खल्क अवरोधक PD0325901 और विटामिन सी का उपयोग कर माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के जीनोमिक Hypomethylation बनाए रखने के लिए एक वैकल्पिक संस्कृति विधि

Biochemistry

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Summary

हम विस्तार में वर्णित दो रासायनिक आधारित प्रोटोकॉल संवर्धन माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए । इस नई विधि Tet मध्यस्थता ऑक्सीकरण को बढ़ावा देने के synergistic तंत्र का उपयोग करता है (विटामिन सी द्वारा) और 5 का दमन डी नोवो संश्लेषण-methylcytosine (PD0325901 द्वारा) डीएनए hypomethylation और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के pluripotency बनाए रखने के लिए.

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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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Abstract

भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं को तीन रोगाणु परतों (अन्तः, मध्य त्वक स्तर, या बाह्य त्वक स्तर) में से किसी में अंतर करने की क्षमता है, और अपक्षयी दवा के लिए कई वंश उत्पंन कर सकते हैं । ES सेल संस्कृति इन विट्रो में लंबे समय से व्यापक चिंताओं का विषय रहा है । क्लासिकल, माउस ES कोशिकाओं सीरम और ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) में बनाए रखा-मध्यम युक्त हैं । हालांकि, सीरम/लिफ स्थितियों के अंतर्गत, कक्ष आकृति विज्ञान और pluripotency-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में विविधता दिखाते हैं, और ज्यादातर एक metastable स्थिति में हैं । इसके अलावा, संस्कृत ES कोशिकाओं वैश्विक hypermethylation प्रदर्शन, लेकिन इनर सेल मास (आईसीएम) और मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) के भोले ES कोशिकाओं वैश्विक hypomethylation के एक राज्य में हैं । आईसीएम और PGCs के hypomethylated राज्य अपने pluripotency के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं. माउस ES सेल कल्चर के तरीकों में सुधार करने के लिए, हमने हाल ही में डीएनए hypomethylated और pluripotent राज्य को बनाए रखने के लिए दो छोटे-अणु यौगिकों के चुनिंदा संयुक्त उपयोग के आधार पर एक नई विधि विकसित की है । यहां, हम मौजूद है कि विटामिन सी के सह उपचार (कुलपति) और PD0325901 5 के बारे में ९०% मिटा सकते है-methylcytosine (5mC) माउस ES कोशिकाओं में 5 दिनों में । उत्पंन 5mC सामग्री PGCs में है कि तुलना में है । यंत्रवत जांच से पता चलता है कि PD0325901 अप-Dnmt3b (डी नोवो डीएनए methyltransferase) और Dnmt3l (cofactor की Dnmt3b) को दबाने के लिए Prdm14 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, de नोवो 5mC संश्लेषण को कम करके । कुलपति 5mC के रूपांतरण की सुविधा 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) catalyzed मुख्य रूप से Tet1 और Tet2 द्वारा, दोनों निष्क्रिय और सक्रिय डीएनए की भागीदारी का संकेत है । इसके अलावा, Vc/PD0325901 शर्तों के तहत, माउस ES कोशिकाओं सजातीय आकृति विज्ञान और pluripotent राज्य दिखाते हैं । सामूहिक रूप से, हम डीएनए hypomethylation और माउस ES कोशिकाओं में pluripotency के रखरखाव को प्राप्त करने के लिए एक उपंयास और रासायनिक सिनर्जी संस्कृति विधि का प्रस्ताव । छोटे अणु रासायनिक निर्भर विधि सीरम संस्कृति की प्रमुख कमियों पर काबू पा, और आगे नैदानिक अनुप्रयोगों और शोध के लिए सजातीय ES कोशिकाओं उत्पंन वादा रखती है ।

Introduction

ES कक्ष एक ब्लास्टोसिस्ट1के आईसीएम से उत्पंन होते हैं । कोशिकाओं को एक pluripotency राज्य में है और सभी दैहिक वंश और germline कोशिकाओं को2फार्म कर सकते हैं । ES कोशिकाओं की स्थापना इन विट्रो में विकास प्रक्रियाओं की जांच करने का अवसर प्रदान करता है और उनके pluripotency3के आधार पर अपक्षयी दवा के लिए चिकित्सा प्रासंगिकता की कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं ।

दो समूहों को लाभदायक १९८१ में माउस ES सेल लाइनों की स्थापना की और जब प्रारंभिक माउस भ्रूण से व्युत्पंन कोशिकाओं भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)-फीडर परत के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के साथ मध्यम से युक्त में संस्कृति थे1,4 . MEFs mitotically निष्क्रिय थे और पहले व्यंजन में पले थे संवर्धन ES कोशिकाओं से पहले । MEFs माउस ES सेल लगाव के लिए समर्थन प्रदान करते है और विकास कारकों का उत्पादन करने के लिए प्रचार को बढ़ावा देने और भेदभाव5दमन, जबकि FBS आवश्यक पौष्टिकता कारकों और सेल प्रसार के लिए हार्मोन प्रदान करता है । बाद के अध्ययनों से संकेत दिया कि लिफ फीडर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित आत्म-नवीकरण और माउस ES कोशिकाओं में pluripotency के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण cytokine था, और मध्यम में लिफ के अलावा फीडर कोशिकाओं के लिए विकल्प सकता है6। वर्तमान में, भक्षण पर FBS/लिफ माध्यम में माउस ES कोशिकाओं के बनाए रखने के मानक कई शोधकर्ताओं द्वारा अपनाया विधि अभी भी है । हालांकि, कुछ समस्याएं इस शास्त्रीय संस्कृति के दृष्टिकोण से उत्पंन होती हैं । सबसे पहले, फीडर कोशिकाओं अतिरिक्त और अनियंत्रित कारकों स्रावित और रोगजनक संदूषण7कारण हो सकता है । इस हस्तक्षेप से बचने के लिए, जिलेटिन के साथ व्यंजन की सतह कोटिंग और सीरम युक्त माध्यम में लिफ के अलावा फीडर परत कोशिकाओं के बिना माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं । साथ ही, माउस ES कोशिकाओं सीरम/लिफ शर्तों के तहत उगाया रूपात्मक विविधता कक्ष की आबादी में और यहां तक कि pluripotency से संबंधित कारकों की अभिव्यक्ति स्तर में8। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सीरम/लिफ शर्तों के तहत, pluripotency-संबंधित कोर प्रतिलेखन कारक (SOX2, Nanog, और OCT4 सहित) pluripotency और लिफ सिग्नलिंग के माध्यम से WNT को बनाए रख सकते हैं; हालांकि, विशेष रूप से, वे भी एक fibroblast वृद्धि कारक (FGF) को सक्रिय करने के लिए भिंनता8ट्रिगर संकेत । कारण कोर प्रतिलेखन कारकों के ambivalent दोहरी कार्रवाई के लिए, माउस ES सीरम वर्तमान विविधता में कल्चरित कोशिकाओं, दो विनिमेय आबादी से मिलकर, एक आईसीएम के समान है और एक और प्रधान epiblast राज्य8जैसी । इसके अलावा, सीरम में माउस ES कोशिकाओं अक्सर ग्लोबल hypermethylation9प्रदर्शन, जबकि आईसीएम और PGCs एक वैश्विक hypomethylated राज्य है, जो निकट उनके pluripotency9,10के साथ जुड़ा हुआ है में हैं ।

