बाह्य मैट्रिक्स की Glycoproteomics: मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग अक्षुण्ण Glycopeptide विश्लेषण के लिए एक विधि

Biochemistry
 

Summary

इस पत्र एमएस विश्लेषण है कि (1) ईसीएम प्रोटीन संरचना के विश्लेषण, (2) ग्लाइकोसिलेशन साइटों की पहचान, और (3) glycan रूपों के compositional लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है के लिए हृदय ऊतक के नमूने तैयार करने के लिए एक पद्धति का वर्णन है। यह पद्धति मामूली संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता, अन्य ऊतकों में ईसीएम के अध्ययन के लिए।

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Barallobre-Barreiro, J., Baig, F., Fava, M., Yin, X., Mayr, M. Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (122), e55674, doi:10.3791/55674 (2017).

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Abstract

फाइब्रोसिस कई हृदय रोगों की एक बानगी है और exacerbated स्राव और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बयान के साथ जुड़ा हुआ है। का उपयोग करते हुए प्रोटिओमिक्स, हम पहले 150 से अधिक ईसीएम की पहचान की है और हृदय के ऊतकों में ईसीएम जुड़े प्रोटीन। विशेष रूप से, कई ईसीएम प्रोटीन ग्लाइकोसिलेटेड कर रहे हैं। इस पोस्ट-अनुवादकीय संशोधन को प्रभावित करता है प्रोटीन तह, घुलनशीलता, बंधन, और गिरावट। हम ईसीएम प्रोटीन के लिए एक अनुक्रमिक निष्कर्षण और संवर्धन विधि है कि बाद में तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री बरकरार ग्ल्य्कोपेप्तिदेस की (LC-एमएस / एमएस) विश्लेषण के साथ संगत है विकसित किया है। रणनीति ऊतक decellularization, और ईसीएम प्रोटीन के solubilization के लिए guanidine हाइड्रोक्लोराइड के लिए सोडियम क्लोराइड, एसडीएस के साथ अनुक्रमिक incubations पर आधारित है। LC-एमएस / एमएस में हाल के अग्रिमों ऐसे उच्च ऊर्जा टक्कर पृथक्करण के संयोजन (HCD) और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण (ETD) है, जो के लिए अनुमति देने के रूप में विखंडन पद्धतियों मेंईसीएम प्रोटीन की ग्ल्य्कोपेप्तिदेस के प्रत्यक्ष compositional विश्लेषण। वर्तमान पत्र में, हम ऊतक के नमूने से ईसीएम तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन। विधि न केवल प्रोटीन रूपरेखा लेकिन यह भी आकलन और ग्लाइकोसिलेशन के लक्षण वर्णन एमएस विश्लेषण के द्वारा के लिए अनुमति देता है।

Introduction

फाइब्रोसिस कई बीमारियों की एक बानगी है। Fibroblasts पैदा करना और अत्यधिक सिंथेटिक समलक्षणियों, जो exacerbated स्राव और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 1 के बयान के साथ जुड़े रहे की ओर से अंतर। अत्यधिक ईसीएम बयान जारी रख सकते हैं, के बाद भी प्रारंभिक चोट abated है, कार्यात्मक विकृति के लिए अग्रणी। का उपयोग करते हुए प्रोटिओमिक्स, हम पहले 150 से अधिक ईसीएम की पहचान की है और हृदय ऊतक 2, 3 में ईसीएम जुड़े प्रोटीन। वे केवल संरचनात्मक प्रोटीन, लेकिन यह भी matricellular प्रोटीन और प्रोटीस निरंतर remodeling और दिल की गतिशील अनुकूलन के लिए योगदान नहीं कर रहे हैं। विशेष रूप से, कई ईसीएम प्रोटीन 4 ग्लाइकोसिलेटेड कर रहे हैं। इस पोस्ट-अनुवादकीय संशोधन (PTM) कुछ अमीनो एसिड पदों के लिए चीनी अवशेषों के अलावा शामिल है, और यह प्रोटीन तह, घुलनशीलता को प्रभावित करता है, बंधन, और गिरावट 5

दो मुख्य ग्लाइकोसिलेशन प्रकार है कि स्तनधारियों में पाए जाते हैं। (1) एन ग्लाइकोसिलेशन asparagine अवशेषों (Asn) आम सहमति अनुक्रम Asn-XAA-Thr / सेर, जहां XAA प्रोलाइन के अलावा कोई भी एमिनो एसिड है भीतर का carboxamido नाइट्रोजन पर होता है। (2) O-ग्लाइकोसिलेशन में चीनी अवशेषों एक बहुत हद तक कम करने के लिए सेरीन और threonine अवशेषों (सेर, thr) या, संलग्न, हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन और hydroxylysine करने के लिए। O-ग्लाइकोसिलेशन प्रोटीन समूहों की एक किस्म में हो सकता है, वहीं एन ग्लाइकोसिलेशन स्रावित प्रोटीन या झिल्ली प्रोटीन 5 बाह्य डोमेन तक सीमित है। यह जब ईसीएम का अध्ययन एन ग्लाइकोसिलेशन एक आकर्षक लक्ष्य बनाता है।

प्रोटिओमिक्स रोग में प्रोटीन परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक नया मानक तय करता है। इस प्रकार अब तक, सबसे प्रोटिओमिक्स पढ़ाई intracellular प्रोटीन 6 पर ध्यान केंद्रित किया गया है। यह मुख्य रूप से निम्नलिखित कारणों से है। सबसे पहले, प्रचुर मात्रा में intracellular प्रोटीन पहचान में बाधादुर्लभ ईसीएम घटकों के दिखाएं। यह हृदय ऊतक, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल और myofilament प्रोटीन प्रोटीन सामग्री 7 का एक बड़ा हिस्सा के लिए खाते में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। दूसरा, अभिन्न ईसीएम प्रोटीन भारी पार जुड़ा हुआ है और solubilize के लिए मुश्किल हो जाता है। अन्त में, प्रचुर मात्रा में PTMs (यानी, ग्लाइकोसिलेशन) की उपस्थिति आणविक द्रव्यमान, प्रभारी, और पेप्टाइड्स के electrophoretic गुण बदल देता है, दोनों जुदाई और तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-एमएस / एमएस) द्वारा पहचान को प्रभावित करने वाले। हाल के वर्षों में, हम विकसित किया है और ईसीएम प्रोटीन के लिए एक अनुक्रमिक निष्कर्षण और संवर्धन विधि है कि बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के साथ संगत है सुधार हुआ है। रणनीति अनुक्रमिक incubations पर आधारित है।

