Purification des protéines de surface cellulaire biotinylées de

Published 7/23/2017
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Biochemistry

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Summary

Une méthodologie à base de gradient de centrifugation modifiée a été utilisée pour isoler les cellules épithéliales du tissu intestinal de Rhipicephalus microplus . Les protéines liées à la surface ont été biotinylées et purifiées par des billes magnétiques de streptavidine pour une utilisation dans les applications en aval.

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Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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Abstract

Rhipicephalus microplus - la tache du bétail - est l'ectoparasite le plus important en termes d'impact économique sur le bétail en tant que vecteur de plusieurs agents pathogènes. Des efforts ont été dédiés au contrôle des tiques du bétail pour diminuer ses effets néfastes, en mettant l'accent sur la découverte de candidats vaccinés, tels que le BM86, situé à la surface des cellules épithéliales intestinales. La recherche actuelle se concentre sur l'utilisation de l'ADNc et les bibliothèques génomiques, afin d'examiner d'autres vaccins candidats. L'isolement des cellules intestinales de tiques constitue un avantage important dans l'étude de la composition des protéines de surface sur la membrane des cellules intestinales de la tique. Cet article constitue une méthode nouvelle et réalisable pour l'isolement des cellules épithéliales, à partir des tumeurs de la tumeur du R. microplus semi-engorgé . Ce protocole utilise le TCEP et l'EDTA pour libérer les cellules épithéliales des tissus de support sous-épithélial et une gradient de centrifugation de densité discontinueNt pour séparer les cellules épithéliales d'autres types de cellules. Les protéines de surface cellulaire ont été biotinylées et isolées à partir des cellules épithéliales intestinales, en utilisant des billes magnétiques liées à la streptavidine permettant des applications en aval dans FACS ou une analyse LC-MS / MS.

Introduction

Rhipicephalus microplus , la tache du bétail, est l'ectoparasite le plus important en termes d'impact économique sur l'industrie bovine des régions tropicales et sous-tropicales, car il vecteur de fièvre tectine bovine (babésiose), d'anaplasmose et de piroplasmose équine 1 , 2 , 3 , 4 . Les efforts ont été dédiés au contrôle des tiques du bétail, afin de diminuer l'effet néfaste, mais les méthodes conventionnelles telles que l'utilisation d'acaricides chimiques présentent des inconvénients implicites, comme la présence de résidus chimiques dans le lait et la viande, et l'augmentation de la prévalence des tiques résistant chimiquement 5 , 6 , 7 . Par conséquent, on a étudié le développement de méthodes alternatives de contrôle des tiques, telles que l'utilisation de bétail à résistance naturelle, le contrôle biologique (biopesticides) et le vaccinInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

Dans la recherche de protéines capables d'être utilisées comme vaccins candidats, la recherche actuelle est axée sur l'intestin de tique. La paroi du midgut est construite à partir d'une seule couche de cellules épithéliales reposant sur une fine lame basale, l'extérieur de la lame basale formant un réseau de muscles. Les observations de lumière et de microscope électronique indiquent que le intestin moyen se compose de trois types de cellules: réserve (indifférenciée), sécrétoire et digestive. Le nombre de types de cellules varie considérablement en fonction de la phase physiologique. Les cellules sécrétoires et digestives proviennent toutes deux des cellules de réserve 18 , 19 , 20 .

La construction de bibliothèques d'ADNcExaminer la composition de l'intestin de tache a conduit à l'identification de protéines antigéniques, telles que Bm86, en tant que vaccin potentiels candidats 2 , 3 , 4 . La glycoprotéine Bm86 est localisée à la surface des cellules intestinales de la tique et induit une réponse immunitaire protectrice contre la tumeur du bétail ( R. microplus ) chez les bovins vaccinés. Les IgG anti-Bm86 produites par l'hôte immunisé sont ingérées par la tique, reconnaissent cet antigène à la surface des cellules intestinales de tiques et perturbent ensuite la fonction et l'intégrité des tissus intestinaux. Les vaccins basés sur les antigènes Bm86 ont montré un contrôle efficace de R. microplus et de Rhipicephalus annulatus, en réduisant le nombre, le poids et la capacité de reproduction des femelles engorgantes, entraînant une infestation larvaire réduite dans les générations de tiques subséquentes 4 . Cependant, les vaccins basés sur Bm86 ne sont pas efficaces contre toutes les étapes de la tique et ontA démontré une efficacité insatisfaisante contre certaines souches géographiques de R. microplus , par conséquent, les industries du bœuf et des produits laitiers ont mal adopté ces vaccins 2 , 4 .