संवर्धन माउस ES कोशिकाओं के लिए नए तरीकों को विकसित करने के लिए काफी मांग है । कई सुधार प्रोटोकॉल २००३ के बाद से स्थापित किया गया है11 लेकिन वहां कुछ सीमाएं और कमियों7होना जारी है । २००८ के बाद से, दो छोटे अणु कळेनासे अवरोधकों के संयुक्त उपयोग, PD0325901 (mitogen के अवरोधक-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK)/extracellular-signal-regulated कळेनासे (ERK) (खल्क)) और CHIR99021 (ग्लाइकोजन सिंथेस के अवरोधक कळेनासे 3 (GSK3)), एन2बी27 माध्यम में लिफ के साथ और सीरम के बिना संवर्धन माउस ES कोशिकाओं12के लिए नए दृष्टिकोण खोला गया है । इस नए परिभाषित मध्यम दो अवरोधकों (2i) के उपयोग की विशेषता है । 2i/लिफ माध्यम में प्रसंस्कृत माउस ES कोशिकाओं सेल आबादी में अधिक सजातीय और pluripotency कारकों की अभिव्यक्ति कर रहे हैं । इसके अलावा, 2i/लिफ-cultureed माउस ES कोशिकाओं डीएनए hypomethylation विश्व स्तर पर है, जो आईसीएम की तरह कोशिकाओं को9,13के करीब है प्रदर्शन । फिर भी, 2i संस्कृति अपने नुकसान है । PD0325901 और CHIR99021 पानी में अघुलनशील है और आम तौर पर dimethyl sulfoxide (DMSO) में भंग कर रहे हैं-शेयर समाधान आधारित उन्हें संस्कृति माध्यम में जोड़ने के लिए. अध्ययनों से पता चला है कि लंबी अवधि के और DMSO के लिए कोशिकाओं की कम खुराक जोखिम cytotoxicity के लिए नेतृत्व कर सकते हैं14.

यहां, हम दो छोटे अणु यौगिकों का उपयोग किया और माउस ES कोशिकाओं की एक नई संस्कृति विधि विकसित की है । उपंयास संस्कृति विधि कुलपति और खल्क अवरोध करनेवाला PD0325901 को जोड़ती है डीएनए hypomethylation को बढ़ावा देने के लिए तेजी से और प्रभावी ढंग से PGC के एक तुलनीय स्तर पर, कुलपति के रूप में नामित/PD0325901 संवर्धन प्रोटोकॉल । Vc/PD0325901 में माउस ES कक्षों-जोड़ा गया सीरम युक्त मध्यम प्रदर्शन एकरूपता में आकृति विज्ञान और एक जमीन राज्य में निरंतर रहे हैं । 2i संस्कृति की तुलना में, माउस ईएस Vc/PD0325901 शर्तों के तहत संस्कृति डीएनए के तेजी से कैनेटीक्स प्रदर्शन और hypomethylation PGC के लिए तुलनीय स्तर तक पहुंच सकते हैं । इसके अलावा, एक एकल अवरोध करनेवाला का उपयोग (PD0325901) DMSO की तुलना में मध्यम में इनपुट राशि कम हो जाती है कि 2i में इस्तेमाल किया (PD0325901/CHIR99021) और कोशिकाओं को नुकसान कम कर देता है.

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Protocol

1. तैयारी

  1. १.० mm PD0325901 (खल्क अवरोधक) और ३.० mm CHIR99021 (GSK3 अवरोध करनेवाला) का समाधान तैयार करें ।
    1. PD0325901 के 2 मिलीग्राम वजन और एक एंबर कांच की शीशी में DMSO की ४.१५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. CHIR99021 के 2 मिलीग्राम वजन और एक एंबर कांच की शीशी में DMSO की १.४३ मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. पुनर्गठन के बाद, स्टोर aliquots (५० µ एल/२०० µ एल पीसीआर ट्यूबों में ट्यूब)-20 ° c और प्रकाश से सुरक्षित । उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर एक फ्रीजर और गल से जमे हुए शेयर युक्त ट्यूब निकालें ।
  2. कुलपति के ०.०१७६ जी एक केंद्रापसारक ट्यूब के 1 मिलीलीटर में वजन और यह बाँझ पानी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मिलीलीटर के साथ पुनर्गठन से पहले का उपयोग करने के लिए १०० मिमी ।
  3. निष्क्रिय FBS: 30 मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में FBS के ५०० मिलीलीटर की मशीन ।
  4. संवर्धन माउस ES कोशिकाओं के लिए बुनियादी माध्यम के ६०० मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. DMEM/उच्च ग्लूकोज मध्यम (५०० मिलीलीटर) की एक बोतल का उपयोग करें और ४० मिलीलीटर निकालें ।
    2. 20% निष्क्रिय FBS (१२० मिलीलीटर) के साथ DMEM/उच्च ग्लूकोज मध्यम के पूरक ४६० मिलीलीटर, १,००० यू/एमएल लिफ (६० µ एल के 107 यू/एमएल स्टॉक समाधान), ०.१ mm गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) (10 मिमी स्टॉक समाधान की 6 मिलीलीटर), 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट (6 मिलीलीटर की १०० mm स्टॉक समाधान) , 2 मिमी एल-glutamine (२०० मिमी स्टॉक समाधान की 6 मिलीलीटर), ०.१ मिमी β-mercaptoethanol (६०० µ एल १०० मिमी स्टॉक समाधान), और ३३ IU/एमएल पेनिसिलिन और ३३ µ g/एमएल streptomycin (2 मिलीलीटर के पेनिसिलिन-streptomycin मिश्रित समाधान (१०,००० IU/एमएल पेनिसिलिन और १०,००० µ g/एमएल streptomycin)) . सीरम माध्यम के रूप में मूल माध्यम को परिभाषित करें ।
    3. पिपेट ५० PD0325901 (१.० मिमी) और कुलपति (१०० मिमी) के शेयर समाधान के µ एल, क्रमशः, सीरम मध्यम के ५० मिलीलीटर में (अंतिम एकाग्रता: १.० µ एम PD0325901 और १०० µ एम कुलपति), और माध्यम के रूप में परिभाषित कुलपति/PD0325901 माध्यम ।
      नोट: वीसी की अस्थिरता के कारण प्रयोग से पहले वीसी/PD0325901 मीडियम फ्रेश तैयार कर लें ।
    4. एक पिपेट का प्रयोग, PD0325901 (१.० मिमी) और CHIR99021 (३.० मिमी) के शेयर समाधान के ५० µ एल हस्तांतरण, क्रमशः, सीरम मध्यम (अंतिम एकाग्रता: PD0325901 १.० µ एम और CHIR99021 ३.० µ मीटर) के ५० मिलीलीटर में, और 2i माध्यम के रूप में माध्यम को परिभाषित ।
  5. जिलेटिन कोटेड व्यंजन तैयार करें ।
    1. ०.१% जिलेटिन समाधान तैयार: एक टोपी के साथ एक गिलास रिएजेंट बोतल में ultrapure पानी की ३०० मिलीलीटर में जिलेटिन की ०.३ जी भंग और 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव में निष्फल । कमरे के तापमान पर बाँझ समाधान की दुकान ।
    2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ०.१% जिलेटिन समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ सेल संस्कृति व्यंजन (6 सेमी व्यास) गर्मी और फिर जिलेटिन महाप्राण । बर्तन को हवा में सुखाएं और 12 एच के अंदर इनका उपयोग करें ।
  6. तैयार करें 10 मिलीलीटर के माउस ES सेल ठंड मध्यम में एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब: ९०% FBS (9 मिलीलीटर) और 10% DMSO (1 मिलीलीटर) । 1 दिन के भीतर मध्यम का उपयोग करें ।
  7. एक फ्रीजिंग कंटेनर तैयार करें: फ्रीजिंग कंटेनर की फिलिंग लाइन में १००% isopropyl अल्कोहल जोड़ें, और पुराने isopropyl अल्कोहल को छोड़ें । हर पांचवे प्रयोग के बाद सीधे नए isopropyl अल्कोहल जोड़ें ।
  8. एंजाइमी पाचन बफर बनाएं: Tris पाउडर के १.२११४ ग्राम ultrapure पानी की १०० मिलीलीटर में १०० mM Tris समाधान तैयार करने के लिए और Tris समाधान में (के बारे में 12 मीटर) के लिए पीएच समायोजित करने के लिए ७.६ (के बारे में ०.६ मिलीलीटर केंद्रित hcl समाधान) जोड़ें ।
  9. रेडियो immunoprecipitation परख बफर (RIPA बफर) के ५० मिलीलीटर तैयार: 20 मिमी Tris, पीएच ७.४, 1 मिमी MgCl2, १५० मिमी NaCl, 20% ग्लिसरॉल, ०.५% NP40, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA. 1 मिमी डीटीटी, 1x छेड़ने अवरोधक कॉकटेल, और 1 मिमी PMSF से पहले का उपयोग करने के साथ पूरक । एक बार PMSF जोड़ा जाता है, 30 मिनट के भीतर बफर का उपयोग करें ।