पहला कदम NaCl, एक आयनिक बफर कि ईसीएम जुड़े और शिथिल बाध्य ईसीएम प्रोटीन की निकासी, साथ ही नव संश्लेषित ईसीएम प्रोटीन की सुविधा के साथ किया जाता है। यह मैंरों डिटर्जेंट मुक्त, गैर अप्राकृतिकरण, कोशिका झिल्ली के गैर विघटनकारी, और आगे जैव रासायनिक assays 8 के लिए उत्तरदायी। फिर, decellularization सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के साथ हासिल की है। इस चरण में, एक कम एसडीएस एकाग्रता झिल्ली अस्थिरता और अधिक घुलनशील गैर अभिन्न ईसीएम घटकों के विघटन को रोकने, जबकि intracellular प्रोटीन की रिहाई सुनिश्चित करता है। अंत में, ईसीएम प्रोटीन एक guanidine हाइड्रोक्लोराइड बफर (GuHCl) के साथ निकाले जाते हैं। GuHCl ऐसे tendons 9, उपास्थि 10, जहाजों 11, 12, 13 और दिल 2, 3 के रूप में ऊतकों से भारी पार से जुड़े प्रोटीन और प्रोटियोग्लाइकन निकालने में प्रभावी है। हम LC-एमएस / एमएस, के साथ संयोजन में इस जैव रासायनिक विभाजन लागू किया, हृदय रोग 2 में ईसीएम remodeling पता लगाने के लिए 3, 11, 12, 13, 14। एमएस में हाल के अग्रिमों ऐसे उच्च ऊर्जा टक्कर पृथक्करण (HCD) और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण (ETD) के संयोजन है, जो बरकरार ग्ल्य्कोपेप्तिदेस 3, 15 के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देने के रूप में उपन्यास विखंडन के तरीकों, शामिल हैं।

यहाँ हम एमएस विश्लेषण है कि प्रोटीन संरचना, ग्लाइकोसिलेशन साइटों की पहचान, और glycan रूपों के लक्षण वर्णन के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के लिए ईसीएम तैयार करने के लिए एक पद्धति का वर्णन। ईसीएम ग्लाइकोसिलेशन 16 के पिछले विश्लेषण की तुलना में, इस पद्धति एमएस का उपयोग कर एक साइट विशिष्ट ढंग से ग्लाइकोसिलेशन प्रोफाइल में compositional परिवर्तन का सीधा मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। हम हृदय के ऊतकों को इस पद्धति लागू किया है। हालांकि, यह कर सकते हैं अलइतना मामूली संशोधनों के साथ लागू किया जा, अन्य ऊतकों के नमूनों में ईसीएम के अध्ययन के लिए और ईसीएम जीव विज्ञान में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

Protocol

अध्ययन वैंड्सवर्थ स्थानीय रिसर्च आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (संदर्भ संख्या: 06 / Q0803 / 37) और अनुसंधान और विकास कार्यालय से प्राप्त संस्थागत अनुमोदन। सभी मरीज़ों ने लिखित ज्ञात सहमति दी है।

1. बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का निष्कर्षण

नोट: मानव आलिंद इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया ऊतकों, कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के दौरान आलिंद उपांग से प्राप्त किए गए सिर्फ दिल की cardioplegic गिरफ्तारी के बाद। सभी नमूनों सेंट जॉर्ज हॉस्पिटल, लंदन, ब्रिटेन में एकत्र किए गए थे। सभी ऊतक के नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जाना चाहिए। इस तरह के paraformaldehyde के रूप में fixatives, साथ संरक्षित नमूनों का प्रयोग न करें, कि पार से लिंक प्रोटीन।

  1. सभी निष्कर्षण बफ़र्स, प्रति तालिका 1 के रूप में, ताकि निष्कर्षण चरणों के बीच के समय को कम करने के प्रयोगों के लिये पहले ही तैयार करें। एक तापमान नियंत्रित वातावरण में कमरे के तापमान (आर टी) पर सभी incubations प्रदर्शन(यानी, ~ 20 डिग्री सेल्सियस) निष्कर्षण के बीच निरंतरता सुनिश्चित करने के।
  2. ऊतक के 20-50 मिलीग्राम वजन। ऊतकों की पूरी विगलन से बचने के लिए कई नमूने, निकाले जाने की कटौती करने और एक-एक करके उन्हें एक वजन रहे हैं। एक छुरी का प्रयोग, 3-4 छोटे टुकड़ों (यानी, 2-3 मिमी) में ऊतक हिस्सों में विभाजित कर और 1.5 एमएल ट्यूबों में उन्हें एक साथ जगह।
  3. बहुत ठंडा फॉस्फेट बफर खारा के 500 μL जोड़ें (पीबीएस; तालिका 1 और सामग्री की तालिका देखें) और रक्त संदूषण को कम से कम करने के लिए पाँच धोने प्रदर्शन करते हैं।
  4. निष्कर्षण चरण 1: सोडियम क्लोराइड बफर के साथ ऊष्मायन
    1. पीबीएस के साथ धोने के बाद, पेंच टोपी के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों में नमूने रखें। सोडियम क्लोराइड बफर जोड़ें ऊतक वजन: 10 बार (डब्ल्यू वी) पर (तालिका 1 देखें)। भंवर न्यूनतम गति (यानी, 600 आरपीएम) पर 1 घंटे के लिए आरटी पर ट्यूबों।
      ध्यान दें: एक कम भंवर गति इस चरण के दौरान ऊतक के यांत्रिक व्यवधान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।निष्कर्षण के दौरान सभी ट्यूबों जगह एक फोम एडाप्टर का उपयोग करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर नया ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए अर्क स्थानांतरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस प्रयोग से पहले तक पर अर्क स्टोर। संक्षेप में ताजा सोडियम क्लोराइड बफर के साथ शेष ऊतक छर्रों धोएं। (यानी, सोडियम क्लोराइड बफर के 100 μL) धोने के लिए अलग solubilities (यानी, प्रोटीन सोडियम क्लोराइड के साथ निकाला जा नहीं) के साथ अन्य प्रोटीन की निकासी को रोकने के लिए बफर के एक ही प्रकार का उपयोग करें।
    3. धोने के बाद, बफर बाद निष्कर्षण चरणों के साथ प्रोटीन की मात्रा में ओवरलैप को कम करने को पूरी तरह निकाला करता है। कपड़े धोने के लिए इस्तेमाल किया सोडियम क्लोराइड बफर त्यागें।
      नोट: बफर मात्रा और ऊतक वजन के बीच का अनुपात एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निकासी के लिए महत्वपूर्ण है। एक 10: 1 अनुपात (v: डब्ल्यू) NaCl और एसडीएस निष्कर्षण के लिए और 5: 1 GuHCl कदम के लिए बफर संतृप्त बिना प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में प्रदान करते हैं। प्रोटीन सांद्रता लगभग 1-2 माइक्रोग्राम / μL ext के बाद कर रहे हैंraction।
  5. निष्कर्षण चरण 2: एसडीएस बफर के साथ Decellularization
    1. दस बार (v: डब्ल्यू) में एसडीएस बफर (तालिका 1) जोड़े ऊतक वजन; कम एसडीएस सांद्रता (यानी, 0.1%) के उपयोग decellularization दौरान ईसीएम प्रोटीन के नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। भंवर न्यूनतम गति (यानी, 600 आरपीएम) पर 16 घंटे के लिए आरटी पर ट्यूबों।
      ध्यान दें: एक कम भंवर गति ईसीएम के यांत्रिक विघटन कम करता है।
    2. नई ट्यूबों को अर्क स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र; -20 डिग्री सेल्सियस प्रयोग से पहले तक पर दुकान। संक्षेप में dd एच 2 ओ के साथ शेष ऊतक छर्रों धो एसडीएस दूर करने के लिए। धोने के बाद तरल को पूरी तरह निकाला सुनिश्चित करें।
  6. निष्कर्षण चरण 3: GuHCl बफर के साथ ऊष्मायन
    1. (: डब्ल्यू वी) ऊतक वजन पांच बार में GuHCl बफर (तालिका 1) जोड़ें। भंवर अधिकतम गति पर 72 ज (यानी के लिए RT पर ट्यूबों,
    2. नई ट्यूबों को अर्क स्थानांतरित करें। पर -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट और दुकान के लिए 16,000 × छ अपकेंद्रित्र।

