Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca - עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, W., Zhang, C., Sun, X. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (135), e56236, doi:10.3791/56236 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הפקת ATP על ידי זרחון חמצוני הוא התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה. במיטוכונדריה פרוקריוטים גבוה יותר גם להשתתף cytosolic Ca2 + אגירה, ייצור ATP ב מיטוכונדריאלי יכול להיות מתווכת על-ידי intramitochondrial חינם Ca2 + ריכוז. Ca2 + שמירה קיבולת יכול היה להיחשב ליכולת של המיטוכונדריה לשמור על הסידן המטריצה מיטוכונדריאלי. שהצטברו תאיים Ca2 + מוביל החדירות של קרום מיטוכונדריאלי הפנימי, כינה את הפתיחה של חדירות מיטוכונדריאלי המעבר נקבובית (mPTP), כשבסופו לדליפת של מולקולות עם מולקולרית משקל kDa פחות מ- 1.5. Ca2 +-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. כאן, אנו מתארים שני מבחני לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד. לאחר כמויות מסוימות של Ca2 + מתווספים, כל השלבים ניתן יהיה להשלים ביום אחד, שהוקלט על ידי קורא microplate. לפיכך, מבחני שני אלה פשוט ויעיל ניתן לאמץ להעריך Ca2 +-הקשורים פונקציות מיטוכונדריאלי.

Introduction

המיטוכונדריה הם האיברים הסלולר העיקרי לייצר כמעט 95% מ- ATP המשמש בתאים בתרבית של זרחון חמצוני. הוא דיווח כי הריכוז micromolar מוחרמת של Ca2 + על ידי המיטוכונדריה, הנוכחות של ADP, פוספט אורגניים ניתן להשתמש כדי phosphorylate ADP סינתזת ATP1. כאשר הריכוז של Ca cytosolic2 + עובר מעל לסף מסוים, המיטוכונדריה יכול ספיגת Ca2 + במהירות, בזרימת אותו לאט לאט. לפיכך, המיטוכונדריה מתפקדת יכול זרם מוגברת cytosolic Ca2 +. לא רלוונטי-ההשתתפות זרחון חמצוני, מיטוכונדריאלי Ca2 + גם לקחת חלק אותות cytosolic סידן ו להפעיל את מנגנון מיטוכונדריאלי אפופטוטיים להיפגע על ידי גרימת הפתח של mPTP הפנימי מיטוכונדריאלי ממברנה2. זה הוכרה נרחב חריג על ידי העלאת Ca תאיים2 + יכול לגרום נפיחות מסיבית מיטוכונדריאלי על-ידי פתיחת mPTP3. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי מאת לכימות על Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת ו Ca2 +-trigged מיטוכונדריאלי נפיחות.

Ca2 + שמירה התפוסה היא מידת היכולת של המיטוכונדריה ספיגת הסידן cytosolic. המיטוכונדריה ניתן מאגר הסידן חינם cytosolic, לווסת סידן תלוית תהליכים תאיים על ידי ספיגת הסידן בצורה של פוחת משקעים לא פעיל. Ca לקוי2 + שמירה קיבולת מתרחשת מתח תופעות הקשורות באנרגיה הגבלה,4,של מחלות ניווניות אפילו5. המיטוכונדריה מבודד או תאים digitonin permeabilized יכול לשמש כדי לזהות את Ca2 + השמירה קיבולת, ואת היכולת מוגברות לצבור Ca2 + על ידי המיטוכונדריה מבודד עם נוספים גלוטמט, בנויים לא מושפע על ידי בידוד מיטוכונדריאלי נוהל6. כמות titrated של digitonin צריך לשמש permeabilize של ממברנות פלזמה של סוגי תאים שונים. Hexapotassium מלח Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט, Ca2 +-אינדיקטור רגיש תא-impermeant אור-טמפרמנט גלוי, היה בשימוש נרחב7. Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט מחוון נמוך-זיקה ולא להשתמש בו כדי להראות כי תאיים חינם Ca2 + ריכוזים ימשיכו לעלות במהלך ממושך (5 דקות) stimulations8. שיטה זו היה פחות רגיש יותר הטכניקה מסנן רדיואקטיבי, אולם היה לפשוט מאוד. נוספים Ca2 + מעלה סידן ירוק פלורסצנטיות, Ca2 + תפיסה על ידי המיטוכונדריה ומחזירה את קרינה פלואורסצנטית בסיסית. תוספות רציפים של Ca2 + נעשו עד המיטוכונדריה נכשלה ספיגת extramitochondrial Ca2 + 9. קורא microplate קרינה פלואורסצנטית ניתן לדווח באופן רציף על ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ירוק.

