER. Por lo tanto, el nivel de disminución de la TEER sigue siendo la medida más fiable y representativa de la integridad de la barrera comprometida.

Este ensayo puede ser complementado con otras técnicas para investigar propiedades de barrera endoteliales. Se puede ir seguido de un ensayo de permeabilidad, que mide la cantidad de moléculas de diferentes tamaños que se difunden a través de la monocapa CE interrumpido 44. Para este propósito, los conjugados de dextrano marcados con fluorescencia, tales como fluoresceína y Texas Red se pueden utilizar; otros trazadores moleculares también están disponibles (por ejemplo, sacarosa, manitol, albúmina, Evans Blue y peroxidasa de rábano picante) 26. Además, la microscopía de inmunofluorescencia se puede utilizar para investigar los cambios en la expresión de proteínasy la localización celular de moléculas de adhesión celular y TJ. Aunque el modelo de BBB presentada es muy simple, los resultados obtenidos con que puede proporcionar orientación valiosa para más ensayos en condiciones más fisiológicas. Dichos ensayos incluyen (pero no se limitan a) ensayo de flujo de cizallamiento en vitro para complementar medición TEER obtenido en condiciones estáticas y ensayo de permeabilidad in vivo con la inyección de azul de Evans en ratones vivos en dar cuenta de la complejidad de la BBB.

Aunque sensible y fiable, el método descrito aquí tiene algunas limitaciones que merecen una atención especial. Los valores máximos de TEER medidos en nuestra configuración experimental alcanza valores de 35-40 Ωcm 2. Estos valores de TEER son mucho más bajos que en vivo, donde los diferentes tipos de células y componentes acelulares contribuyen a la integridad de la BBB, sino que también no son tan altas como TEER valores alcanzados en alguna otra en modelos in vitro de BBB <sup> 26,45,46. Esto podría ser mejorado por la adición de hidrocortisona al medio de CE, que se ha demostrado para mejorar notablemente las propiedades de barrera 27,47 - 49. Sin embargo, el uso de tales sustancias - sabe que tienen efectos anti-inflamatorios e inmunosupresores - no es adecuado para todos los ensayos funcionales. Como el objetivo de este protocolo particular está en las consecuencias de las interacciones células EC-T sobre integridad de la barrera, la interpretación se ve obstaculizada por la adición de hidrocortisona. Utilizando el protocolo presentado aquí por lo tanto permite la evaluación de la verdadera potencial inflamatorio de las células T estimuladas para causar disfunción de la barrera de la CE. También vale la pena señalar que la comparación directa de diferentes valores de TEER reportados en la literatura se debe hacer con cuidado. Tales valores son altamente dependiente de la configuración experimental, que se obtienen con diferentes tipos de células, la siembra de las densidades de células, medios de comunicación, zonas de crecimiento celular, y sistemas de medición de TEER (por ejemplo </ Em>, el diseño y el tamaño de los electrodos).

Con el fin de imitar la situación in vivo más de cerca, complejo en modelos de BBB in vitro se han establecido, donde ECs son co-cultivadas con pericitos en el lado opuesto de la membrana de inserción, o cuando los pericitos y astrocitos se cultivan en el fondo de los pocillos 12,25,50 - 52. En tales sistemas de co-cultivo, la diafonía entre diferentes tipos de células permite apriete más fuerte de la barrera, con triples co-cultivos ser el mejor en asemeja a la situación in vivo y por lo tanto proporcionar los más altos valores de TEER. La complejidad de estos sistemas, por el contrario, plantea una limitación a su uso más amplio como modelos en vitro BBB.

Otra limitación de este modelo es la falta de tensión de corte, que se ha demostrado que mejora la integridad de la barrera 53,54. Para superar este problema, recientemente se han introducido nuevos modelos dinámicos de BBB: ECs se cultivan en fibras huecas y se somete a condiciones de flujo pulsátil, imitando más estrechamente microvasculatura in vivo 55,56.