2. प्रोटीन मात्रा और वर्षा

नोट: डिटर्जेंट की उपस्थिति के कारण, एसडीएस बफर 280 एनएम पर अवशोषण की माप पर आधारित प्रत्यक्ष प्रोटीन मात्रा के साथ असंगत है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रोटीन के अर्क 17 के लिए वर्णमिति assays का उपयोग करें।

  1. मात्रा।
    1. गोजातीय सीरम albumin (BSA) का उपयोग कर एक अंशांकन वक्र क्रमानुसार उचित निकासी बफर (यानी, सोडियम क्लोराइड, एसडीएस, या GuHCl) 17 में पतला के लिए मानकों को तैयार करें। इस समय के दौरान, नमूना अर्क पिघलना।
    2. निष्कर्षण बफर के भीतर सांद्रता प्राप्त करने के लिए नमूने पतलाअवशोषण के रैखिक रेंज; 1:10 कमजोर पड़ने (v: v) संतोषजनक परिणाम प्राप्त होते हैं। DDH 2 हे मात्रा के लिए की एक समान राशि के साथ GuHCl नमूने पतला, के रूप में वर्णमिति परख> 4 एम GuHCl की सांद्रता के साथ संगत नहीं है।
    3. एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) का प्रयोग करें वर्णमिति परख 17 (सामग्री की तालिका देखें) आधारित, 96-अच्छी तरह प्लेटों में assays के लिए निर्माता के निर्देशों के; यह कम से कम दो प्रतियों मापन का प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है।
    4. 30 मिनट के लिए विकासशील बाद, आदेश बीएसए मानक अंशांकन वक्र 17 का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के 570 एनएम के तरंग दैर्ध्य में अवशोषण रीडिंग ले।
  2. प्रोटीन से वर्षा
    1. पिघलना GuHCl आरटी पर निकालता है। विभाज्य नई नालियों में प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन के 10 माइक्रोग्राम। एक सीधा glycopeptide विश्लेषण के लिए, विभाज्य 50 माइक्रोग्राम। 10 बार इथेनॉल और incu की मात्रा जोड़ेबाते रातोंरात -20 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: GuHCl आगे एंजाइमों की अभिक्रियाएं और सबसे electrophoretic अनुप्रयोगों के साथ संगत नहीं है। GuHCl को हटाने से पहले deglycosylation और ट्रिप्सिन पाचन की आवश्यकता है। इथेनॉल में GuHCl और, की विलेयता इसके विपरीत, प्रोटीन की कम घुलनशीलता जबकि लगभग प्रोटीन 18 की 98% वसूली उपज GuHCl के प्रभावी हटाने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पर 16,000 × छ नमूने अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate। देखभाल उपजी गोली को परेशान नहीं करता है। एक वैक्यूम सांद्रक (सामग्री की तालिका देखें) आर टी का उपयोग कर 15 मिनट के लिए छर्रों सुखाएं।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और सूखे छर्रों -20 डिग्री सेल्सियस प्रयोग से पहले तक पर संग्रहीत।
    3. वैकल्पिक रूप से, के रूप में गुणवत्ता नियंत्रण एक जेल वैद्युतकणसंचलन चलाने (QC, पूरक के तरीके देखें)।

3. के लिए अनुक्रमिक Deglycosylationएन ग्लाइकोसिलेशन साइट अधिभोग का आकलन

  1. नमूना सुखाने (कदम 2.2.2 देखें) के दौरान, deglycosylation एंजाइमों debranching, प्रति तालिका 1 के रूप में युक्त deglycosylation बफर तैयार करते हैं। उत्पाद जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. deglycosylation प्रत्येक नमूने के लिए एंजाइमों युक्त बफर के 10 μL जोड़ें। एक त्वरित भंवर और नमूने के स्पिन डाउन प्रदर्शन करके उचित गोली मेजबान सुनिश्चित करें।
    नोट: debranching एंजाइमों का उपयोग कर चीनी मोनोमर को हटाने हे से जुड़े जटिल saccharides के बाद और पूर्ण हटाने के लिए आवश्यक है और PNGase-एफ द्वारा एन से जुड़े शर्करा के बाद दरार की सुविधा।
  3. 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं 37 डिग्री सेल्सियस के लिए हेपरिनेज़ द्वारा Heparan सल्फेट को हटाने तापमान II.Increase लिए अनुमति देते हैं और सौम्य आंदोलन के साथ 36 घंटे के लिए सेते हैं करने के लिए।
    नोट: कम प्रतिक्रिया की मात्रा और लंबे समय तक ऊष्मायन बार, उपयोग इनक्यूबेटर शेकर्स को देखते हुए और कसकर कई 1.5 एमएल टब पैकएक 50 एमएल शंक्वाकार लगभग 45 डिग्री पर इनक्यूबेटर अंदर झुकाव ट्यूब के अंदर तों।
  4. 36 घंटे के बाद, 16,000 XG पर 1 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र और लुप्त लगभग 45 मिनट के लिए आरटी पर एक निर्वात सांद्रक का उपयोग करके नमूनों से एच 2 हे।
  5. एच 2 18 हे 50 यू / एमएल PNGase-एफ, युक्त के 10 μL के साथ सूखे नमूने Resuspend जो cleaves एक deamidation प्रतिक्रिया में सभी asparagine से जुड़े ग्लाइकान।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप एसपारटिक एसिड 2.98 दा की एक अतिरिक्त बड़े पैमाने पर, एमएस विश्लेषण के दौरान एन ग्लाइकोसिलेशन की उपस्थिति का संकेत किया जाता है।
  6. इनक्यूबेटर शेकर में लगातार आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 36 घंटे के लिए सेते हैं।

4. इन-समाधान ट्रिप्सिन पाचन

नोट: यह कदम दोनों गैर deglycosylated (यानी, प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता) और deglycosylated नमूनों के लिए बाहर किया जाना चाहिए (यानी, glycan OC के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल कियाcupancy)।