לאחר צבירת2 + Ca, המיטוכונדריה depolarized שוחרר Ca2 + לתוך המדיום, החלה להתנפח. Ca2 +-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. מיקרוסקופ אלקטרוני ו של הפחתת ספיגת האור-540 nm יכול לשמש כדי למדוד את Ca2 +-עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות10,11. המיטוכונדריה נפח יכול להיקבע באופן ישיר על ידי קדימה זווית פיזור אור12, איפה ירידות ספיגת לשקף פסיבית נפיחות של המטריקס מיטוכונדריאלי.

כאן, אנחנו להמחיש את המתודולוגיה לבחון על Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מתאי SH-SY5Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד של המיטוכונדריה

הערה: כל פתרונות וציוד צריך להיות precooled 0 - 4 מעלות צלזיוס, נשמרים על קרח.

  1. זרעי בערך 3 x 106 SH-SY5Y תאים לכל מאכל תרבות תא 10 ס מ. התרבות התאים Dulbecco גבוהה-גלוקוז המתואמת של הנשר בינוני עם סרום שור עוברית 10%, פניצילין (100 U/mL)-סטרפטומיצין (100 µg/mL). לשמור על 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור המכילה 5% CO2 בן לילה.
    הערה: לפחות 1-2 x 10 תאים7 SH-SY5Y יש צורך בכל assay בידוד.
  2. להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר קרח בצלחת תרבות תא 10 ס מ 3 פעמים.
  3. הוסף חדש 1 מ"ל של PBS קר קרח לתוך צלחת תרבות תא 10 ס מ, לגרד את תאים חסיד לתוך צינור 1.5 mL החדש. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 10-4 מעלות צלזיוס.
  4. במהלך צנטריפוגה, להכין מאגר בידוד מיטוכונדריאלי 5 מ"ל (250 מ מ סוכרוז, 10 מ מ HEPES (חומצה ethanesulfonic-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine 4), 10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl2, 1 מ מ EDTA) בתוספת μL 50 מניות מעכבי פרוטאז פתרון (100 x ריכוז; 1 טבליה נטולת EDTA מומס µL 500 של ddH2O).
  5. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר. דגירה הצינור 1.5 mL על קרח למשך 30 דקות.
  6. Lyse התאים מושעה עם מהמגן זכוכית (15-25 משיכות) למעלה ולמטה באופן ידני על קרח.
    הערה: ודא כי קיימים אין בועות כאשר התאים הם הומוגני. לספור את התאים שלם ואת הגרעינים חשופות על ידי מיקרוסקופ מבחינה ויזואלית, לאשר את זה > 90% תא שבירה אירעה.
  7. להעביר את homogenate לתוך צינור 1.5 mL צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C לפנות את הפסולת (גרעינים, התאים שנותרו ללא פגע).
  8. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות 4 ° C.
  9. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש ו צנטריפוגה ב 14,000 x g למשך 15 דקות 4 ° C.
  10. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר.
  11. Centrifuge הפתרון למשך 15 דקות ב g 14,000 x 4 ° C, כדי לזרז את המיטוכונדריה.
  12. בגדר המיטוכונדריה וכתוצאה מכך חייב להיות כל הזמן על קרח, resuspended בתקשורת 50-100 μL אשלגן כלורי (125 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ K2HPO4, 1 מ MgCl2, 20 מ מ. HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, ו- 2 μM rotenone, pH 7.4) על פי האחסון גלולה לפני כל התחת אחד בשני.
  13. השתמש μL 5 של פתרון מיטוכונדריאלי כדי למדוד את ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי על ידי תקן assay BCA, מדידה OD562 באמצעות קורא13לצלחת.

