Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de

Published 7/23/2017
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Biochemistry

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Summary

Utilizou-se uma metodologia baseada em gradiente de centrifugação por densidade modificada para isolar células epiteliais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus . As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.

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Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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Abstract

Rhipicephalus microplus - o carrapato do gado - é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico sobre o gado como um vetor de vários agentes patogênicos. Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado para diminuir seus efeitos deletérios, com foco na descoberta de vacinas candidatas, como o BM86, localizado na superfície das células epiteliais do intestino do carrapato. Pesquisa atual enfoca a utilização de bibliotecas de cDNA e genômicas, para pesquisar outras vacinas candidatas. O isolamento das células intestinais do carrapato constitui uma vantagem importante na investigação da composição das proteínas superficiais sobre a membrana das células intestinais do carrapato. Este artigo constitui um método inovador e viável para o isolamento de células epiteliais, a partir dos índices de intestino de carvão de R. microplus semi-engrossado . Este protocolo utiliza TCEP e EDTA para libertar as células epiteliais dos tecidos de suporte subepitelial e um gradiente de centrifugação de densidade descontínuaNt para separar as células epiteliais de outros tipos de células. As proteínas da superfície celular foram biotiniladas e isoladas das células epiteliais intestinais do carrapato, utilizando grânulos magnéticos ligados à estreptavidina, permitindo aplicações a jusante em FACS ou LC-MS / MS-analysis.

Introduction

Rhipicephalus microplus , o carrapato do gado, é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico na indústria pecuária de regiões tropicais e subtropicais, na medida em que eleva a febre do carrapato bovino (babesiose), anaplasmose e piroplasmose equina 1 , 2 , 3 , 4 . Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado, para diminuir o efeito deletério, no entanto, os métodos convencionais, como o uso de acaricidas químicos, apresentam desvantagens implícitas, como a presença de resíduos químicos no leite e a carne e o aumento da prevalência de carrapatos quimicamente resistentes 5 , 6 , 7 . Conseqüentemente, o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de tiquetaque foi estudado, como o uso de bovinos de resistência natural, controle biológico (biopesticidas) e vacinaInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

Na busca de proteínas capazes de serem utilizadas como vacinas candidatas, a pesquisa atual é focada no intestino do carrapato. A parede do intestino médio é construída a partir de uma única camada de células epiteliais descansando sobre uma lâmina basal fina, com a parte externa da lâmina basal formando uma rede de músculo. As observações de luz e microscópio eletrônico indicam que o intestino médio consiste de três tipos de células: reserva (indiferenciada), secreção e digestivo. O número de tipos de células varia consideravelmente dependendo da fase fisiológica. As células secretoras e digestivas originam-se das células de reserva 18 , 19 , 20 .

A construção de bibliotecas de cDNAPara examinar a composição do intestino do carrapato levou à identificação de proteínas antigênicas, como o Bm86, como potenciais candidatos à vacina 2 , 3 , 4 . A glicoproteína Bm86 está localizada na superfície das células intestinais do carrapato e induz uma resposta imune protetora contra o carrapato do gado ( R. microplus ) no gado vacinado. As IgG anti-Bm86 produzidas pelo hospedeiro imunizado são ingeridas pelo carrapato, reconhecem este antígeno na superfície das células intestinais do carrapato e, posteriormente, perturbam a função e integridade do tecido intestinal. As vacinas baseadas em antígenos Bm86 mostraram controle efetivo de R. microplus e Rhipicephalus annulatus, reduzindo o número, peso e capacidade reprodutiva das fêmeas envolventes, resultando em uma infestação larval reduzida nas gerações subseqüentes do carrapato 4 . No entanto, as vacinas baseadas em Bm86 não são eficazes contra todos os estádios de carrapatos e têmDemonstraram eficácia insatisfatória contra algumas cepas geográficas de R. microplus , conseqüentemente as indústrias de carne bovina e láctea adotam mal estas vacinas 2 , 4 .