La capacité d'isoler les cellules épithéliales de l'intestin grêle est une innovation importante qui permettrait à la progression de la recherche de déterminer la composition de la membrane protéique, y compris la morphologie et la physiologie dans différentes conditions environnementales. La méthode décrite ici utilise l'agent de chélation de l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) et l'agent réducteur tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) pour libérer l'épithélium à partir de ses tissus de support sous-épithélial 10 . L'épithélium est récupéré suite à une rupture mécanique des tissus par tremblement, puis centrifugation en gradient discontinu à Percoll. Cet article décrit une technique réalisable et novatrice pour l'isolement de l'épiCellules cellulaires. Les protéines de surface cellulaire biotinylées, isolées de la surface de ces cellules épithéliales, peuvent ensuite être analysées dans des applications en aval telles que l'analyse FACS et / ou LC-MS / MS.

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Protocol

1. Dissection de l'épithélium intestinal de R. microplus

  1. Recueillir des tiques semi-engorgées de bovins le jour de l'expérience. Dissectez les tiques dans les 24 h après le retrait de l'hôte.
  2. Adhérer une bande de ruban adhésif au fond de la boîte à pétri 92 mm x 16 mm. Ajouter une goutte de super colle sur la bande. Placez la tique, côté ventral vers le bas sur la super-colle, laissez sécher pendant 2 min.
  3. Verser 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la boîte de Petri, ou jusqu'à ce que la tique soit complètement submergée.
  4. Utilisant un scalpel de taille 11, couper du haut des yeux aux feston, des deux côtés de la tique.
  5. À l'aide de pinces stériles, enlever complètement le scutum et alloscutum , pour exposer les organes internes.
  6. Retirez les organes fin de fil blanc (trachée) et d'autres membranes pour éviter toute contamination.
  7. Retirer l'intestin à l'aide d'une pince, en pinçant la région supérieure et en tirant de lacarcasse. Enlevez tous les tissus intestinaux restants, en veillant à ce qu'aucun autre tissu n'a été disséqué.
  8. Entreposer l'intestin dans la solution de sel équilibrée Hank (HBSS) glacée sans chlorure de calcium et sulfate de magnésium avec un cocktail d'inhibiteur de protéinase (PIC). Glissez les grognements dans de la glace sèche et rangez-les à -20 ° C.
    Remarque: Pour faciliter la dissection intestinale et les détails des organes internes de la tique, reportez-vous au chapitre 3.1 de D. Sonenshine, «Biologie des tiques» 19 .

2. Dissociation des cellules épithéliales

  1. Verser l'intestin disséqué sur une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube de 50 ml.
  2. Rincez les tissus intestinaux avec 50 ml d'HBSS glacé avec PIC jusqu'à ce que la solution soit claire et que les tripes prennent un aspect blanc / clair.
  3. Re-suspendre les tripes dans 30 ml d'HBSS glacé avec PIC, mélanger doucement et centrifuger à 500 xg à 4 ° C pendant 10 minutes pour granuler l'intestin. Retirez le surnageant et répétez le processus de lavage trois fois.
  4. Filtrer la suspension à travers une crépine de cellule de 250 μm, faire tourbillonner l'écoulement et filtrer à travers une crépine de cellule de 70 μm en recueillant le passage restant.
  5. Centrifuger la suspension à 500 xg à 4 ° C pendant 20 min pour granuler les cellules individuelles.