2. जिलेटिन-लेपित व्यंजन पर माउस ES कोशिकाओं हो जाना

  1. पूर्व गर्म माउस ES कोशिकाओं (जंगली प्रकार, १२९ SvEv) संस्कृति मध्यम, trypsin, और फॉस्फेट बफर समाधान (पंजाब) में एक जल स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस ।
  2. कोशिकाओं बीतने । महाप्राण को डिश से मीडियम पूरी तरह से पिपेट और पंजाबियों के 2 एमएल के व्यंजन को कोशिकाओं से कुल्ला करने के लिए ।
    1. एक पिपेट के साथ पंजाबियों को निकालें और पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ फिर से कोशिकाओं को धो लें ।
    2. पंजाबियों निकालें और प्रत्येक डिश के लिए trypsin-EDTA (०.२५%) की ०.३ मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. trypsin के साथ पूरी डिश को जल्दी से ढक दें और फिर इसे तुरंत निकाल लें ।
    4. पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में पकवान रखो । बाहर मशीन से बर्तन ले लो और trypsin की कार्रवाई को समाप्त करने के लिए पूर्व गर्म सीरम माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. अलग कर देना ने सेल कालोनियों को एक पिपेट (5 एमएल पिपेट टिप) के साथ 10 बार रिसस्पेंड करके सिंगल सेल सस्पेंशन में किया है ।
  3. स्थानांतरण १५० µ एल के 2 मिलीलीटर सेल समाधान (के बारे में एक hemocytometer के साथ गिनती द्वारा १९०,००० कोशिकाओं) एक नया जिलेटिन में लेपित पकवान, और पूरक के साथ 3 नए सिरे से बनाया कुलपति/PD0325901 मध्यम प्रति 6 सेमी संस्कृति पकवान । संस्कृति 5% CO2के साथ एक ३७ ° c मशीन में कोशिकाओं ।
  4. हर 24 घंटे के दौरान मशीन, पुराने संस्कृति माध्यम को हटाने और कुलपति की अस्थिरता के कारण संस्कृति डिश में ताजा कुलपति/PD0325901-मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें । उंमीद 70-80% के बाद 2-3 दिन के प्रवाह ।
  5. 70-80% तक पहुंचने के बाद, यात्रा कोशिकाओं और संस्कृति के लिए उंहें जारी रखने के रूप में 2.2 कदम में वर्णित-2.4 ।

3. फ्रीज और गल माउस ES कोशिकाओं

  1. माउस ES कोशिकाओं फ्रीज ।
    1. चरण २.२ का पालन करके trypsin के साथ बर्तन से अलग कोशिकाओं ।
    2. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और 3 मिनट के लिए ८०० x g और कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक ।
    3. एक चोंच में धीरे supernatant डंप और नए सिरे से बनाया ठंड मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ सेल गोली reसस्पेंड । यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले इस चरण से पहले ठंड मध्यम 30 मिनट तैयार करें ।
    4. कोशिकाओं को जमने वाले मीडियम में एक से १.८ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पर 1 एमएल पिपेट के साथ ट्रांसफर करें और microcentrifuge ट्यूब को जमने वाले कंटेनर में लगाएं । isopropyl अल्कोहल को फ्रीजिंग कंटेनर की फिलिंग लाइन में डालें और प्रयोग करने से पहले इसे कमरे के तापमान पर रखें ।
    5. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर ठंड कंटेनरों छोड़ दें ।
    6. microcentrifuge ट्यूबों एक तरल नाइट्रोजन कंटेनर के लिए 2-3 साल के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: एक लंबे समय के लिए कोशिकाओं को ठंड के माध्यम में रखने के लिए और जल्दी से एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर DMSO की विषाक्तता के कारण कोशिकाओं को स्थानांतरित नहीं करते ।
  2. गल माउस ES कोशिकाओं ।
    1. एक ३७ ° c पानी स्नान में सीरम मध्यम के पूर्व गर्म ५० मिलीलीटर ।
    2. तरल नाइट्रोजन कंटेनर से एक कोशिका युक्त शीशी बाहर ले लो और एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में छाया हुआ शीशी विसर्जित कर दिया । इसे पानी में नहाने से गल जल्दी हिलाएं. कोशिकाओं को एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण । ट्यूब में पूर्व गर्म सीरम संस्कृति मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ठंड मध्यम पतला करने के लिए और फिर ८०० x g और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    3. supernatant निकालें और धीरे से एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर ताजा कुलपति/PD0325901 माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों reसस्पेंड ।
    4. 15 मिलीलीटर ट्यूब से कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक जिलेटिन-लेपित पकवान और संस्कृति कोशिकाओं के लिए 24 h. culture कक्षों फिर से चरण 2 में वर्णित के रूप में ।