A capacidade de isolar células epiteliais do intestino do carrapato é uma inovação significativa que permitiria a progressão da pesquisa para determinar a composição da membrana protéica, incluindo morfologia e fisiologia sob diferentes condições ambientais. O método aqui descrito utiliza o agente de quelação de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o agente redutor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para libertar o epitélio dos seus tecidos de suporte subepitelial 10 . O epitélio é recuperado após a ruptura mecânica dos tecidos por agitação, seguida de centrifugação descontínua gradiente em Percoll. Este artigo descreve uma técnica viável e inovadora para o isolamento do intestino intestinal epiCélulas celulares. As proteínas de superfície celular biotiniladas, isoladas a partir da superfície destas células epiteliais, podem subsequentemente analisar em aplicações a jusante tais como análise de FACS e / ou LC-MS / MS.

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Protocol

1. Dissecção do Epitélio Gut de R. microplus

  1. Recolher carrapatos semi-engorrosados ​​do gado no dia do experimento. Dissecte os tiques dentro de 24 h após a remoção do hospedeiro.
  2. Aderir uma tira de fita adesiva ao fundo da placa de Petri 92 mm x 16 mm. Adicione uma gota de super cola à fita adesiva. Coloque o tiquetaque, lado ventral para baixo sobre a super cola, deixe secar por 2 min.
  3. Despeje 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na placa Petri, ou até que o carrapato esteja completamente submerso.
  4. Utilizando um bisturi do tamanho 11, corte do topo dos olhos para as festinhas inferiores, em ambos os lados do tiquetaque.
  5. Usando fórceps estéril, remova completamente o scutum e alloscutum , para expor os órgãos internos.
  6. Remova os órgãos finos de fio branco (traquéia) e outras membranas para evitar a contaminação.
  7. Remova o intestino usando fórceps, apertando a região superior e puxando docarcaça. Remova os tecidos de intestino restantes, garantindo que nenhum outro tecido tenha sido dissecado.
  8. Armazene o intestino na Solução Salgada equilibrada de Sal Hank (HBSS) com cloreto de cálcio e sulfato de magnésio com coquetel inibidor de proteinase (PIC). Fique congelado nas tripas em gelo seco e armazene a -20 ° C.
    Nota: Para auxiliar na dissecação intestinal e nos detalhes dos órgãos internos do carimbo, consulte o Capítulo 3.1 de D. Sonenshine, "Biologia dos Carrapatos" 19 .

2. Dissociação de células epiteliais

  1. Despeje o intestino dissecado sobre um filtro de células de 70 μm dentro de um tubo de 50 mL.
  2. Lave o tecido intestinal com 50 mL de HBSS gelado com PIC até que a solução fique clara e as tripas assumam uma aparência branca / clara.
  3. Re-suspende as tripas em 30 mL de HBSS gelado com PIC, misture suavemente e centrifugue a 500 xg a 4 ° C durante 10 minutos para sedimentar o intestino. Remova o sobrenadante e repita o processo de lavagem três vezes.
  4. Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 250 μm, vorteie o fluxo e filtre através de um filtro de células de 70 μm coletando o fluxo restante.
  5. Centrifugar a suspensão a 500 xg a 4 ° C durante 20 minutos para sedimentar as células individuais.

3. Isolamento de células epiteliais simples usando um gradiente de centrifugação de densidade

  1. Prepare gradiente de centrifugação de densidade ( por exemplo , Percoll), filtrando-se através de um papel de pré-filtro AP15. Prepare 40% e um Percoll de 20% em mqH 2 0 (v / v) e arrefecer a 4 ° C durante 1 h antes da camada do gradiente.
  2. Usando um peristálticoBomba ajustada na velocidade mais baixa, coloque 3 mL de gradiente de centrifugação de densidade de 40% em um tubo de ultracentrífuga de 16 mL, permitindo que ele se assente no gelo durante 15 min. A velocidade da bomba deve levar a uma taxa de fluxo de <1 mL por minuto.
  3. Inclinando o tubo para um ângulo de 45 °, use a bomba peristáltica para aplicar o gradiente de centrifugação de densidade de 20% em cima da camada de 40%. A velocidade da bomba deve levar a uma taxa de fluxo de <1 mL por minuto. Permitir que as camadas se apliquem no gelo durante 15 min.
  4. Use a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de <1 mL por min para a camada 3 mL de meio DMEM contendo células intestinais do carrapato sobre o gradiente de centrifugação de densidade de 20-40%.
  5. Programe a centrífuga para aceleração máxima e desaceleração mínima. Centrífuga a 600 xg por 10 min. Colete interfases entre o DMEM: gradiente de centrifugação de densidade de 20% e os gradientes de centrifugação de densidade de 20%: 40% para isolar células individuais epiteliais. Armazene as interfases coletadas a 4 ° C para análises subsequentes.