En resumen, este protocolo describe un modelo in vitro de la BBB basado en espectroscopia de impedancia. Centrándose en la interacción de células endoteliales de cerebro de ratón primario con células T activadas, el método permite el estudio de las propiedades de barrera durante tal contacto directo. Esto es de particular importancia para la comprensión de los pasos cruciales en el desarrollo de enfermedades inflamatorias del SNC, tales como esclerosis múltiple y su modelo animal EAE, en el que la BBB se ve comprometida durante una interacción de ECs con las células T encefalitogénicas. El ensayo descrito permite la investigación de las consecuencias de una modulación dirigida de tal interacción mediante el uso de una amplia gama de sustancias tales como el bloqueo de anticuerpos, citoquinas e inhibidores de la activación de células T. El método es sensible, fiable y no invasivomediciones ND de TEER y Ccl se llevan a cabo de forma automatizada. Todo esto hace que sea una herramienta útil y versátil que añade una nueva capa a la rico cuerpo de modelos BBB. Se puede ampliar específicamente nuestro conocimiento acerca de las propiedades de BBB en condiciones fisiopatológicas observados en las enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple.

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Acknowledgments

Estamos muy agradecidos a Annika Engbers y Frank Kurth por su excelente apoyo técnico y el Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) útil para los debates en relación con las mediciones de TEER. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 proyecto A03 a HW y LK, CRC TR128, proyecta A08; Z1 y B01 en LK y HW, y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (Facultad de Medicina de Münster) el número de concesión KL2 / 2015/14 en LK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cellZscope nanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.com including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 
Ultracentrifuge Thermo Scientific www.thermoscientific.com SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation
flow cytometer Beckman Coulter www.beckmancoulter.com for analysis of T cell transmigration
FlowJo7.6.5 software Tree Star www.flowjo.com for analysis of T cell transmigration
Oak Ridge centrifuge tubes, PC Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 ml; for MBMEC isolation
Transwell membrane inserts - pore size 0.4 µm Corning 3470 for TEER measurement as the main readout
Transwell membrane inserts - pore size 3 µm Corning 3472 for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay
24-well cell culture plate Greiner 650 180 flat-bottom; for MBMEC culture
96-well cell culture plate Costar 3526 round-bottom; for immune cell culture
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns
Neubauer counting chamber Marienfeld MF-0640010 for cell counting
Cell strainer, 70 µm Corning 352350 for immune cell isolation
Cell strainer, 40 µm Corning 352340 for immune cell isolation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 for immune cell isolation
MACS LS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 for T cell and B cell isolation
MACS MS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201 for dendritic cell isolation
Mouse CD4 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-049-201 for CD4+ T cell isolation
Mouse CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-201 for B cell isolation
Mouse CD11c MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-001 for dendritic cell isolation
Collagen type IV from human placenta Sigma C5533 for MBMEC coating solution
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-5MG for MBMEC coating solution
Collagenase 2 (CSL2) Worthington LS004176 for MBMEC isolation
Collagenase/Dispase (C/D) Roche 11097113001 for MBMEC isolation
DNase I Sigma DN25 for MBMEC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 for MBMEC isolation
Bovine Serum Albumin (BSA) Amresco 0332-100G for MBMEC isolation
Percoll Sigma P1644-1L for MBMEC isolation
DMEM (+ GlutaMAX) Gibco 31966-021 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333 for MBMEC isolation and MBMEC culture medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 for MBMEC and immune cell isolation
Heparin Sigma H3393 for MBMEC culture medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 100-18B for MBMEC culture medium
Puromycin Sigma P8833 for MBMEC culture medium; only for the first three days
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 for harvesting MBMECs
Collagenase Type IA Sigma C9891 for dendritic cell isolation
Trypan Blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061 for cell counting
EDTA Sigma E5134 for immune cell isolation
IMDM + 1% L-Glutamin Gibco 21980-032 for T cell culture medium
X-VIVO 15 Lonza BE04-418Q protect from light; for B cell culture medium
β-mercaptoethanol Gibco 31350-010 for B cell culture medium
L-Glutamine (100x Glutamax) Gibco 35050-061 for B cell culture medium
mouse MOG35—55 peptide Biotrend BP0328 for antigen-specific T cell activation
purified anti-mouse CD3 Ab BioLegend 100302 clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab BD Pharmingen 553294 clone 37.51; for polyclonal T cell activation
Recombinant Murine IFN-γ PeproTech 315-05 for T-cell transmigration assays
Recombinant Murine TNF-α PeproTech 315-01A for T-cell transmigration assays
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody BD Biosciences 554408 clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor II Calbiochem 368055 recommended final concentration: 10 µM
PE anti-mouse CD4 antibody Biolegend 116005 clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration

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