4. कोशिकाओं से कुल प्रोटीन निकालें

  1. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ एकत्र कोशिकाओं कुल्ला और फिर 3 मिनट के लिए ८०० x g और कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक ।
  2. महाप्राण supernatant और सेल गोली अच्छी तरह से reसस्पेंड RIPA बफर के साथ डीटीटी के साथ पूरक, चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल, और PMSF द्वारा धीरे pipetting । RIPA बफर की मात्रा 5x के बारे में है कि सेल गोली की ।
    नोट: बर्फ पर सेल resuspension बाहर ले ।
  3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए RIPA बफर में कोशिकाओं रखें और 5 मिनट के लिए १३,००० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक ।
  4. supernatant एक नई ट्यूब और स्टोर aliquots पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण ।
  5. एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख किट के साथ प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण ।

5. कोशिकाओं से निकालें डीएनए और एंजाइमों का उपयोग कर एक एकल Nucleoside में डीएनए डाइजेस्ट

  1. कदम 3.1.1 और 3.1.2 में वर्णित के रूप में trypsin के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  2. एक जीनोमिक डीएनए शोधन किट के साथ डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन निर्माता के निर्देशों का पालन ।
  3. 1-एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों में निकाले डीएनए की दुकान । ultrapure पानी के केंद्रापसारक ट्यूब में १०० µ एल जोड़ें, और लगभग 15 बार pipetting द्वारा डीएनए भंग । एकाग्रता का निर्धारण और २६० एनएम और २८० एनएम15पर अवशोषक की माप द्वारा डीएनए की गुणवत्ता का मूल्यांकन । डीएनए एकाग्रता के बारे में है ५०० एनजी/µ एल
  4. एक ५० µ l समाधान प्रणाली में DNA के 5 µ g को पचा: १०० mm Tris के 5 µ l जोड़ें-एचसीएल सॉल्यूशन, पीएच ७.६ (अंतिम एकाग्रता: 10 मिमी), 2 यू बछड़ा आंत्र फॉस्फेट, 1 यू DNase, ०.००५ यू सर्प विष फोस्फोडाईस्टेरेज मैं, और डीएनए के 5 µ जी (measu के अनुसार जोड़ा मात्रा की गणना लाल डीएनए एकाग्रता, ~ 10 µ एल) एक केंद्रापसारक ट्यूब में और ultrapure पानी के साथ ५० µ एल के लिए समाधान की मात्रा में वृद्धि । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिश्रण गर्मी । १,००० जी और कमरे के तापमान पर पचा डीएनए समाधान के लिए 1 मिनट के लिए ट्यूबों के नीचे करने के लिए समाधान इकट्ठा ।
  5. अल्ट्रा छानने का ट्यूबों (एक अणु वजन cutoff: 3 केडीए) में केंद्रापसारक ट्यूबों से पचा डीएनए समाधान स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए १३,००० g और 4 ° c पर केंद्रापसारक पाचन एंजाइमों को दूर करने के लिए ।
  6. 5mC और 5hmC विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करें ।
    1. 5hmC विश्लेषण के लिए: प्लास्टिक ३६ µ एल फ़िल्टर समाधान के एक नए केंद्रापसारक ट्यूब (1 एमएल) और जोड़ने के 4 µ एल के 5 '-(hydroxymethyl-डी3)-2 '-deoxycytidine ([डी3]-5hmC) 3 एनएम के अंतिम एकाग्रता के साथ ।
    2. 5mC विश्लेषण के लिए: एक नया केंद्रापसारक ट्यूब में ultrapure पानी की १९६ µ एल जोड़ें और प्लास्टिक ट्यूब (५० गुना कमजोर पड़ने) के लिए फ़िल्टर समाधान के 4 µ एल, 5mC डीएनए में जीनोमिक के उच्च घनत्व के कारण । एक नए केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए पतला समाधान के ३६ µ एल स्थानांतरण और के 4 µ एल जोड़ने (5 '-(मिथाइल-डी3)-2 '-deoxycytidine ([डी3]-5mC) ५० एनएम के अंतिम एकाग्रता के साथ । का प्रयोग करें [डी3]-5hmC और [डी3]-5mC आंतरिक मानक के रूप में क्रमशः 5hmC और 5mC जांचना ।
  7. 4 ° c पर ट्यूबों और स्टोर को मापने के लिए नमूना समाधान स्थानांतरित करें । 5mC और 5hmC के साथ अल्ट्रा उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ विश्लेषण एकाधिक-प्रतिक्रिया निगरानी (UHPLC-ms/ms (MRM)) के रूप में एक पिछली रिपोर्ट में वर्णित15