4. Avaliação do isolamento celular

  1. Hemicitômetro
    1. Limpe o deslize com hematómetro com álcool.
    2. .Re-suspende as células pipetando suavemente as células para cima e para baixo. Pipetar 100 μL da suspensão celular e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Adicione 400 μL de 0,4% de Trypan Blue. Misture gentilmente acendendo o tubo.
    4. Pipetar 100 μL da suspensão de células tratadas com Trypan Blue para preencher lentamente ambas as câmaras do hemocitómetro.
    5. Coloque o hemocitómetro sob um microscópio de luz, com foco nas linhas de grade do hemocitômetro com um objetivo de 10X.
    6. Usando um contador de contos de mão, conte as células vivas sem coloração dentro de um conjunto de 16 quadrados. Dentro do mesmo quadrado, conte com as células mortas azuis. Continue contando até quatro conjuntos de 16 quadrados são contados.
    7. Calcule as células totais por mL usando a fórmula:
      47eq1.jpg "/>
    8. Calcule a porcentagem de viabilidade celular usando a fórmula:
      Equação 2
  2. Visualização de isolamento celular
    1. Diluir 1 μL das células isoladas em 9 μL de HBSS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mova suavemente o tubo de microcentrífuga para misturar.
    2. Pipetar 5 μL de células isoladas em HBSS no meio de uma lâmina de vidro. Aplique três gotas de meio de montagem com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).
    3. Incubar a corrediça à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque cuidadosamente uma cobertura sobre a preparação, evitando bolhas de ar.
    4. Visualize células coradas com DAPI à excitação 360 nm e emissão a 460 nm sob um microscópio fluorescente.

5. Biotinilação de proteína de superfície celular

  1. Biotinilato 100 μL de células epiteliais de célula única usando conjugação de Biotina (Tipo A)Kit, com uma proporção molar de proteína de superfície 1: 1 para conjugar, de acordo com as instruções do fabricante
  2. Para a lise celular, adicione 100 μL de PBS, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, glutationa oxidada 100 μM e PIC nas células biotiniladas. Incubar no gelo durante 1 h com uma mistura suave a cada 10 min.
  3. Centrifugar as células biotiniladas a 20 000 xg a 4 ° C durante 20 min para sedimentar material insolúvel. Recolher o sobrenadante contendo proteínas de membrana citoplasmáticas e biotiniladas.
  4. Determine a concentração de proteína usando o ensaio de Bradford.

6. Isolamento de proteínas de superfície biotiniladas

  1. Adicione 50 μL de grânulos magnéticos de estreptavidina a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Coloque o tubo em um suporte magnético, recolhendo as contas contra o lado do tubo. Remova e descarte o sobrenadante.
  3. Adicione 1000 μL de TBS, 0,1% de Tween-20 ao tubo. Misture suavemente e colete as contas com o stan magnéticoD. Remova e descarte o sobrenadante.
  4. Combine 40 μg de proteínas de superfície celular biotiniladas, diluídas para 300 μL em 1x PBS com esferas magnéticas lavadas. Incubar durante 2 h à temperatura ambiente com agitação.
  5. Colete as contas com um suporte magnético, remova e descarte o sobrenadante.
  6. Adicione 300 μL de TBS, 0,1% de Tween-20 ao tubo, misturando suavemente para voltar a suspender as contas. Coletar pérolas, remover e descartar o sobrenadante. Repita este passo de lavagem duas vezes.
  7. Adicionar 100 μL da glicina 0,1 M pH 2,0 às esferas magnéticas e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Coletar esferas e remover o sobrenadante contendo proteínas de superfície biotiniladas eluidas.
  8. Visualize proteínas de superfície isoladas em um gel SDS-PAGE Tris-MOPS a 4-20%.