  1. एन ग्लाइकोसिलेशन साइट अधिभोग के आकलन (पिछले चरण में संकेत के रूप में) के लिए कुल प्रोटीन के 10 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें। प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण प्रदान करना नमूने लिए, शुरू करने राशि के रूप में प्रोटीन का 50 माइक्रोग्राम प्रति का उपयोग करें।
    नोट: निम्न चरणों के प्रोटीन के 10 माइक्रोग्राम के लिए वर्णित हैं। वें evolumes (50 माइक्रोग्राम के लिए यानी, 5 बार) पैमाने के रूप में की आवश्यकता है।
  2. , 9 एम यूरिया और 3 एम thiourea का उपयोग कर प्रत्येक नमूने विभाज्य पर प्रोटीन denature 6 एम यूरिया और 2 एम thiourea क्रमश: के अंतिम सांद्रता के साथ (जैसे एक 10 μL नमूने के लिए, यूरिया / thiourea के 20 μL)।
  3. 100 मिमी dithiotreitol (: 10 मिमी डीटीटी, 3.33 μL, अंतिम एकाग्रता) जोड़कर प्रोटीन को कम करें। 240 rpm पर आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 0.5 एम iodoacetamide (: 50 मिमी 3.7 μL, अंतिम एकाग्रता) जोड़कर alkylation प्रदर्शन से पहले आर टी के नमूने को ठंडा। 1 घंटे के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  5. -20 पूर्व ठंडा का उपयोग करें (डिग्री सेल्सियस) एसीटोन (6 बार नमूने की मात्रा) -20 डिग्री सेल्सियस पर रात में नमूने सेते हैं करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 14,000 XG पर centrifugation द्वारा तलछट।
  6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate। देखभाल उपजी गोली को परेशान नहीं करता है। आरटी पर 30 मिनट के लिए एक निर्वात सांद्रक का उपयोग कर प्रोटीन छर्रों सुखाएं।
  7. 0.1 एम triethylammonium बाइकार्बोनेट (TEAB) बफर, पीएच 8.2 के 20 μL में Resuspend, युक्त ट्रिप्सिन (0.01 माइक्रोग्राम / μL) और 37 डिग्री सेल्सियस और 240 rpm पर रात भर पचा।
  8. (1% TFA के एक अंतिम एकाग्रता के लिए TFA, 2 μL) 10% trifluoroacetic एसिड के साथ नमूनों को अम्लीय द्वारा पाचन बंद करो।

5. पेप्टाइड सफाई C18 कॉलम का उपयोग करना

नोट: पाचन के बाद पेप्टाइड मिश्रण से दूषित पदार्थों को हस्तक्षेप को हटाने आयन दमन कम कर देता है और संकेत से शोर अनुपात और अनुक्रम कवरेज में सुधार। यह कदम दोनों गैर deglycosylated और deglycosylated सा के लिए बाहर किया जाना चाहिएmples।

  1. 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर (सामग्री की तालिका देखें) C18 स्पिन थाली पर राल अच्छी तरह से और अपकेंद्रित्र प्रति मेथनॉल के 200 μL का उपयोग कर सक्रिय करें।
  2. 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर एच 2 ओ अपकेंद्रित्र में 80% acetonitrile (ACN) और 0.1% TFA के अच्छी तरह से प्रति 200 μL जोड़कर धो लें।
  3. 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर एच 2 ओ अपकेंद्रित्र में 1% ACN और 0.1% TFA के अच्छी तरह से प्रति 200 μL जोड़कर संतुलित करना। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  4. 1 मिनट के लिए 1500 XG पर राल और अपकेंद्रित्र युक्त कुओं में चरण 4 से नमूने (संपूर्ण मात्रा) लोड करें। प्रवाह के माध्यम से दूसरी बार लोड करें और centrifugation दोहराएँ।
  5. 1 मिनट के लिए 1500 XG पर एच 2 ओ अपकेंद्रित्र में 1% ACN और 0.1% TFA के अच्छी तरह से प्रति 200 μL जोड़कर धो लें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  6. 1 मिनट के लिए 1500 XG पर एच 2 ओ अपकेंद्रित्र में 50% ACN, 0.1% TFA के अच्छी तरह से प्रति 170 μL के साथ नमूने Elute। पिछला चरण दोहराएंऔर एकत्र eluate गठबंधन।
  7. आरटी पर 2 घंटे के लिए एक वैक्यूम सांद्रक का उपयोग कर eluate सुखाएं। यह तुरंत नहीं किया जा रहा है, तो -80 डिग्री सेल्सियस प्रयोग से पहले तक पर सूखे नमूने रखने के लिए।
    नोट: Deglycosylated नमूने प्रोटीन की पहचान के लिए करना ही इस चरण के बाद नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं। 6 कदम और 7 इन नमूनों के लिए आवश्यक नहीं हैं।
  8. पिघलना और 0.5 माइक्रोग्राम / μL के अंतिम प्रोटीन एकाग्रता के लिए एच 2 ओ में 2% ACN और 0.05% TFA में deglycosylated नमूने फिर से निलंबित। गैर deglycosylated नमूनों की प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण के लिए चरण 6 के साथ आगे बढ़ें।
  9. वैकल्पिक रूप से, मिलकर बड़े पैमाने पर टैग (टीएमटी) के साथ लेबलिंग से पहले पेप्टाइड्स को फ़िल्टर; पेप्टाइड fitration के लिए पूरक के तरीके को देखते हैं।

6. टीएमटी साथ लेबलिंग (डायरेक्ट Glycopeptide विश्लेषण के लिए केवल)

  1. पिघलना और 1 माइक्रोग्राम / μL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 50 मिमी TEAB के 50 μL में सूखे छर्रों resuspend।
  2. Resusped टीएमटी शून्य का 0.8-मिलीग्राम शीशी ACN के 41 μL में अभिकर्मक (टीएमटी 0, सामग्री की तालिका देखें)। मेजबान के लिए निर्माता के recommendantions का पालन करें।
  3. (टीएमटी 0 में से 20.5 μL करने के लिए यानी, पेप्टाइड्स के 50 μL) 0.4 मिलीग्राम टीएमटी 0 करने के लिए 50 माइक्रोग्राम पेप्टाइड्स के अनुपात में पेप्टाइड नमूने लेबल करें। 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. एक अनुपात 6 में 5% hydroxylamine जोड़कर लेबलिंग प्रतिक्रिया बुझाने: 100 (यानी, 4.23 5% hydroxylamine की μL)। 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. आरटी पर 1 घंटे एक वैक्यूम सांद्रक प्रयोग करने के लिए टीएमटी 0 -labelled पेप्टाइड नमूने सुखाएं। DDH 2 ओ के 10 μL में Resuspend
    नोट: glycan अवशेषों के कारण, ग्ल्य्कोपेप्तिदेस गैर ग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड्स तुलना में एक उच्च आणविक द्रव्यमान प्रदर्शित करते हैं। टीएमटी 0 ग्ल्य्कोपेप्तिदेस के प्रभारी राज्य बढ़ जाती है। यह चार्ज करने के लिए (मी / z) अनुपात उनके रिश्तेदार बड़े पैमाने पर कम कर देता है और ETD विखंडन की सुविधा।