3. Isolation des cellules épithéliales simples en utilisant un gradient de centrifugation de densité

  1. Préparer un gradient de centrifugation de densité ( p . Ex. , Percoll) en filtrant à travers un papier pré-filtre AP15. Préparez 40% et un Percoll de 20% dans mqH 2 0 (v / v) et refroidissez à 4 ° C pendant 1 h avant de superposer le gradient.
  2. Utilisation d'un péristaltiquePompe réglée à la vitesse la plus basse, couche 3 mL de gradient de centrifugation de densité de 40% dans un tube à ultracentrifugation de 16 mL, ce qui lui permet de se déposer sur de la glace pendant 15 min. La vitesse de la pompe devrait conduire à un débit <1 mL par minute.
  3. En inclinant le tube à un angle de 45 °, utilisez la pompe péristaltique pour former un gradient de centrifugation de densité de 20% sur la couche de 40%. La vitesse de la pompe devrait conduire à un débit <1 mL par minute. Laisser reposer les couches sur de la glace pendant 15 min.
  4. Utiliser la pompe péristaltique à un débit de 1 mL par minute jusqu'à la couche 3 ml de milieu DMEM contenant des cellules intestinales de tiques sur le gradient de centrifugation de densité de 20 à 40%.
  5. Programmer la centrifugeuse pour une accélération maximale et une décélération minimale. Centrifuger à 600 xg pendant 10 min. Recueillir des interphases entre le DMEM: 20% de gradient de centrifugation de densité et les gradients de centrifugation à 20%: 40% pour isoler les cellules individuelles épithéliales. Conserver les interphases recueillies à 4 ° C pour des analyses ultérieures.

4. Évaluation de l'isolement cellulaire

  1. Hemacytometer
    1. Nettoyer l'hématomètre glisser avec de l'alcool.
    2. .Re-suspendre les cellules en faisant pipeter doucement les cellules vers le haut et vers le bas. Pipettez 100 μL de suspension cellulaire et placez-les dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
    3. Ajouter 400 μL de 0,4% de bleu trypan. Mélangez doucement en faisant glisser le tube.
    4. Pipeter 100 μL de la suspension cellulaire traitée par Trypan Blue pour remplir lentement les deux chambres de l'hémocytomètre.
    5. Placez l'hémocytomètre sous un microscope optique, en mettant l'accent sur les lignes de grille de l'hémocytomètre avec un objectif 10X.
    6. À l'aide d'un compteur de pointage manuel, comptez les cellules vivantes non colorées dans un ensemble de 16 carrés. Dans le même carré, comptez les cellules mortes bleues. Continuez à compter jusqu'à ce que quatre jeux de 16 carrés soient comptés.
    7. Calculez les cellules totales par ml en utilisant la formule:
      47eq1.jpg "/>
    8. Calculez le pourcentage de viabilité cellulaire en utilisant la formule:
      L'équation 2
  2. Visualisation d'isolement cellulaire
    1. Diluer 1 μL des cellules isolées dans 9 μL de HBSS dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Enlevez délicatement le tube de microcentrifugeuse pour le mélanger.
    2. Pipeter 5 μL de cellules isolées dans HBSS au milieu d'une glissière en verre. Appliquer trois gouttes de milieu de montage avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
    3. Incuber le coulisseau à température ambiante pendant 5 min. Placez soigneusement un couvercle sur la préparation, évitez les bulles d'air.
    4. Visualiser les cellules colorées avec DAPI à l'excitation 360 nm et l'émission à 460 nm sous un microscope fluorescent.

5. Biotinylation de la protéine de surface cellulaire

  1. Biotinylate 100 μL de cellules épithéliales à une seule cellule en utilisant une conjugaison de biotine (type A)Kit, à un rapport molaire de la protéine de surface 1: 1 pour conjuguer, selon les instructions du fabricant
  2. Pour la lyse cellulaire, ajouter 100 μL de PBS, 1% de Triton X-100, 10% de glycérol, 100 uM de glutathion oxydé et PIC aux cellules biotinylées. Incuber sur de la glace pendant 1 h avec un mélange doux toutes les 10 min.
  3. Centrifuger les cellules biotinylées à 20 000 xg à 4 ° C pendant 20 minutes pour granuler la matière insoluble Recueillir le surnageant contenant des protéines membranaires cytoplasmiques et biotinylées.
  4. Déterminer la concentration de protéines en utilisant le dosage de Bradford.