7. Avaliação da Proteína de Superfície Biotinilada

  1. Dot Blot
    1. Corte uma tira de 7 cm x 3 cm de membrana de nitrocelulose.
    2. Aplicar 10 μg total de carrapato guT (a partir de 1,8 acima) e 10 μg de proteína de superfície biotinilada para a membrana. Permitir a secagem durante 15 minutos à temperatura ambiente.
    3. Transfira para um recipiente e imergir em 100 mL de tampão de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente com agitação durante uma hora. Descarte o buffer de bloqueio.
    4. Lavar a membrana de nitrocelulose em 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 min com agitação. Descarte o buffer de lavagem e repita as lavagens por três vezes.
    5. Incubar em 1/5000 Streptavidin-peroxidase de rábano (HRP) em 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 2 h com agitação à temperatura ambiente e descartar qualquer solução restante.
    6. Lavar a membrana de nitrocelulose em 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 durante 5 min com agitação. Descarte o tampão de lavagem e repita a lavagem três vezes.
    7. Para a detecção, dissolver 1 comprimido de 4-cloro-1-naftol em 10 mL de metanol gelado. Adicione 4 mL de estoque de metanol a 20 mL de TBS. Adicione 10 μL de peróxido de hidrogênio 30% fresco e immediaAplicar-se à membrana de nitrocelulose.
    8. Incubar com agitação à temperatura ambiente até o substrato produzir um produto final azul insolúvel. Isso pode demorar entre 2-15 min.
    9. Descarte a solução de detecção e lave a membrana três vezes em 100 μL de mqH 2 O.
  2. Ensaio ELISA
    1. Diluir 200 ng de cada amostra com 400 μL de tampão de revestimento de Carbonato 100 mM e revestir 2 pistas da primeira fila (A #) da placa ELISA (poços de fundo plano)
    2. Adicione 100 μL de tampão de revestimento de carbonato 100 mM a todos os outros poços correspondentes em linhas (BH).
    3. Prepare diluições em série de cada amostra, pipeteando 100 μL de cada poço na linha A, e transfira para a linha B. Misture suavemente por pipetagem e evite produzir bolhas. Repita as diluições por cada linha, descartando os 100 μL finais de cada poço na linha H.
    4. Cubra a placa com parafilme e incube a 4 ° C durante a noite.
    5. Lave a plataformaE com 200 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 por poço três vezes.
    6. Adicione 200 μL de tampão de bloqueio aos poços revestidos, cubra com Parafilm e incube a 4 ° C durante a noite.
    7. Diluir 1 / 15,000 Streptavidina-HRP em tampão de bloqueio e adicionar 100 μL a cada poço da placa. Cubra com parafilme e incube a 4 ° C durante a noite.
    8. Lave a placa em 200 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 por poço cinco vezes.
    9. Para detectar, adicione 100 μL de reagente TMB por poço. Após um desenvolvimento de cor suficiente, geralmente entre 10-15 min, adicione 100 μL de ácido fosfórico 1 M para parar a reação.
    10. Leia a absorvância de cada poço em λ = 450nm.

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Representative Results

As células epiteliais foram isoladas dos tecidos intestinais de R. microplus de acordo com o esquema apresentado na Figura 1 . A imagem de microscopia de fluorescência representativa das células epiteliais intestinais do carrapato, preparada usando este protocolo, é mostrada na Figura 2A E 2B. À medida que o isolamento das células é conduzido com o R. microplus semi-engrossado , as células aparecem como uma morfologia de superfície simples, esférica e lisa e um tamanho consistente em toda a amostra. As diferenças no tamanho e tipo de populações de células intestinais são mais evidentes uma vez que o carrapato avança para se tornar adultos totalmente engorrosos.