6. विश्लेषण 5mC और 5hmC का उपयोग कर UHPLC-ms/15

  1. UHPLC-MS सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके 5mC और 5hmC का विश्लेषण करने के लिए विभिंन पैरामीटर्स सेट करें ।
    1. एक नई पद्धति स्थापित करना । सॉफ्टवेयर खोलें और क्लिक करें "फ़ाइल । नये | कृती ". "आप वर्तमान विधि के लिए परिवर्तन सहेजना चाहते हैं" सामग्री के साथ "विधि संपादक" के संदेश बॉक्स को प्रदर्शित करें और "नहीं" क्लिक ।
    2. नमूना के मापदंडों का निर्माण । क्लिक करें "नमूना । सेटअप । इंजेक्शन ". "मानक इंजेक्शन" और इनपुट "5 µ इंजेक्शन मात्रा में l" का चयन करें.
    3. UHPLC में पंप के मापदंडों का निर्माण ।
      1. क्लिक करें "BinPump2 | सेटअप "पंप के मापदंडों का निर्माण करने के लिए । सेट अप "प्रवाह" पर "०.२५ एमएल/मिन" और "बंद करो समय" पर "15 मिनट" ।
      2. सेट अप "विलायक बी पर 5%" और "दबाव सीमा" पर "मैक्स ६०० बार" ।
      3. क्लिक करें "BinPump2 | समय सारिणी "5mC विश्लेषण के लिए isocratic रेफरेंस पैरामीटर्स का निर्माण करना । एक पंक्ति जोड़ने के लिए "पीछे जोड़ें" क्लिक करें । "समय" और "५.०" पर "B%" पर इनपुट "०.००" । नई पंक्ति जोड़ने के लिए और एक बार "पीछे जोड़ें" क्लिक करें । "समय" और "५.०" पर "B%" पर इनपुट "१५.००" ।
      4. क्लिक करें "BinPump2 | 5hmC विश्लेषण के लिए ग्रेडिएंट रेफरेंस पैरामीटर्स बनाने के लिए समय सारिणी "। पंक्ति जोड़ने के लिए "पीछे जोड़ें" क्लिक करें । इनपुट ०.०० समय में और ५.० पर "B%" । नई पंक्ति जोड़ने के लिए और एक बार "पीछे जोड़ें" क्लिक करें । "समय" और "५.०" पर "B%" पर इनपुट "३.००" । 6 पंक्तियों को जोड़ने के लिए 6 बार किसी अंय के लिए "पीछे जोड़ें" क्लिक करें । "समय" और "१५.०" पर "b%", "६.००" पर "समय" और "१५.०" पर "b%", "६.०१" पर "समय" और "१००" पर "b%" पर इनपुट "३.०१" १०.०० "समय" और "१००.०" पर "b%", "१०.०१" पर "समय" और "५.०" पर "b%", "१५.००" पर "समय" और "५.०" पर "b%" अनुक्रम में ।
        नोट: 5mC और 5hmC के विश्लेषण को व्यक्तिगत रूप से UHPLC के विभिंन पृथक्करण शर्तों के कारण करते हैं ।
    4. UHPLC में स्तंभ डिब्बे (टीसीसी) के तापमान के मापदंडों का निर्माण ।
      क्लिक करें "टीसीसी | सेटअप । तापमान (बाएँ) "और इनपुट" 30 डिग्री सेल्सियस ".
    5. QQQ के मापदंडों की स्थापना-ms/
      1. क्लिक करें "MS QQQ | बंद करो समय । कोई सीमा नहीं/पंप के रूप में "," आयन स्रोत । ईएसआई "," समय फ़िल्टरिंग । पीक चौड़ाई: ०.०७ मिनट "। सेट अप "समय क्षेत्रों: प्रारंभ समय: 0"; "स्कैन प्रकार: MRM"; "Div मान: करने के लिए एमएस"; "डेल्टा EMV (+): २००" और "डेल्टा EMV (-): 0" ।
      2. 5mC, डी3-5mC, dC, 5hmC, और d3-5hmC के संक्रमणों की निगरानी के मापदंडों का निर्माण करें
        1. क्लिक करें "MS QQQ | अर्ज | स्कैन सेगमेंट: निवास: ९० "; "फ़्रेग्मेंटर: ९०"; "टकराव ऊर्जा: 5"; "सेल त्वरक वोल्टेज: 4" और "ध्रुवीकरण: सकारात्मक" ।
        2. इनपुट "5mC" पर "यौगिक नाम", "२४२" पर "प्रणेता आयन", "१२६" पर "उत्पाद आयन" 5mC विश्लेषण के लिए. सही बटन पर क्लिक करें और एक नई पंक्ति जोड़ने के लिए "पंक्ति जोड़ें" चुनें । इनपुट "d3-5mC" पर "यौगिक नाम", "२४५" पर "प्रणेता आयन", "१२९" पर "उत्पाद आयन" d3-5mC विश्लेषण के लिए.
        3. एक ही मोड का उपयोग कर एक और तीन पंक्तियों के पूरक । इनपुट "डीसी" पर "यौगिक नाम", "२२८" पर "प्रणेता आयन", "११२" पर "उत्पाद आयन" डीसी विश्लेषण के लिए. इनपुट "5hmC" पर "यौगिक नाम", "२५८" पर "प्रणेता आयन", "१४२" पर "उत्पाद आयन" 5hmC विश्लेषण के लिए. इनपुट डी3-यौगिक नाम पर 5hmC, "२६१" पर "प्रणेता आयन", "उत्पाद आयन" में डी3-5hmC विश्लेषण के लिए "१४५" ।
      3. गैस स्रोत के मापदंडों का निर्माण । क्लिक करें "MS QQQ | स्रोत । स्रोत पैरामीटर: गैस अस्थायी: ३०० ° c "; "गैस प्रवाह: 11 L/ "छिटकानेवाला: 15 साई"; "सकारात्मक-केशिका: ३५०० V" ।
      4. प्रस्तावित पद्धति को सहेजें । क्लिक करें "MS QQQ | साधन | विधि को "के रूप में सहेजें । "निर्देशिका" द्वारा प्रस्तावित विधि के लिए एक मार्ग का चयन करें और "विधि" में सामग्री को लगा कर विधि के लिए एक नाम दे, उदाहरण के लिए: 5mC और 5hmC विश्लेषण.
  2. UHPLC पृथक्करण और एमएस/mononucleosides के एमएस विश्लेषण
    1. 5mC और cytosine के लिए मोबाइल चरण तैयार करें (ग) विश्लेषण: समाधान के मोबाइल चरण a और b. समाधान a: फार्मिक एसिड की ५०० µ l के साथ ultrapure पानी की ५०० मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता: ०.१%), और समाधान B: ५०० मिलीलीटर की १००% मेथनॉल. मिश्रण समाधान ए और बी पर 95:5 (v:v) मोबाइल चरण के रूप में elute 5mC और सी (चरण 6.1.3.3 में सेट) । ०.२५ mL/मिनट पर प्रवाह दर सेट करें (चरण 6.1.3.1 में सेट करें) ।
    2. 5hmC विश्लेषण के लिए विलायक ए और बी द्वारा मोबाइल चरण तैयार करें । विलायक एक २.० mM एनएच4HCO3 जलीय समाधान (पीएच ९.०) (५०० एमएल) है, और विलायक बी १००% मेथनॉल (५०० मिलीलीटर) है । एक अनुकूलित ग्रैडिएंट रेफरेंस के द्वारा पृथक 5hmC: 0-3 min, ५.०% B और ९५% A (v:v); 3-6 min, १५.०% B और ८५% A; 6-10 min, १००% B; 10-15 मिनट, ५.०% B और ९५% A (चरण 6.1.3.4 में सेट) । ०.२५ mL/मिनट पर प्रवाह दर सेट करें (चरण 6.1.3.1 में सेट करें) ।
  3. स्तंभ से रेफरेंस का विश्लेषण करने और सकारात्मक आयन मोड (स्टेप 6.1.5.2.1 में सेट) अपनाने के लिए MRM मोड (स्टेप 6.1.5.1 में सेट) के साथ electrospray ms/
    1. मॉनिटर संक्रमण: 5mC, m/z 242 → 126 (टक्कर ऊर्जा, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245 → 129 (5 eV); डीसी, एम/जेड 228 → 112 (5 eV); 5hmC, m/z 258 → 142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261 → 145 (5 eV) (चरण 6.1.5.2.2 में सेट) ।
    2. सेट केशिका और टुकड़ा वोल्टेज पर + ३,५०० v (चरण 6.1.5.3 में सेट) और ९० v (चरण में सेट 6.1.5.2.1), क्रमशः ।
    3. 5 µ l पर इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करें और प्रत्येक नमूने का विश्लेषण 3 बार (चरण 6.1.2 में सेट करें). 5mC और 5hmC की राशि का मूल्यांकन करने के लिए इसी मानक curves रोजगार ।
      1. 5mC के मानक वक्र की स्थापना: 1 स्थानांतरण-50 एनएम (1, 5, 10, 20, ५० एनएम, अंतिम एकाग्रता) 5mC के मानक समाधान केंद्रापसारक ट्यूबों में और जोड़ने के ५० एनएम [डी3]-5mC ट्यूबों के लिए । ५० µ करने के लिए कुल मात्रा के पूरक l. 5mC नमूना (चरण 6) के लिए निर्देशों का पालन मानक 5mC का विश्लेषण करते हैं.
      2. 5hmC के मानक वक्र बनाएं: 1 स्थानांतरण-20 एनएम (1, 2, 5, 10, 20 एनएम, अंतिम एकाग्रता) 5hmC के मानक समाधान ट्यूबों के लिए और जोड़ने के लिए 3 एनएम [डी3]-5hmC ट्यूबों के लिए । ५० µ करने के लिए कुल मात्रा के पूरक l. 5hmC नमूना (चरण 6) के लिए निर्देशों का पालन मानक 5hmC का विश्लेषण करते हैं.