6. Isolation des protéines de surface biotinylées

  1. Ajouter 50 μL de Streptavidin Magnetic Beads dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
  2. Placez le tube dans un support magnétique, en recueillant les perles contre le côté du tube. Retirer et jeter le surnageant.
  3. Ajouter 1000 μL de TBS, 0,1% Tween-20 au tube. Mélanger doucement et collecter les perles avec le stan magnétiqueré. Retirer et jeter le surnageant.
  4. Combiner 40 μg de protéines de surface cellulaire biotinylées, dilué à 300 μL dans 1x PBS avec des billes magnétiques lavées. Incuber pendant 2 h à température ambiante avec agitation.
  5. Recueillir les perles avec un support magnétique, retirer et jeter le surnageant.
  6. Ajouter 300 μL de TBS, 0,1% Tween-20 au tube, mélanger doucement pour ré-suspendre les perles. Recueillir des perles, enlever et jeter le surnageant. Répétez cette étape de lavage deux fois.
  7. Ajouter 100 μL de la glycine 0,1 M pH 2,0 aux perles magnétiques et incuber à température ambiante pendant 5 min. Recueillir des perles et éliminer le surnageant contenant des protéines de surface biotinylées éluées.
  8. Visualiser les protéines de surface isolées sur un gel SDS-PAGE Tris-MOPS à 4-20%.

7. Évaluation de la protéine de surface biotinylée

  1. Dot Blot
    1. Couper une bande de nitrocellulose de 7 cm x 3 cm.
    2. Appliquer 10 μg totauxT contenu (de 1.8 ci-dessus), et 10 μg de protéine de surface biotinylée à la membrane. Laisser sécher pendant 15 minutes à température ambiante.
    3. Transférer dans un récipient et immerger dans 100 ml de tampon de blocage. Incuber à température ambiante avec agitation pendant une heure. Supprimer le tampon de blocage.
    4. Laver la membrane de nitrocellulose dans 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 pendant 5 minutes sous agitation. Déposer le tampon de lavage et répéter les lavages trois fois.
    5. Incuber dans 1/5000 Streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) dans 100 μL de PBS, 0,05% de Tween-20 pendant 2 h avec agitation à température ambiante et jeter toute solution restante.
    6. Lavez la membrane de nitrocellulose dans 100 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 pendant 5 min avec agitation. Jeter le tampon de lavage et répéter le lavage trois fois.
    7. Pour la détection, dissoudre 1 comprimé de 4-chloro-1-napthol dans 10 ml de methanol glacé. Ajouter 4 mL de stock de méthanol à 20 mL de TBS. Ajouter 10 μL de peroxyde d'hydrogène 30% frais et immediaAppliquer à la membrane de nitrocellulose.
    8. Incuber avec agitation à température ambiante jusqu'à ce que le substrat produise un produit final bleu insoluble. Cela peut prendre entre 2-15 min.
    9. Déconner la solution de détection et laver la membrane trois fois dans 100 μL de mqH 2 O.
  2. Dosage ELISA
    1. Diluer 200 ng de chaque échantillon avec 400 μL de tampon de revêtement Carbonate 100 mM et 2 couches de la première rangée (A #) de la plaque ELISA (puits à fond plat)
    2. Ajouter 100 μL de tampon de revêtement de carbonate 100 mM à tous les autres puits correspondants en rangées (BH).
    3. Préparez les dilutions en série de chaque échantillon en pipetant 100 μL de chaque puits dans la rangée A et en transférant dans la rangée B. Mélanger doucement en pipetant et éviter de produire des bulles. Répétez les dilutions dans chaque rangée, rejetant les 100 μL finaux de chaque puits dans la rangée H.
    4. Couvrir la plaque avec du parafilm et incuber à 4 ° C pendant la nuit.
    5. Laver le platE avec 200 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 par puits trois fois.
    6. Ajouter 200 μL de tampon de blocage sur les puits revêtus, couvrir avec Parafilm et incuber à 4 ° C pendant la nuit.
    7. Diluer 1/15 000 Streptavidine-HRP dans un tampon de blocage et ajouter 100 μL à chaque puits de la plaque. Couvrir avec du parafilm et incuber à 4 ° C pendant la nuit.
    8. Laver la plaque dans 200 μl de PBS, 0,05% de Tween-20 par puits cinq fois.
    9. Pour détecter, ajouter 100 μL de réactif TMB par puits. Après un développement de couleur suffisant, habituellement entre 10-15 min, ajoutez 100 μl d'acide phosphorique 1 M pour arrêter la réaction.
    10. Lisez l'absorbance de chaque puits à λ = 450nm.