7। Glycopeptide संवर्धन

  1. किट (सामग्री की तालिका देखें) में प्रदान की प्रतिक्रिया बफर का प्रयोग करें।
  2. कदम 6.5 से प्रत्येक 10 μL नमूना करने के लिए बफर बंधन के 50 μL जोड़ें। glycocapture राल समाधान भंवर जब तक यह सजातीय हो जाता है। एक zwitterionic हाइड्रोफिलिक बातचीत तरल क्रोमैटोग्राफी (ZIC-HILIC) का उपयोग आधारित 15 पर कब्जा।
  3. विभाज्य 50 नए 1.5 एमएल ट्यूबों को राल निलंबन की μL। 2500 XG पर 1 मिनट के लिए स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटाने। नमूना के 60 μL जोड़ें (यानी, बाध्यकारी बफर के साथ नमूना) राल छर्रों युक्त ट्यूबों को। एक विंदुक का उपयोग मिलाएं और 1200 rpm पर आंदोलन में 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. 2,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। ट्यूबों रखें। धोने बफर के 150 μL राल ट्यूबों में जोड़े। एक विंदुक का उपयोग मिलाएं और 1200 rpm पर आंदोलन में 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. पर 2500 x जी 2 मिनट के लिए स्पिन। स्थानांतरणएक ही ट्यूब (कदम 7.4 से) सतह पर तैरनेवाला। दोहराएँ धोने दो बार दोहराएँ।
  6. क्षालन बफर के 75 μL जोड़ें और एक विंदुक का उपयोग मिश्रण। आरटी पर 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर आंदोलन और उसके बाद में 2500 x जी 2 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र। नई 1.5 एमएल ट्यूबों को supernatants स्थानांतरण। कपड़े धोने चरणों को दोहराएं और फिर उसी ट्यूब eluate सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
  7. 2500 में 2 मिनट के लिए eluate (यानी, ग्ल्य्कोपेप्तिदेस) युक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र एक्स जी। नई ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला पिछले चरणों से किसी भी शेष राल को हटाने सुनिश्चित करने के लिए।
  8. आरटी पर लगभग 2 घंटे के लिए एक वैक्यूम सांद्रक का उपयोग कर eluate के कुल 150 μL सुखाएं। DDH 2 ओ में 2% ACN के 15 μL और 0.05% TFA में सूखे से नीचे ग्ल्य्कोपेप्तिदेस Resuspend
  9. HCD विखंडन का उपयोग कर ईसीएम प्रोटीन संरचना का विश्लेषण करने के LC-एमएस / एमएस प्रदर्शन करने के लिए LC-एमएस / एमएस के लिए आगे बढ़ें, और glycopeptide लक्षण वर्णन के लिए HCD और ETD विखंडन का उपयोग कर। धारा 8 देखें।
  10. 8. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

    1. HCD विखंडन का उपयोग कर ईसीएम प्रोटीन संरचना का विश्लेषण करने के LC-एमएस / एमएस प्रदर्शन करना; जानकारी के लिए पूरक के तरीके को देखते हैं।
    2. Glycopeptide लक्षण वर्णन के लिए HCD और ETD विखंडन का उपयोग कर (विवरण के लिए पूरक के तरीके देखें) LC-एमएस / एमएस प्रदर्शन करना; समृद्ध नमूना गैर समृद्ध इनपुट सामग्री 15 की तुलना में किया जाना चाहिए।
      नोट: अप्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण, प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण, और डेटाबेस खोज के लिए LC-एमएस / एमएस के तरीकों की विस्तृत विवरण पूरक के तरीके में प्रदान की जाती हैं। ईसीएम प्रोटीन और glycan संरचना की विशेषताओं मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपयोग करने में रुचि शोधकर्ताओं ने पिछले प्रकाशनों 3, 11, 15 का उल्लेख करने के लिए प्रोत्साहित कर रहे हैं।

Representative Results

प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह चित्र 1 में प्रदान की जाती है।

ईसीएम निष्कर्षण प्रोटोकॉल

निकासी की दक्षता aliquots बीआईएस Tris एक्रिलामाइड जैल पर प्रत्येक निकालने के लिए फार्म चल रहा है और दृश्य के लिए चांदी धुंधला का उपयोग करके नजर रखी जा सकती। चित्रा 2A NaCl, एसडीएस की संपूरकता पता चलता है और GuHCl अनुक्रमिक निकासी के बाद निकालता है। यह क्यूसी ऐसे अत्यधिक प्रोटीन गिरावट के रूप में नमूना गुणवत्ता के साथ संभावित समस्याओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। निष्कर्षण के बाद, ईसीएम ग्लाइकोप्रोटीन GuHCl अर्क (चित्रा 2 बी) में प्रचुर मात्रा में हैं।

Deglycosylation

deglycosylation की दक्षता का आकलन करने के लिए, एक गैर deglycosylated नियंत्रण पा में चला जाना चाहिएrallel। Deglycosylation बार चित्रा 3 ए में एक उदाहरण प्रस्तुत किया के रूप में, चीनी अवशेषों की एक पूर्ण और सजातीय हटाने को प्राप्त करने के उपयुक्त होना चाहिए। चित्रा 3 बी नमूने कुशलतापूर्वक जीएजी हटाने और deglycosylation एंजाइमों कि छोटे N- और ओ से जुड़े oligosaccharides को लक्ष्य के लिए एंजाइमों के अलावा द्वारा deglycosylated के एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है।

Glycoproteomics

NXT / एस sequons तक के रहने के आकलन के लिए प्रोटोकॉल एमएस (चित्रा -3 सी) के बाद ईसीएम ग्लाइकोप्रोटीन के लिए प्रोटीन अनुक्रम कवरेज में सुधार और ग्लाइकोप्रोटीन की मौजूदगी की एक प्रारंभिक जांच के लिए अनुमति देता है। यह, ग्ल्य्कोपेप्तिदेस के लिए खोज समय को कम करने में मदद करता है के रूप में डेटाबेस पहले से पहचान ग्लाइकोप्रोटीन शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता। HCD-ETD विखंडन ईसीएम जी से जुड़ी पहचान और oligosaccharides के compositional लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है lycoproteins। चित्रा 4 ए एक प्रतिनिधि एक पेप्टाइड deglycosylation (अप्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण) के बाद 18 हे के साथ लेबल के लिए प्राप्त स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करता है। चित्रा 4 बी एक स्पेक्ट्रम ईसीएम के अर्क से बरकरार ग्ल्य्कोपेप्तिदेस (प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण) के विश्लेषण के बाद प्राप्त के एक प्रतिनिधि उदाहरण है।