2. קביעת מיטוכונדריאלי Ca2 + השמירה קיבולת

  1. להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי ולהוסיף Ca2 +-איגוד הפלורסנט ירוק ריכוז סופי של 0.5 μM לפני הניסוי.
  2. העברת 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) באשלגן כלורי המדיה המכילה 0.5 μM Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט לתוך כל צלחת 6-ובכן, ובכן.
  3. דגירה המיטוכונדריה ו- Ca2 +-איגוד הפלורסנט ירוקים בצלחת 6-ובכן בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור מקיף עבור aliquots μL להוסיף 4 1 מינימלית של 20 מ מ פתרון2 CaCl (20 מ מ CaCl2, 127 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2 20 מ מ HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, pH 7.4) כל צלחת 6-ובכן ובכן באמצעות האוטומטי לוותר על הגדרת להציג 200 nmol Ca מיטוכונדריאלי2 +/mg/חלבון.
  4. להשתמש ספקטרומטר פלורסצנטיות לעקוב אחר שינויים פלורסצנטיות כל 3 s למשך 2 דקות עם אורך גל עירור של 506 ננומטר, אורך גל של פליטה של 531 ננומטר. הצלחת מצויד רועד ב 600 סל ד 3 s בין קריאות נשלט על ידי תוכנה (איור 1).
  5. להוסיף על aliquot 4 μL נוספים של 20 מ מ CaCl2 פתרון טוב לכל ולעקוב אחר השינויים פלורסצנטיות כל 3 s עבור 2 דק. חזור על שלב זה עד זריחה עולה עם הזמן.
    הערה: המיטוכונדריה מאותגרים עם מוסף Ca2 + שצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ההקלטה מוגברת. עם פתיחת mPTP, זריחה עולה עם הזמן.
  6. לפרש את הסכום הכולל של Ca2 + להוסיף עד mPTP פותח לקיבולת Ca2 + השמירה.

3. קביעה של Ca 2 +-induced נפיחות מיטוכונדריאלי

  1. להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי לפני הניסוי.
    1. להעביר 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) בתקשורת אשלגן כלורי לתוך כל צלחת 6-טוב טוב.
  2. להוסיף 10 μL של 20 מ מ CaCl2 תמיסה מימית (500 nmol/mg מיטוכונדריאלי חלבון) לתוך חלבון מיטוכונדריאלי לעורר מיטוכונדריאלי נפיחות.
  3. שיא הירידה ספיגת-540 nm כל 3 s על קורא microplate נשלט על ידי תוכנה עבור 10 דקות (איור 2). השינויים פלורסצנטיות נגרמות על ידי זרם של מומסים בגבול על פני קרום פנימי מיטוכונדריאלי.
    הערה: ספיגת ירד ב- 540 nm מקביל המיטוכונדריה נפוחות. אם הקורא לא לצפות לירידה ספיגת, יותר זמן קריאה מרווח או זמן קריאה יכול להיות מאומץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות נציג של Ca2 + שמירה קיבולת:
התוצאות היו הביע כערכים זריחה. עם פולסים נוספת של Ca2 + (200 nmols/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת על ידי כפול מעל הבסיס עם פתיחת mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), מעכב של Ca2 +-induced mPTP הפתיחה, או atractyloside μM 1 (ATR), activator Ca2 +-induced mPTP הפתיחה, נוספו המיטוכונדריה מבודד. כמות סה כ הוסיף Ca2 + עד mPTP הפתיחה שמסומן על ידי עלייה כפול מעל ידי קרינה פלואורסצנטית בסיסית היה מתפרש כ- Ca2 + שמירה קיבולת. הנתונים שלנו הראו מיטוכונדריאלי Ca2 + השמירה הקיבולת בטיפול BKA היה גבוה בהרבה מאשר ב- ATR קבוצה. נתונים אלה אישר את המדידה מתאימים של מיטוכונדריאלי Ca2 + שמירה קיבולת (איור 3).