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Representative Results

Les cellules épithéliales ont été isolées des tissus intestinaux de R. microplus selon le schéma présenté dans la figure 1 . L'imagerie microscopique de fluorescence représentative des cellules épithéliales intestinales préparées à l'aide de ce protocole est illustrée à la Figure 2A Et 2B. Comme l'isolement cellulaire est effectué sur le R. microplus semi-engorgé , les cellules apparaissent comme une morphologie de surface singulière, sphérique et lisse et une taille constante dans tout l'échantillon. Les différences dans la taille et le type de populations de cellules intestinales sont plus évidentes une fois que la tige se transforme en adultes complètement engorgés.

La coloration fluorescente du noyau de cellules épithéliales isolées avec DAPI aide à visualiser les cellules. Les isolats pauvres sont visualisés pour contenir une dissociation incomplète de l'épithèteDes cellules d'élil avec des populations cellulaires variables identifiées à travers différentes tailles de cellules et morphologies ( Figure 2C et 2D )

En utilisant ce protocole, environ 1,2 x 10 7 cellules par / mL à partir de 50 dissections intestinales, avec 75-80% de viabilité ont été isolées avec succès de R. microplus tiques intestinales. La contamination croisée des protéines hôtes ( Figure 3A ) peut être minimisée en rinçant adéquatement les tripes jusqu'à ce qu'ils aient une apparence blanche qui aboutirait à un gradient Percoll blanc / clair ( Figure 3B ).

Les protéines liées à la surface ont été isolées par la biotinylation des protéines liées à la surface, la destruction des membranes cellulaires et la purification des protéines de surface biotinylées avec des billes magnétiques de streptavidine. Au total, 20 à 24 pg de biotine purifiéeLes protéines superficielles de la surface peuvent être isolées pour les applications en aval à partir d'une dissection initiale de tripes de tiques 50x utilisant ce protocole. La comparaison des protéines par SDS-PAGE ( Figure 4A ), la tache d'argent ( Figure 4B ), la tache de point ( Figure 5 ) et ELISA ( Figure 6 ) indique que la méthodologie décrite a purifié avec succès des protéines de surface biotinylées à partir de cellules épithéliales isolées de la tique R. microplus intestin.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique pour isoler les protéines biotinylées présentes dans la surface des cellules de microrgium R. microplus . ClCliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Visualisation du microscope à fluorescence (100x) des cellules épithéliales de R. microplus de l' intestin moyen colorées au DAPI. Le logiciel a été utilisé pour effectuer la superposition de fluorescence. A & B) Représente les cellules épithéliales isolées avec succès à partir du microrgent R. microplus . C / D) Cellules épithéliales isolées de l'intestin de R. microplus contaminées par des tissus de tiques plus larges.

figure 3
Figure 3 : gradient Percoll contenant du DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Les couches cellulaires épithéliales ont été formées entre le DMEM: 20% PErcoll et le Percoll de 20: 40%. ( A ) Effectuez la dissection intestinale sans l'étape de lavage adéquate. ( B ) Effectuez une dissection intestinale avec une étape de lavage adéquate. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les séparations électrophorétiques des protéines de surface biotinylées fonctionnent sur du gel Tris-MOPS à 4-20%, à 140 V pendant 55 minutes avec 10 μg d'échantillon utilisé. (L) PageRuler échelle de protéines Prestained (1) non marqué R. microplus échantillon de boyau (2) les protéines biotinylées extrait à partir de l' ensemble R. microplus intestin comme à l' étape 6. (3) Les protéines provenant des cellules épithéliales extraites de l' intestin non marqué R. microplus (4 ) Des protéines biotinylées extraites de R. microplusCellules épithéliales selon l'étape 6. ( A ) SDS-PAGE colorées par colorant Comassie Blue ( B ) Silver.

Figure 5
Figure 5 : Analyse du point de transfert. Streptavidine-HRP conjugué dilué 1 / 5.000. ( A ) Au total, 10 μg d'extrait de protéines intestinales crues ( B ) Des protéines de surface biotinylées extraites de cellules épithéliales purifiées (10 μg).

Figure 6
Figure 6 : Évaluation de la viabilité des protéines de surface biotinylées en utilisant ELISA. L'ELISA des protéines de surface a été développé par un anticorps conjugué Strep-HRP dilué 1/15 000 contre différentes concentrations de tic biotinyléK protéines intestinales (de 0,7 ng à 100 ng). Les protéines intestinales de tiques non étiquetées et l'albumine de sérum bovin (BSA) ont été utilisées comme témoin négatif de l'ELISA. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les infestations de tiques de bétail constituent un problème majeur pour l'industrie bovine dans les régions tropicales et subtropicales du monde, avec la méthode de contrôle la plus commune dépend de l'utilisation d'acaricides 1 , 4 . Bm86 a été précédemment identifié dans la surface épithéliale intestinale comme antigène protecteur contre l'infestation par R. microplus 10 , avec un succès limité en tant que stratégie de vaccin due à la variation de séquence géographique Bm86 et à l'augmentation régulière 4 .