आकृति 1
चित्र 1: विधि अवलोकन। (ए) ईसीएम प्रोटीन के लिए अनुक्रमिक संवर्धन के बाद, LC-एमएस / एमएस विश्लेषण deglycosylated अर्क पर प्रदर्शन कर रहे हैं। (बी) वैकल्पिक रूप से, गैर deglycosylated ईसीएम अर्क आगे ग्ल्य्कोपेप्तिदेस के लिए समृद्ध कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्र 2: ईसीएम प्रोटीन का निष्कर्षण। (ए) अनुक्रमिक निष्कर्षण प्रक्रिया ( "अंग्रेजी Quickstep") से 3 अलग अर्क उनके प्रोटीन सामग्री में पूरक हैं। एसडीएस अर्क intracellular प्रोटीन में समृद्ध कर रहे हैं, GuHCl अर्क ईसीएम प्रोटीन के बहुमत में होते हैं। सफल विभाजन विभिन्न चांदी धुंधला पैटर्न द्वारा कल्पना है। (बी) ईसीएम प्रोटीन जैसे छोटे leucine युक्त प्रोटियोग्लाइकन decorin, biglycan और mimecan के रूप में मुख्य रूप से, GuHCl अर्क में पाया जाता है एसडीएस और सोडियम क्लोराइड अर्क में थोड़ा उपस्थिति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Glyc का विश्लेषणosylation। (ए) उचित ऊष्मायन बार पूरा deglycosylation लिए आवश्यक हैं। उदाहरण ग्लाइकोप्रोटीन decorin से ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन जंजीरों को हटाने के दौरान ऊष्मायन समय के प्रभाव को दर्शाता है। (बी) ईसीएम ग्लाइकोप्रोटीन बड़े और दोहराव ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन चेन और लघु और विविध N- और ओ से जुड़े oligosaccharides से सजाया जाता है। immunoblots में से प्रत्येक पर लेन 1 अनुपचारित हृदय अर्क प्रतिनिधित्व करता है। लेन 2 एंजाइमों कि ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स पचाने के साथ इलाज के अर्क होता है। लेन 3 में नमूने होते हैं, इसके अलावा में, N- और ओ से जुड़े oligossacharides को हटाने के लिए एंजाइमों। Galectin -1 ग्लाइकोसिलेटेड नहीं है, इसलिए प्रोटीन आकार में कोई परिवर्तन है। लिंच एम, एट अल से अनुकूलित। 4 (सी) में नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण, एच 2 18 हे की उपस्थिति में PNGase-एफ के साथ इलाज के नमूने गैर deglycosylated नमूने की तुलना में बेहतर अनुक्रम कवरेज (%, दाईं ओर) को प्राप्त करने। डीसंदूक हरे क्षेत्रों LC-एमएस / एमएस द्वारा अनुक्रम कवरेज प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल, बिंदीदार उनके एमिनो एसिड स्थिति का संकेत संख्या के साथ, glycosites प्रतिनिधित्व करते हैं। स्थिति में decorin की ग्लाइकोसिलेशन की जांच Asn 211 (एन, बोल्ड अक्षरों में हाइलाइट) चित्रा 4 में एक उदाहरण के रूप में विस्तार से दिखाया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Glycopeptide विश्लेषण एमएस द्वारा। (ए) ईसीएम समृद्ध अर्क पर एक बन्दूक प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण का उपयोग करना, ग्ल्य्कोपेप्तिदेस और NXT / एस sequons भीतर deamidated asparagines की मौजूदगी से पहचाना जा सकता है 18 ओ के साथ लेबल उदाहरण युक्त decorin की एक पेप्टाइड के लिए एक HCD एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम से पता चलता पहले से Asn 211 ग्लाइकोसिलेटेड। डेटा प्राप्त किया जा सकता हैईसीएम ग्लाइकोप्रोटीन के एक अनुकूलित डेटाबेस बनाने के लिए। (बी) HCD-ETD विखंडन glycopeptide समृद्ध ईसीएम निकालने का विश्लेषण किया जाता है। ETD एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम glycan संरचना के लक्षण वर्णन अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ए स्टॉक समाधान
डीटीटी (Dithiotreitol, सी 4 एच 10 हे 2 एस 2) DDH 2 में 100 मिमी डीटीटी ओ 1
EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड, सी 10 एच 16 एन 2 हे 8) 250 DDH 2 हे, पीएच 8.0 में मिमी EDTA।
GuHCl (guanidine हाइड्रोक्लोराइड, सीएच 6 CLN 3) में 8 एम GuHClDDH 2
आईएए (iodoacetamide, सी 2 एच 4 आईएनओ) DDH 21,2 में 500 मिमी आईएए
ना एसीटेट (सोडियम एसीटेट, सी 2 एच 3 Nao 2) DDH 2 हे, पीएच 5.8 में 1 एम ना एसीटेट।
NaCl (सोडियम क्लोराइड, सोडियम क्लोराइड) DDH 2 ओ में 1 एम NaCl
ना फॉस्फेट द्विक्षारकीय (Disodium फॉस्फेट, ना 2 एच 2 पीओ 4) 1 dd एच 2 हे, पीएच 6.8 में एम ना फॉस्फेट द्विक्षारकीय।
एसडीएस (सोडियम dodecyl सल्फेट, एनएसी 12 एच 25 एसओ 4) DDH 23 में 1% एसडीएस (35 मिमी)
TFA (trifluoroacetic एसिड, सी 2 HF 3 हे 2) 10% DDH 2 ओ में TFA (1.2 मीटर)
TEAB (Triethylammonium बाइकार्बोनेट, सी 7 एच 17 3) ddH2O, पीएच 8.5 में में 1M TEAB
Thiourea (Thiourea, सीएच 4 एन 2 एस) DDH 2 ओ में 3 एम thiourea
Tris-एचसीएल (Tris-हाइड्रोक्लोराइड (राष्ट्रीय राजमार्ग 11 सी 4 हे 3 [एचसीएल]) 100 DDH 2 हे, पीएच 7.5 में मिमी Tris-एचसीएल।
यूरिया (यूरिया, सीएच 4 एन 2 ओ) DDH 2 ओ में 9 एम यूरिया
बी रिएक्शन बफ़र्स
C18 सफाई संतुलन बफर 1% ACN, 0.1% TFA DDH 2 हे में
C18 सफाई स्तंभ धोने बफर 80% एच 2 ओ में ACN, 0.1% TFA
C18 सफाई क्षालन बफर 50% acetonitrile, 0.1% TFA DDH 2 हे में
Deglycosylation बफर (4x) 600 मिमी NaCl और 200 DDH 2 हे, पीएच 6.8 में मिमी ना फॉस्फेट।
GuHCl बफर 4 4 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड, 50 मिमी ना एसीटेट और DDH 2 हे, पीएच 5.8 में 25 मिमी EDTA। जोड़े 1: 100 (V: v) proteinase अवरोधकों की कॉकटेल का उपयोग करने से पहले।
सोडियम क्लोराइड बफर 4 0.5 एम NaCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल और DDH 2 हे में 25 मिमी EDTA, पीएच 7.5। जोड़े 1: 100 (V: v) proteinase अवरोधकों की कॉकटेल का उपयोग करने से पहले।
पीबीएस (1x) 1.7 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 5 मिमी ना 2 HPO 4, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.4। जोड़े 25 मिमी EDTA और 1: 100 (V: v) proteinase अवरोधकों की कॉकटेल का उपयोग करने से पहले।
नमूना बफर (4x) 100 मिमी Tris, 2% एसडीएस, 40% ग्लिसरॉल, 0.02% DDH 2 हे, पीएच 6.8 में bromophenol नीले। उपयोग करने से पहले 10% ß-mercaptoethanol जोड़ें।
एसडीएस बफर 4 0.1% एसडीएस और DDH 2 में 25 मिमी EDTA ओ जोड़े 1: 100 (V: v) bef proteinase अवरोधकों की कॉकटेल कीअयस्क उपयोग।
सी एंजाइमों
Chondroitinase एबीसी 5 0.5 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
Keratanase 5 0.1 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
हेपरिनेज़ द्वितीय 5 0.1 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
α2-3,6,8,9-neuraminidase (sialidase) 5 0.025 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
β1,4-Galactosidase 5 0.015 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
बीटा-एन-Acetylglucosaminidase 5 0.25 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
इंडो-α-एन-acetylgalactosaminidase (ओ-glycosidase) 5 0.013 यू deglycosylation बफर में / एमएल (1x)
PNGase-F (एन glycosidase-एफ) 6 50 यू / एच में एमएल 2 18 हे
ट्रिप्सिन 0.01 माइक्रोग्राम TEAB बफर में / μL
टेबल नोट।
1 शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रखें।
2 आईएए रखा जाना चाहिए प्रकाश से संरक्षित किया।
3 एसडीएस आसानी से <20 डिग्री सेल्सियस पर क्रिस्टलीकृत। आदेश 1% एसडीएस (शेयर समाधान) के solubilization सुविधाजनक बनाने के लिए, गर्म नल के पानी के नीचे बफर गर्म।
4 निष्कर्षण बफ़र्स आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है। proteinase अवरोधकों की व्यापक स्पेक्ट्रम कॉकटेल के रूप में जोड़ें उपयोग करने से पहले संकेत दिया।
5 ये एंजाइम पहले deglycosylation चरण के दौरान जोड़ा जाना चाहिए।
6 PNGase-एफ केवल दूसरे deglycosylation चरण के दौरान जोड़ा जाना चाहिए।