7. सांख्यिकीय महत्व का विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन ।
    1. सॉफ़्टवेयर खोलें और "नई तालिका और ग्राफ़" में "स्तंभ" का चयन करें. निम्नानुसार पैरामीटर सेट करें: "नमूना डेटा | किसी रिक्त डेटा तालिका के साथ प्रारंभ करें "; "एक ग्राफ चुनें-पहले मोड"; "रेखांकन प्रतिकृति या त्रुटि पट्टियां । प्लाट | SEM के साथ मतलब है "।
    2. नियंत्रण और Vc/PD0325901-स्वास्थ्यकर्मी समूह में "A" और "B" पंक्ति, क्रमशः इनपुट करने के लिए "बनाएं" क्लिक करें । छह डेटा का चयन करें और "विश्लेषण" में क्लिक करने के लिए ।
    3. चुनें "t परीक्षण (और nonparametric tests)" में "कॉलम विश्लेषण" और क्लिक करें "ठीक है" अगले अंतरफलक में प्रवेश के लिए ।
    4. पैरामीटर इस प्रकार सेट करें: "परीक्षण चुनें । परीक्षण नाम । ख़राब t परीक्षण; विकल्प । दो पूंछ "; "विश्वास अंतराल: ९५%"; "भरपुर अंक | 4 महत्वपूर्ण अंक दिखाएं "। नियंत्रण और Vc/PD0325901 उपचार के बीच p मान प्राप्त करने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
  2. नियंत्रण और प्रयोगात्मक दो-पूंछ और बिगड़ा छात्र के टी-टेस्ट16रोजगार समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करें ।
    नोट: p < 0.05 में सांख्यिकीय महत्व रखने वाले अंतर को नोट करते हैं. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ।

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Representative Results

Vc/PD0325901 synergistically माउस ES कोशिकाओं के वैश्विक विलोपन प्रेरित । सीरम प्रदर्शन डीएनए hypermethylation में माउस ES कोशिकाओं, जबकि pluripotent आईसीएम कोशिकाओं और PGCs डीएनए मिथाइल के वैश्विक विलोपन दिखाने के लिए और hypomethylated राज्य बारीकी से उनके pluripotency9,10के साथ जुड़ा हुआ है ।

पहले, हम और अंय लोगों ने पाया कि कुलपति15,17Tet-मध्यस्थता 5mCकेलिए कर सकते हैं । इस बीच, 2i भी 5mC के डी नोवो संश्लेषण को बाधित करने के लिए पाया गया था. इन निष्कर्षों के संदर्भ में, हम आगे कुलपति और 2i का उपयोग कर माउस ES कोशिकाओं के synergistic हेरफेर का प्रस्ताव एक साथ । UHPLC के विश्लेषण के बाद एमएस/ms, हमने पाया है कि कुलपति और 2i सीरम युक्त माध्यम में पूरक नाटकीय रूप से 5mC सामग्री को कम कर सकते हैं ३.२ से ०.३३ प्रति १०० C (~ ९०% 5mC हानि) दिन 11 से माउस ES कोशिकाओं में (चित्र 1a). इसके विपरीत, कुलपति या 2i अकेले उपचार केवल १.४% 5mC पर स्थिर स्तर या १.३% 5mC के स्तर पर ६१% की कमी के साथ ५८% विलोपन का कारण बना ।

2i माध्यम खल्क अवरोध करनेवाला PD0325901 और GSK3β अवरोधक CHIR99021 से बना है. इसके बाद, हम जांच करते है कि कौन सा घटक कुलपति और 2i के सह-उपचार के दौरान 5mC की वैश्विक हानि लाती है । दिलचस्प, कुलपति/PD0325901 की तुलना में कुलपति/2i डीएनए मिथाइल के स्तर में तेजी से गिरावट हुई । vc/PD0325901 5 दिनों के बाद स्थिर 5mC स्तर (~ ०.३३% 5mC) हासिल की है, जबकि कुलपति/2i 11 दिन में एक तुलनीय स्तर पर पहुंच गया । इसके विपरीत, CHIR99021 के पूरक आंशिक रूप से दबा कुलपति-ट्रिगर डीएनए (चित्र 1a) । इन आंकड़ों से स्पष्ट रूप से सुझाव है कि 2i में PD0325901 माउस ES कोशिकाओं में जीनोमिक डीएनए के वैश्विक hypomethylation के लिए योगदान देता है, जबकि CHIR99021 के 2i आंशिक रूप से विलोपन के 5mC को रोकता है । इसलिए, हम सोचते है कि कुलपति/2i के सापेक्ष कुलपति/PD0325901 द्वारा प्रेरित तेजी से डीएनए के लिए मिथाइल पर CHIR99021 के आंशिक अवरोध को जिंमेदार ठहराया जा सकता है ।

हमने यह परिकल्पना की कि वैश्विक विलोपन में 5mC के कुलपति/PD0325901 द्वारा प्रेरित माउस ES कोशिकाओं डीएनए में वृद्धि के लिए आंशिक रूप से उचित हो सकता है । इसलिए, हम 5mC के जीनोमिक ऑक्सीकरण उत्पादों की जांच की । इसमें बताया गया है कि 5mC को Tet फैमिली dioxygenases के उत्प्रेरक ऑक्सीकरण द्वारा 5hmC में बदला जा सकता है, जो Fe (II) और 2-oxoglutarate18,19पर निर्भर हैं । जीनोमिक 5hmC डीएनए प्रतिकृति20द्वारा पतला किया जा सकता है । इसके अलावा, 5hmC आगे Tet dioxygenases द्वारा ऑक्सीकरण किया जा सकता 5-formylcytosine (5fC) और 5-carboxylcytosine (5caC) है, जो कुशलतापूर्वक thymine डीएनए glycosylase (tdg संधारित्र) द्वारा उत्पाद unmethylated cytosine को ठीक करने के लिए, एक सक्रिय डीएनए का संकेत किया जा सकता है उत्पादन २१,२२.