A coloração fluorescente do núcleo de células epiteliais isoladas com DAPI ajuda a visualizar as células. Os isolamentos pobres são visualizados para conter a dissociação incompleta do epitoCélulas eliais com populações de células variáveis ​​identificadas através dos diferentes tamanhos de células e morfologias ( Figura 2C e 2D )

Utilizando este protocolo, aproximadamente 1,2 x 10 7 células por / mL de 50 dissecções intestinais, com 75-80% de viabilidade foram isoladas com sucesso de R. microplus tossão. A contaminação cruzada das proteínas do hospedeiro ( Figura 3A ) pode ser minimizada ao enxaguar adequadamente as tripas até que tenham uma aparência branca que resulte em um gradiente de Percoll branco / claro ( Figura 3B ).

As proteínas ligadas à superfície foram isoladas através da biotinilação de proteínas ligadas à superfície, destruição de membranas celulares e a purificação de proteínas de superfície biotiniladas com esferas de estreptavidina magnética. Um total de 20-24 μg de biotino purificadoAs proteínas da superfície lata podem ser isoladas para aplicações em baixa a partir de uma dissecção inicial de tripas de 50x utilizando este protocolo. A comparação das proteínas por SDS-PAGE ( Figura 4A ), mancha de prata ( Figura 4B ), Dot blot ( Figura 5 ) e ELISA ( Figura 6 ) indica que a metodologia descrita purificou com sucesso as proteínas de superfície biotiniladas de células epiteliais isoladas do tiquetaque R. microplus intestino.

figura 1
Figura 1 : Representação esquemática para isolar proteínas biotiniladas presentes na superfície das células do intestino médio R. microplus . Por favor clClique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2 : Visualização do microscópio de fluorescência (100x) das células epiteliais de R. microplus do intestino médio coradas com DAPI. O software foi usado para realizar a sobreposição de fluorescência. A & B) Representam células epiteliais isoladas com sucesso do intestino médio R. microplus . C / D) Células epiteliais isoladas do intestino R. microplus contaminado com tecidos de carrapatos maiores.

Figura 3
Figura 3 : gradiente de Percoll contendo DMEM: Percoll de 20%: Percoll de 40%. As camadas de células epiteliais foram formadas entre o DMEM: 20% de PErcoll e o Percoll de 20: 40%. ( A ) Tossir a dissecação intestinal sem passo de lavagem adequado. ( B ) Faça a dissecação do intestino com o passo de lavagem adequado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 : Separações eletroforéticas de proteínas de superfície biotiniladas em 4-20% de gel Tris-MOPS, a 140 V por 55 min com 10 μg de amostra utilizada. (L) PageRuler Escala de proteína preservada (1) Amostra total de intestino total R. microplus não marcada (2) Proteínas biotiniladas extraídas de intestino inteiro R. microplus conforme o passo 6. (3) Proteínas de células epiteliais extraídas de intestino R. microplus não marcado (4 ) Proteínas biotiniladas extraídas de R. microplusCélulas epiteliais de acordo com a etapa 6. ( A ) SDS-PAGE corada pela mancha Comassie blue ( B ) Silver.

Figura 5
Figura 5 : Análise de ponto de transferência. Streptavidin-HRP conjugado diluído 1 / 5.000. ( A ) Um total de 10 μg de extracto de proteína de intestino de tordo bruto ( B ) Proteínas de superfície biotiniladas extraídas de células epiteliais purificadas (10 μg).

Figura 6
Figura 6 : Avaliação da viabilidade das proteínas de superfície biotiniladas utilizando ELISA. O ELISA de proteínas de superfície foi desenvolvido por anticorpo conjugado com Strep-HRP diluído 1 / 15.000 contra diferentes concentrações de tic biotiniladoK proteínas intestinais (de 0,7 ng a 100 ng). As proteínas de intestino de tábuas não marcadas e a albumina de soro bovino (BSA) foram utilizadas como controle negativo do ELISA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As infestações por carrapatos de gado constituem um grande problema para a indústria do gado em regiões tropicais e subtropicais do mundo, com o método de controle mais comum dependendo do uso de acaricidas 1 , 4 . O Bm86 foi previamente identificado dentro da superfície epitelial do intestino do carrapato como um antígeno protetor contra a infestação de R. microplus 10 , com sucesso limitado como estratégia de vacina devido à variação da sequência geográfica Bm86 e ao requisito de aumento regular 4 .