Les publications antérieures centrées sur les méthodologies d'isolement épithélial étaient principalement axées sur les espèces de vertébrés ou d'insectes 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Par exemple, le fractionnement précoce tente d'isoler l'intestin moyenEn utilisant des techniques de mammifères, a constaté que la même méthodologie ne pouvait pas être appliquée aux insectes en raison de la structure et des organisations de différentes cellules 12 . En outre, les techniques de mammifères reposent sur l'utilisation de la dipase ou de la collagénase, pour digérer enzymatiquement les protéines de jonction cellule-cellule 9 , 13 . La diphase et la collagénase affectent considérablement les protéines liées à la surface cellulaire et, par conséquent, les techniques dépendantes de leur utilisation ne conviennent pas aux études sur les protéines de surface cellulaire 15 . Les isolats de cellules de l'intestin moyen d'insectes se concentrent actuellement sur deux techniques. Le premier utilise une rupture mécanique du ventre moyen par ultrasons, puis une séparation sur un gradient de saccharose linéaire continu 8 , 11 , 12 , 14 . Cette technique mécanique produit des échantillons presque exempts de contaminants,Ver produit un faible rendement des microvillarmembranes 14 . La deuxième technique repose sur une rupture des membranes par Tris pour libérer des membranes microvillonnaires 8 .

La technique décrite dans cet article permet l'isolement des cellules épithéliales, la biotinylation des protéines de surface et leur isolement 16 , ce qui permet d'approfondir les études par des applications en aval telles que la spectrométrie de masse ou FACS. La méthode décrite ici utilise l'agent chélatant EDTA et l'agent réducteur TCEP. EDTA fonctionne pour séquestrer les ions calcium, inhiber les cadhérines, briser les liaisons cellule-cellule médiées par la cadhérine, tandis que le TCEP réduit les liaisons disulfure qui confèrent une viscosité à la matrice peritrophique du mucus riche en glycan qui sépare la lumière intestinale de l'épithélium. L'épithélium est récupéré suite à une rupture mécanique des tissus par agitation, puis par centrifugation en gradient discontinu dans la densitéY gradient de centrifugation. Les cellules épithéliales sont isolées entre le DMEM: 20% de gradient de centrifugation de densité et 20%: couches de gradient de centrifugation à densité de 40%.

L'utilisation d'une température plus élevée pendant la dissociation des cellules épithéliales entraînera la dissociation des tissus importants de l'intestin, ce qui entraînera l'absence d'isolement des cellules épithéliales. Veiller à ce que la dissociation des cellules épithéliales soit menée immédiatement après la dissection de la tique; L'utilisation de tampons glacés et l'évitement des vitesses de centrifugation élevées sont essentielles pour conserver des cellules vivantes viables. Malgré cela, le décalage de cellules plus grandes à partir de la lame basale peut provoquer une certaine contamination. En outre, l'épithélium de la tique de l'intestin moyen dépend de la durée du dernier repas de sang 18 , 19 , 20 .

En tant que tel, ce protocole a été conçu et consulté sur R. microplus figure 1 ) sont de nature uniforme.

En conclusion, les méthodes utilisées dans cette étude ont isolé avec succès les cellules épithéliales de l'intestin entier de R. microplus . Des protéines de la surface des cellules épithéliales R. microplus ont été obtenues pour une analyse et des études supplémentaires. Enfin, le protocole développé a démontré le rendement potentiel des cellules épithéliales à partir de l'intestin de tiques et l'efficacité des protéines de surface biotinylées de la cellule. Le protocole développé peut être utilisé dans toutes les espèces de tiques d'importance économique dans le but d'enquêter sur les interactions tique: hôte en étudiant la protéine membranairePosition de l'intestin.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent remercier la Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australie) pour la fourniture des tiques Rhipicephalus microplus utilisées pour cette étude, et Lucas Karbanowicz pour l'assistance au tournage vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

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References

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