पिछले काम15के साथ लाइन में, कुलपति से युक्त उपचार (कुलपति, कुलपति/2i, कुलपति/PD0325901, vc/CHIR99021) नाटकीय रूप से वृद्धि हुई 5hmC आवृत्ति (5hmC/106 सी) के बाद 1 दिन, और उसके बाद 5hmC के स्तर में गिरावट आई धीरे (आंकड़ा 1b) के कारण 5mC सब्सट्रेट में उत्तरोत्तर कमी. विशेष रूप से, कुलपति/PD0325901 और कुलपति/2i ने वीसी और वीसी की तुलना में 5hmC घटाने की तेजी से कैनेटीक्स दिखाया CHIR99021 की तेजी से कमी के कारण 5mC/ इसके अलावा, हम यह भी कहा कि 1 दिन में, कुलपति उपचार 5hmC की तुलना में अधिक उत्पादन प्रेरित कुलपति/CHIR99021, यह दर्शाता है कि CHIR99021 आंशिक रूप से 5hmC के कुलपति प्रेरित उत्पादन दबा दिया और डीएनए में बाधा उत्पंन । 2i उपचार में 5hmC हानि 5mC सब्सट्रेट की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जाना चाहिए । एक साथ ले लिया, इन परिणामों से पता चला है कि कुलपति बढ़ाया डीएनए में वृद्धि की गतिविधि आंशिक रूप से synergistically hypomethylation के सह-उपचार में योगदान के कुलपति/PD0325901 और कुलपति/2i ।

दोनों Habibi एट अल. 23 और वॉन Meyenn एट अल. 24 यह भी बताया कि 2i शर्तों के तहत माउस ES कोशिकाओं वैश्विक डीएनए hypomethylation और भोली pluripotency दिखाया । 5mC के स्तर में गिरावट आई और धीरे से पता चला एक स्थिर राज्य (~ 1% 5mC) पर 12-14 दिनों के बाद सीरम से reवर्शन के लिए 2i. vc/PD0325901 कल्चर सिस्टम में, सह-उपचार के कारण तेजी से डीएनए में गड़बड़ी हो गई और सीरम माध्यम में कुलपति/PD0325901 के पूरकता के बाद एक स्थिर स्तर (०.३३% 5mC) तक पहुंच गया 5 दिनों के लिए, कुलपति/PD0325901 के synergistic प्रभाव के कारण । पहुंच methylated स्तर (०.३३% 5mC) से कम pronouncedly था कि 2i शर्तों के तहत Habibi एट अल द्वारा रिपोर्ट । और वॉन Meyenn एट अल., जबकि 5hmC का स्तर कुलपति की पदोन्नत पीढ़ी के कारण अधिक रहा ।

PD0325901 ऊंचा Prdm14 अभिव्यक्ति को दमन Dnmt3b और Dnmt3l, लेकिन नहीं Dnmt3a25। 5mC नुकसान उत्प्रेरण में PD0325901 की कार्रवाई की जांच करने के लिए, 5mC से संबंधित प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक श्रृंखला की जांच की गई थी, जिसमें रखरखाव (Dnmt1) और de नोवो (Dnmt3a, और Dnmt3b) डीएनए methyltransferases और उनके cofactor (Uhrf1 और Dnmt3l) और विनियमन प्रोटीन (Prdm14) 8,9,26। पश्चिमी दाग विश्लेषण के बाद, Prdm14 pronouncedly PD0325901-संस्कृति सहित (चित्रा 2) में पदोंनत किया गया था । इसके विपरीत, Dnmt3b और उसके cofactor Dnmt3l काफी नीचे दिखाया-PD0325901 में प्रोटीन अभिव्यक्ति के विनियमन-उपचार सहित (चित्रा 2) । CHIR99021 उपचार Prdm14, Dnmt3b, और Dnmt3l के स्तर पर कोई या मामूली प्रभाव दिखाई दिया । Dnmt3awas की अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं हुआ और कारण अस्पष्ट है । इसके अलावा, मेंटेनेंस डीएनए methyltransferase Dnmt1 और इसके टारगेटिंग फैक्टर Uhrf1 में भी कोई बदलाव नहीं दिखा और डेटा नहीं दिखाया गया ।

हाल के अध्ययनों से संकेत दिया है कि Prdm14 कुछ जीन प्रवर्तकों को polycomb दमनात्मक परिसर 2 (PRC2) की भर्ती कर सकते हैं, जैसे कि de नोवो डीएनए methyltransferases (Dnmt3a और Dnmt3b) और उनके cofactor (Dnmt3l) के रूप में उनकी अभिव्यक्ति को दबाना, और योगदान 2i शर्तों के तहत hypomethylation को बनाए रखना8,27. हमारे डेटा से पता चला कि PD0325901 Prdm14 की अभिव्यक्ति स्तर ऊंचा Dnmt3b और Dnmt3l को बाधित और तंत्र द्वारा de नोवो जीनोमिक 5mC संश्लेषण कम करने के लिए.

Vc/PD0325901 शर्तों के तहत माउस ES कोशिकाओं के pluripotency रखरखाव का पता लगाने के लिए, mRNA अभिव्यक्ति स्तर के कई कोर pluripotency-जुड़े कारकों की जांच की गई, और इन कारकों को pluripotency में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की पुष्टि की गई है28। वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण में पाया गया कि Oct4, SOX2, Esrrb, और Sall4 सीरम संस्कृति के विपरीत में कुलपति/PD0325901 के साथ उपचार के 5 दिनों के माध्यम से समान अभिव्यक्ति का स्तर दिखाया (चित्र 3ए) । Nanog और Tcf3 वृद्धि हुई १.३-गुना और १.६ गुना, क्रमशः । इसके विपरीत, Klf4 ४२% नीचे दिखाया-विनियमन और Rex1 केवल के बारे में 12% की कमी आई । इन परिणामों का सुझाव है कि Vc/PD0325901 सह-उपचार pluripotency कारकों की अभिव्यक्ति में विविध परिवर्तन प्रेरित; हालांकि, Oct4 और SOX2, सबसे महत्वपूर्ण कारकों, अभिव्यक्ति के लगभग निरंतर स्तर रखा ।