As publicações anteriores centradas nas metodologias de isolamento epitelial foram principalmente focadas em espécies de vertebrados ou insetos 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Por exemplo, o fraccionamento precoce tenta isolar o intestino médioUtilizando técnicas de mamíferos, descobriu que a mesma metodologia não poderia ser aplicada a insetos devido à estrutura celular e às organizações diferentes 12 . Além disso, as técnicas de mamíferos dependem do uso de uma ou de uma das outras como colágenas, para digerir enzimáticamente as proteínas de junção célula-célula 9 , 13 . Dipase e colagenase afetam consideravelmente as proteínas ligadas à superfície celular e, portanto, as técnicas dependentes de seu uso não são adequadas para estudos de proteínas de superfície celular 15 . Os isolamentos de células do intestino médio insetos atualmente se concentram em duas técnicas. O primeiro utiliza a ruptura mecânica do intestino médio através do ultra-som, seguido de separação sobre um gradiente contínuo de sacarose linear 8 , 11 , 12 , 14 . Esta técnica mecânica produz amostras quase sem contaminantes, como éVer produz um baixo rendimento de microvillarmembranas 14 . A segunda técnica baseia-se na ruptura do Tris de membranas para liberar membranas microvíricas 8 .

A técnica descrita neste artigo permite o isolamento de células epiteliais, a biotinilação de proteínas de superfície e seu isolamento 16 , permitindo novos estudos através de aplicações a jusante, como espectrometria de massa ou FACS. O método aqui descrito utiliza o agente de quelação EDTA e o agente de redução TCEP. EDTA funciona para seqüestro de íons de cálcio, inibindo caderinas, rompendo junções celulares celulares mediadas por caderina, enquanto o TCEP reduz as ligações dissulfureto que confere a viscosidade da matriz peritrófica semelhante ao muco rica em glicano que separa a luz intestinal do epitélio. O epitélio é recuperado após a ruptura mecânica dos tecidos por agitação, seguida de centrifugação descontínua em gradiente na densidadeE gradiente de centrifugação. As células epiteliais são isoladas entre o DMEM: gradiente de centrifugação de densidade de 20% e 20%: 40% de camadas de gradiente de centrifugação de densidade.

A utilização de uma temperatura mais elevada durante a dissociação das células epiteliais fará com que os tecidos grandes se dissociem dos intestinos, levando à falta de isolamento das células epiteliais. Assegurar que a dissociação das células epiteliais seja conduzida prontamente após a dissecação do carrapato; A utilização de tampões gelados e a evitação de altas velocidades de centrifugação são cruciais na retenção de células viáveis ​​vivas. Apesar disso, o deslocamento de células maiores da lâmina basal pode fornecer alguma contaminação. Além disso, o epitélio do intestino médio do carrapato altera dramaticamente o tempo da última refeição de sangue 18 , 19 , 20 .

Como tal, este protocolo foi projetado e acessado em R. microplus Figura 1 ) são de natureza uniforme.

Em conclusão, os métodos utilizados neste estudo isolaram com sucesso células epiteliais de todo o intestino de R. microplus . Foram obtidas proteínas da superfície das células epiteliais R. microplus para análises e estudos adicionais. Finalmente, o protocolo desenvolvido demonstrou o potencial rendimento das células epiteliais do intestino do carrapato e a eficiência das proteínas de superfície biotiniladas da célula. O protocolo desenvolvido pode ser utilizado em qualquer espécie de carrapato de importância econômica em um esforço para investigar o carrapato: interações do hospedeiro, estudando a proteína da membrana comPosição do intestino.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Os autores desejam agradecer a Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Austrália) para a prestação de carrapatos Rhipicephalus microplus utilizados para este estudo e Lucas Karbanowicz para assistência em video-filmagem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

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References

  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
  3. García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
  4. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
  5. Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. AgNote No. K58. (2013).
  6. Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
  7. Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
  8. Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13, (18), 1804-1808 (1995).
  9. Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
  10. Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
  11. Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
  12. Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
  13. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
  14. Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
  15. Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
  18. Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. Pergamon Press. 201-205 (1982).
  19. Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
  20. Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).

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