तालिका 1: स्टॉक समाधान, रिएक्शन बफ़र और एंजाइमों। इस तालिका में प्रत्येक शेयर समाधान और प्रतिक्रिया बफर एमएस विश्लेषण करने से पहले हृदय ईसीएम प्रोटीन की निकासी और बाद प्रसंस्करण (एंजाइमी पाचन सहित) के लिए आवश्यक की संरचना सूचीबद्ध करता है।

Discussion

यह प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल हमारे प्रयोगशाला में पिछले कुछ वर्षों में अनुकूलित किया गया है। यहाँ, हम हृदय ऊतक का इस्तेमाल किया है, लेकिन केवल मामूली समायोजन अन्य ऊतकों के लिए अपने आवेदन के लिए आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, निष्कर्षण प्रोटोकॉल को ध्यान में ऊतक के कोषमयता लेने के लिए की जरूरत है। हृदय ऊतक संवहनी ऊतक की तुलना में अत्यधिक सेलुलर है। संवहनी ऊतक का उपयोग कर, एसडीएस एकाग्रता कम (यानी 0.08%) हो सकता है और decellularization समय कम (यानी 4 घंटे) 11, 12, 13 है। deglycosylation एंजाइमों के उपयोग ईसीएम रचना की LC-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, ऊष्मायन बार अलग ऊतक प्रकार के लिए समायोजित करने की आवश्यकता। उदाहरण के लिए, जब इस तरह के त्वचा के रूप में नमूने, जो तहखाने झिल्ली प्रोटीन से भरपूर होते हैं (जैसे Agrin, perlecan) (डेटा नहीं दिखाया गया है) का उपयोग कर 25 डिग्री सेल्सियस पर द्वितीय आवश्यक बढ़ाया ऊष्मायन बार हेपरिनेज़। प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण संस्कृति 15 में कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया पर किया जा सकता। संवर्धन चरणों इस सरलीकृत subproteome के विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है। GuHCl अर्क के समान, सोडियम क्लोराइड के अर्क भी मामूली संशोधनों के साथ glycoproteomics विश्लेषण के लिए जिम्मेदार होते हैं। ईसीएम प्रोटीन के संवर्धन के लिए अन्य निष्कर्षण प्रोटोकॉल ईसीएम ग्ल्य्कोपेप्तिदेस 19, 20 चिह्नित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता।

ग्लाइकोसिलेशन सबसे जटिल PTM 5 है। ग्ल्य्कोपेप्तिदेस के अप्रत्यक्ष पहचान एक NXT / एस sequon में शामिल 18 हे के साथ deamidated Asn का पता लगाने के द्वारा हासिल की है। अन्य पदों पर Deamidated Asn झूठे सकारात्मक प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसी तरह, एन ग्लाइकोसिलेशन प्रोटीन ontologies के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए: intracellular एक NXT / एस sequon युक्त प्रोटीन ग्लाइकोसिलेटेड नहीं किया जाएगा, लेकिन झूठे सकारात्मक को जन्म दे सकता है। वर्तमान searc के रूप मेंज एल्गोरिदम पूर्व निर्धारित दृश्यों केवल (यानी NXT / एस पर Asn) पर PTMs की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति नहीं देते, डेटा के मैनुअल छानने की आवश्यकता है। इन पदों पर ग्लाइकोसिलेशन की उपस्थिति / अनुपस्थिति की पहचान की बीमारी और नियंत्रण के नमूने के बीच तुलना की जा सकती। वहाँ O-deglycosylation के लिए PNGase एफ करने के लिए कोई एंजाइम बराबर (यानी threonine या सेरीन पर एक जन पारी शुरू करने) है। इसलिए, O-ग्लाइकोसिलेशन की पहचान प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण के लिए प्रतिबंधित है। प्रत्यक्ष glycopeptide विश्लेषण प्रोटीन से जुड़ी शर्करा के compositional जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जाता है, लेकिन glycan के संरचनात्मक जानकारी प्रदान नहीं करता। इसके अलावा, glycan संरचना glycan संश्लेषण और प्रसंस्करण स्राव के बाद का परिणाम है।

ईसीएम प्रोटीन के लिए हमारे 3-चरणों निष्कर्षण विधि ( "अंग्रेजी Quickstep") 6 हृदय के ऊतकों की एक किस्म में ईसीएम की विशेषताओं की अनुमति दी है। ऊतक के विभाजनकई निष्कर्षों में के रूप में कहीं और 6 पर चर्चा की एक सरल ईसीएम proteome प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। Intracellular प्रोटीन अन्यथा अर्क है कि कम प्रचुर मात्रा में ईसीएम प्रोटीन की पहचान में बाधा आएगी भीतर प्रोटीन प्रचुरता की अत्यधिक गतिशील रेंज में योगदान होगा। इसके अलावा, intracellular प्रोटीन O-glycosylations 5 कि जटिल हैं ईसीएम glycopeptide संवर्धन और बाद में एमएस विश्लेषण ले। अन्य लेखकों समान निष्कर्षण के तरीके लागू किया उदाहरण फेफड़ों 21 और उपास्थि ऊतकों 10 के लिए चिह्नित करने के लिए, लेकिन वे ग्लाइकोसिलेशन के विश्लेषण का पीछा नहीं किया। ग्लाइकोसिलेशन का पिछला विश्लेषण, केवल glycosites की पहचान पर ध्यान केंद्रित प्रोटीन कोर से glycan को हटाने की आवश्यकता होती है, और O-ग्लाइकोसिलेशन 22, 23 का आकलन नहीं कर सकते। लेक्टिन सरणियों और रासायनिक संवर्धन glycan typ के मूल्यांकन के लिए उपलब्ध हैंजैविक नमूनों पर तों अपने बाध्यकारी विशिष्टता के आधार पर है, लेकिन इन तकनीकों विशिष्ट प्रोटीन से 24 glycan प्रकार निर्धारित करना नहीं कर सकते और न ही वे ग्लाइकोसिलेशन साइटों का आकलन कर सकते हैं।