अगले, एक alkaline फॉस्फेट (एपी) परख का आकलन करने के लिए कि क्या माउस ES कोशिकाओं को एक विभेदित या विभेदित राज्य में किया गया था । कक्षों की फ़ोटो (चित्र 3 बी और c) एक एक उद्देश्य लेंस द्वारा 10 गुना प्रवर्धन के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे से प्राप्त किया गया था । वीसी में 26 दिनों की लगातार खेती के बाद/PD0325901-जोड़ा सीरम मध्यम, माउस ES कोशिकाओं सजातीय आकृति विज्ञान दिखाया । इसके अलावा, लगभग सभी कोशिकाओं बैंगनी-काले दाग रहे थे और एक गेंद की तरह राज्य की वृद्धि (आंकड़ा 3सी) के बिना प्रदर्शन, एक विभेदित राज्य दिखा रहा है । इसके विपरीत, सीरम शर्तों के तहत, 26 दिन में माउस ES कोशिकाओं के एक हिस्से धुंधला के बाद बैंगनी काले थे और आकृति विज्ञान में एक गेंद की तरह राज्य था, जबकि अन्य सफेद डैश्ड ओवल लाइनों (चित्र बी) द्वारा चिह्नित फैलाने के साथ प्रकाश रंग प्रस्तुत किया; यह संकेत दिया कि सीरम-कल्चर्ड माउस ES कक्ष आकृति विज्ञान और एक pluripotent स्थिति में विषम थे, जो पिछली रिपोर्ट13के संगत है । सामूहिक रूप से, डेटा समर्थित है कि कुलपति के साथ संयोजन में PD0325901 उत्कृष्ट आकृति विज्ञान और माउस ES कोशिकाओं में एक विभेदित राज्य को बनाए रखने कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: Vc/PD0325901 synergistically जीनोमिक 5mCin माउस ES कोशिकाओं के वैश्विक विलोपन प्रेरित । () 5mC आवृत्ति (5mC/सी) और () 5hmC आवृत्ति (5hmC/कुलपति के साथ एक सतत पूरक के 26 दिन के उपचार के दौरान समय पर निर्भर परिवर्तन, 2i, vc/2i, कुलपति/PD0325901, या CHIR99021 सीरम युक्त माध्यम में कुलपति/ त्रुटि पट्टी से पता चलता है मानक विचलन (SD) से तीन दोहराया विश्लेषण द्वारा UHPLC-ms/ms. C: cytosine. यह आंकड़ा Li et al से संशोधित किया गया है. 25. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: Prdm14 और डीएनए methyltransferases के प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन (Dnmt3a, Dnmt3b, और Dnmt3l) । प्रस्तुत बैंड (बाएं से दाएं) एक 5 दिन सीरम संस्कृति (नियंत्रण), कुलपति, PD0325901, CHIR99021, 2i, कुलपति/PD0325901, कुलपति/CHIR99021 के उपचार के माध्यम से प्राप्त किए गए, और कुलपति/2i, क्रमशः । Prdm 14 की अभिव्यक्ति को विनियमित किया गया था और Dnmt3b और Dnmt3l संस्कृति सहित PD0325901 के बाद कमी आई । Dnmt3a कोई बदलाव नहीं दिखा । β-tubulin आंतरिक संदर्भ के रूप में सेट किया गया था । कांग्रेस: नियंत्रण; पीडी: PD0325901; CH: CHIR99021. यह आंकड़ा Li et al से संशोधित किया गया है. 25. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: Vc/PD0325901-प्रेरित परिवर्तन pluripotent जीन की mRNA अभिव्यक्ति में और क्षारीय फॉस्फेट की गतिविधि में । () आंशिक pluripotent जीन के mRNA स्तर के माध्यम से एक 5 दिन के उपचार के माध्यम से बदल गया था कुलपति/PD0325901 सापेक्ष है कि सीरम शर्तों के तहत (नियंत्रण) । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व किया गया । सांख्यिकीय महत्व मूल्यांकित किया गया था और p < 0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था । * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, और ns का प्रतिनिधित्व गैर-महत्वपूर्ण है । पीडी: PD0325901. 26 दिनों के लिए सीरम में माउस ES कोशिकाओं () आंशिक वृद्धि प्रदर्शित सफेद डैश्ड ओवल लाइनों द्वारा चिह्नित, जबकि कुलपति/PD0325901-जोड़ा सीरम मध्यम महान आकृति विज्ञान और एक विभेदित राज्य बनाए रखा (सी) । इन छवियों को एक औंधा माइक्रोस्कोप उज्ज्वल क्षेत्र में एक कैमरे के साथ जुड़े से प्राप्त कर रहे थे । यह आंकड़ा Li et al से संशोधित किया गया है. 25. स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

काम में, हम कुलपति और PD0325901 के संयोजन के एक उपंयास विधि का प्रदर्शन एक विभेदित और hypomethylated राज्य में माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने, जो कुलपति द्वारा डीएनए और दमन को बढ़ावा देने के एक synergistic कार्रवाई द्वारा हासिल किया गया था de नोवो डीएनए PD0325901 द्वारा मिथाइल । इसके अलावा, माउस ES कोशिकाओं कुलपति/PD0325901 संस्कृति प्रणाली के तहत महान आकृति विज्ञान दिखाया ।

वीसी/PD0325901 कल्चरल सिस्टम में माउस ES कोशिकाओं की स्थिति को बेहतर बनाए रखने के लिए कुछ अहम कदम उठाए गए हैं । सबसे पहले, FBS बैचों को खोजने के लिए और सर्वश्रेष्ठ बैचों शेयर करने के लिए पहले से दिखलाई जाने की आवश्यकता है; इसके अलावा, सीरम के लगातार प्रतिस्थापन कोशिका प्रसार के लिए हानिकारक है और pluripotency के रखरखाव के लिए । दूसरे, सेल मार्ग के चरण में कक्ष की कालोनियों के dissociating के दौरान pipetting कोशिकाओं से अधिक से बचें । तीसरे, सेल की खेती के दौरान trypsin के प्रतिकूल प्रभाव क्षीणन करने के लिए, trypsin के बाद यह सेल passaging के दौरान बर्तन में कोशिकाओं को शामिल किया गया तुरंत हटा दिया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त कुलपति की अस्थिरता के कारण PD0325901 कल्चरल मीडियम को प्रतिदिन प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.

शास्त्रीय सीरम संस्कृति, Vc/PD0325901 शर्तों के तहत माउस ES कोशिकाओं के साथ तुलना में एक अधिक सजातीय सेल जनसंख्या (चित्र बी, सी) और एक hypomethylated राज्य है, जो आईसीएम और PGC जैसा दिखता है । इसके अलावा, हाल ही में विकसित 2i संस्कृति के साथ तुलना में, हमारी विधि तेजी से कैनेटीक्स के साथ hypomethylation का एहसास कर सकते हैं, और एक भी अवरोध करनेवाला (PD0325901) के उपयोग DMSO की इनपुट राशि कम कर देता है, इस प्रकार कोशिकाओं को नुकसान कम. हालांकि, हमारी संस्कृति प्रणाली में FBS के अलावा के कारण, FBS के ambivalent दोहरी कार्रवाई दीर्घकालिक संस्कृति के दौरान कोशिका विभेद का कारण हो सकता है । कुल मिलाकर, इस उपंयास संस्कृति प्रणाली रखरखाव और माउस ES कोशिकाओं के बड़े पैमाने में विस्तार के लिए उपयुक्त है ।

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Disclosures

लेखकों के हित के कोई संभावित संघर्ष का खुलासा ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन (२१४३५००८ और २१३२७००६ करने के लिए बुश hw), और सामरिक प्राथमिकता के अनुसंधान कार्यक्रम के चीनी अकादमी ऑफ साइंसेज (XDB14030200 करने के लिए बुश hw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52, (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8, (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13, (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484, (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115, (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135, (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8, (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334, (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286, (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13, (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7, (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1, (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39, (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (8), (2012).

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