התוצאות נציג של Ca2 +-induced מיטוכונדריאלי נפיחות:
התוצאות היו המבוטא באחוזים לשינויים ספיגת-540 nm לעומת ספיגת הראשונית במהלך תקופה של 10 דקות לאחר התוספת של CaCl2. המופעלות על-ידי התוספת של Ca2 + (500 nmol/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ספיגת ירד למצלמות 540 nm המצוין של נפיחויות מיטוכונדריאלי. עם הטיפול BKA או ATR, עקומת כיול הראה ירידה קלה או חדה לעומת ספיגת הראשונית, המציין כי BKA יכול לעכב mPTP פתיחת בזמן ATR יכול להקל את mPTP פתיחה (איור 4).

Figure 1
איור 1: הגדרות התוכנה עבור מיטוכונדריאלי Ca2 + שמירה קיבולת assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הגדרות התוכנה עבור Ca מיטוכונדריאלי2 +-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: המדד של Ca2 + שמירה קיבולת. תוספת-מיטוכונדריאלי Ca2 + בתוך המיטוכונדריה מבודד נמדדה fluorometrically עם Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט בנוכחות μM 5 bongkrekate (BKA), μM 1 atractyloside (ATR) או בקרה הריק (קון). עקבות של Ca2 + שמירה על ידי המיטוכונדריה מבודד עם BKA, ATR קון נמדדו ב- 506 nm (לשעבר) ו 531 nm (Em) על קורא microplate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: המדד של Ca2 +-induced נפיחות מיטוכונדריאלי. Ca2 +-נפיחות מיטוכונדריאלי המושרה של SH-SY5Y בנוכחות 5 μM bongkrekate (BKA), μM 1 atractyloside (ATR) או בקרה הריק (קון) בא לידי ביטוי כמו עקומת כיול ירד אחוז של ספיגת הראשונית-540 nm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו המתואר פרוטוקול פשוטה ויעילה מיטוכונדריאלי Ca2 + שמירה קיבולת assay, Ca2 +-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות.

הבידוד מיטוכונדריאלי, ודא כי כל חומרי, צינורות הם על קרח, במיוחד כאשר homogenizing את התאים. 0.25% טריפסין-EDTA יכול לשמש גם כדי לנתק תאים מן המנה למשך 5 דקות ב 37 º C. לאחר 15-25 משיכות, יש צורך לבחון את קרום התא שלם תחת המיקרוסקופ ולהימנע הנזק של קרום המיטוכונדריה. עם זאת, המיטוכונדריה מבודד כי השגנו הם המיטוכונדריה גולמי, המיטוכונדריה מטוהרים ניתן לקבל באמצעות 1.0 M / 1.5 m סוכרוז מקוטע הדרגתי. המאפיינים הביולוגיים של המיטוכונדריה בתאים חיים דומים יותר האלה אין ויוו מאשר בתוך המיטוכונדריה מבודד בשל הריכוזים של הרכיבים בינוני המקיפים המיטוכונדריה. Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת או2 +Ca-מופעלות assay נפיחות מיטוכונדריאלי נקבע בתנאים אנרגיה. לקביעת המיטוכונדריה מתפקדת, ניתן להוסיף 5 מ מ succinate בשם דיאלקטריים הנשימה במקום גלוטמט, בנויים6.

Ca2 +-איגוד הפלורסנט ירוק (נקשר Ca2 + עם זיקה של 4.29 ± 0.67 מ מ), היא מתאימה יותר למדידת ריכוזי micromolar של Ca2 + מאשר צבעי זיקה גבוהה יותר כגון fura-2 7. לאחר התוספת של Ca2 +-איגוד הפלורסנט ירוק, הדגירה חייבת להיות פחות מ-240 ש תוספות רצופים של Ca2 + (שונים, מ 25-200 nmol) הוזרקו במרווחים 1-3 דקות. עקומות כיול הצג את ריכוזי Ca2 + להם המיטוכונדריה אין אפשרות לבודד, המציין את ספיגת מיטוכונדריאלי של פולסים של Ca2 +. אחרת, Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט שימש גם סידן איתות חקירות, כגון תאיים חינם Ca2 + ריכוז למדידה, Ca2 + זרם הבאים, שחרור, עירור multiphoton הדמיה של Ca2 + ברקמות החי.