प्रारंभ में, हम नियंत्रण रेखा-एमएस / ईसीएम प्रोटीन की एमएस करने से पहले जेल वैद्युतकणसंचलन का इस्तेमाल किया। हालांकि जेल जुदाई LC-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए उत्तरदायी सरलीकृत प्रोटीन अंशों प्राप्त करने में उपयोगी है, नवीनतम उपकरणों की गति तेजी से स्कैन प्रदान करते हैं। इस प्रकार, electrophoretic जुदाई कदम छोड़ा जा सकता है। यह एक अतिरिक्त लाभ के रूप में बड़े ईसीएम प्रोटीन है, जो जेल के शीर्ष पर रखा जाता है, और अधिक कुशलता से विश्लेषण किया जाता है प्रदान करता है। हालांकि, बरकरार प्रोटीन की मेगावाट के बारे में जानकारी खो दिया है। वाष्पीकरण कदम PNGase एफ deglycosylation करने से पहले नियमित रूप से एच 2 ओ को पूरी तरह निकाला मिथ्या नकारात्मक कम करने के लिए सुनिश्चित करता है। चीनी के अवशेष (यानी चर glycan जनता) नियंत्रण रेखा से जुदाई के साथ हस्तक्षेप और एमएस / एमएस द्वारा बाद में पेप्टाइड पहचान समझौता। एक पीएक-deglycosylation प्रोटोकॉल भी ग्लाइकोसिलेशन पर ध्यान केंद्रित नहीं ईसीएम प्रोटीन की प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए सिफारिश की है।

प्रोटिओमिक्स ईसीएम में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। संरचनात्मक समर्थन के अलावा, ईसीएम से जुड़ी ग्लाइकान मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, सेल कोशिका संचार और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 25, अंग प्रत्यारोपण के बाद यानी allograft अस्वीकृति के लिए आवश्यक हैं। Glycoproteomics glycobiology में एक अनिवार्य उपकरण हो जाएगा।

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

JBB किंग्स ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन केंद्र में एक कैरियर स्थापना फेलो भी हैं। एम.एम. ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन के एक वरिष्ठ साथी है (एफएस / 13/2 / २९८९२)। अध्ययन एक उत्कृष्टता पहल द्वारा समर्थित किया गया (क्षमता केंद्र बढ़िया टेक्नोलॉजीज के लिए - कोमेट) ऑस्ट्रिया के अनुसंधान संवर्धन एजेंसी FFG की: "संवहनी में उत्कृष्टता के अनुसंधान केंद्र एजिंग - टायरॉल, VASCage" (कश्मीर परियोजना संख्या 843,536) और NIHR जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र किंग्स कॉलेज अस्पताल के साथ साझेदारी में लड़का और सेंट थॉमस के राष्ट्रीय स्वास्थ्य सेवा फाउंडेशन ट्रस्ट और किंग्स कॉलेज लंदन में आधारित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Chemicals
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) Thermo Scientific 51101 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Cocktail of proteinase inhibitors Sigma-Aldrich P8340 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Disodium phosphate (Na2H2PO4) Sigma-Aldrich S7907 3.1
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) Sigma-Aldrich D0632 4.3
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) Sigma-Aldrich E9884 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Ethanol (C2H6O) VWR 437433T 2.2.1
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) Sigma-Aldrich G3272 1.6.1
Glycerol (C3H8O3) Acros organics 158920025 Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv Sigma-Aldrich 39253-1L-R Throughout the protocol
H218O Taiyo Nippon Sanso FO3-0027 3.5
Hydroxylamine (HA, H3NO) Sigma-Aldrich 467804 6.4
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) Sigma-Aldrich A3221 4.4
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10x Lonza 51226 1.3
Sodium acetate (C2H3NaO2) Sigma-Aldrich S7545 1.6.1
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 1.4.1, 3.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) Sigma-Aldrich 466143 1.5.1
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) Sigma-Aldrich 11268 4.7, 6.1
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) Sigma-Aldrich T62200 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Thiourea (CH4N2S) Sigma-Aldrich T8656 4.2
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) Sigma-Aldrich T3253 1.4.1, Suppl 1.
Urea (CH4N2O) Sigma-Aldrich U1250 4.2
Name Company Catalog Number Comments
B. Enzymes
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) EDM Millipore 362280 (KP0012) 3.1
β1,4-Galactosidase EDM Millipore 362280 (KP0004) 3.1
β-N-Acetylglucosaminidase EDM Millipore 362280 (KP0013) 3.1
Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C3667 3.1
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) EDM Millipore 362280 (KP0011) 3.1
Heparinase II Sigma-Aldrich H6512 3.1
Keratanase Sigma-Aldrich G6920 3.1
PNGase-F (N-Glycosidase F) EDM Millipore 362280 (KP0001) 3.5
Trypsin Thermo Scientific 90057 4.7
Name Company Catalog Number Comments
C. Reagent kits
30 kDa MWCO spin filters  Amicon, Millipore 10256744 5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate Harvard Apparatus 74-5657 5.1
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels Thermo-Scientific NP0322PK2 Suppl 1
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 2.1.3
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit Merk Millipore 72103 7
Tandem mass tag 0 (TMT0) Thermo Scientific 900067 6.2, 6.3
Name Company Catalog Number Comments
D. Equipment and software
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5 mm x 300 µm, 5 µm, 100 Å Thermo Scientific 160454 Suppl 3, 4
Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 µm, 3 µm, 100 Å Thermo Scientific 164570 Suppl 3
Byonic Search Engine Protein Metrics Version 2.9.30 Suppl 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano Thermo Scientific n/a Suppl 3, 4
EASY-Spray Ion Source  Thermo Scientific ES081 Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50 cm x 75 µm, 2 μm, 100 Å Thermo Scientific ES803 Suppl 4
Mascot Search Engine Matrix Science Version 2.3.01 Suppl 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ Suppl 4
Proteome Discoverer Software Thermo Scientific Version 2.1.1.21 Suppl 3, 5
Picoview Nanospray Source New Objective 550 Suppl 3
Q Exactive HF Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Suppl 3
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Scaffold Software Proteome Software  Version 4.3.2 Suppl 3

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