לקביעת Ca2 + -induced הנפיחות מיטוכונדריאלי, נפיחות יכולה להיגרם גם עם התוספת של 200 מ"מ ATR ו CaCl2. כפקד, המיטוכונדריה יכול להיות מודגרות עם 1 מ מ CsA במשך 5 דקות לפני המדידה, אשר עכבות mPTP את הפתיחה. מחקרים קודמים הראו עקומות כיול של ספיגת כפונקציה של אחוז המיטוכונדריה נפוחות14. דווח כי 1 מ מ CsA, רותניום 0.1 מ מ אדום, ניתן להוסיף אמצעי שווה של המיטוכונדריה טריים (0.5 מ"ג/מ"ל) בהתגובה כאשר הנפיחות הושלמה. כי CsA, רותניום אדום יכול לעכב את mPTP פתיחת בתוך המיטוכונדריה הוסיף טרי, עקומות כיול מציינים המיטוכונדריה נפוחות והן נפוחות ללא המיטוכונדריה15. הפרוטוקול של נפיחות מיטוכונדריאלי על Ca2 + עומס הוא גם מדידה ישירה ויעילה של Ca2 +-induced mPTP הפתיחה.

הגילוי של תחבורה של Ca2 + על ידי המיטוכונדריה של יונקים ו חולייתנים הגבוהים אחרים לפני יותר מ-50 שנה, מאז הרבה מחקר על מנגנוני והפונקציות של סידן מיטוכונדריאלי בזרימת, זרם. מיטוכונדריאלי Ca2 + ספיגת המנגנונים להכיל את Ca2 + uniporter מיטוכונדריאלי, את מצב מהירה או RaM ו ה-קולטן (mRyR) ryanodine16. מבחני שהסברנו לעיל יכול להעריך Ca2 +-הקשורים פונקציה מיטוכונדריאלי בפשטות וביעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אקס השמש פיקח הניסויים. ויי לי לבצע את הניסויים. חן ג'אנג, אקס שמש כתבה בעיתון.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מענק של מדען מצטיין של שאנדונג (JQ201421), מענק NSFC (81371226).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC (The Global Bioresource Center) ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N Life Technologies c-3737 Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors Roche Molecular Biochemicals 4693116001
glass homogenizer Kimble Chase 9885303002
glutamate Sigma-Aldrich RES5063G-A7
malate Sigma-Aldrich 46940-U
rotenone Sigma-Aldrich R8875
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MgCl2 Sigma-Aldrich 00457
K2HPO4 Sigma-Aldrich V900050
KCl Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 Sigma-Aldrich V900266
Varioskan flash instruments Thermo Scientific IC100E
Bongkrekate Biovision 1820-100
atractyloside Sigma-Aldrich C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium Hyclone SH30022 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum Hyclone SV30087
penicillin Sigma-Aldrich P3032
streptomycin Invitrogen 11860-038
BCA assay kit Thermo Scientific NCI3225CH
PBS Hyclone SH30256.01
10 cm cell culture dish NEST 704001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239, (11), 3971-3980 (1964).
  2. Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28, (5-6), 285-296 (2000).
  3. Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
  4. Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60, (9), 575-590 (2008).
  5. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, (5), 335-344 (2009).
  6. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  7. Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162, (1-2), 149-152 (1993).
  8. Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89, (1), 91-100 (1999).
  9. Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38, (1), 43-47 (2006).
  10. Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279, (33), 34682-34690 (2004).
  11. Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426, (2), 297-315 (2000).
  12. Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11, (7), 822-831 (1990).
  13. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175, (1), 231-237 (1988).
  14. Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187, (2), 255-259 (1994).
  15. Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274, (44), 31734-31739 (1999).
  16. Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787, (11), 1291-1308 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics