Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Biochemistry

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Summary

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

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Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

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Abstract

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont susceptibles de faire la différence dans l’une des trois couches germinales (endoderme, mésoderme et ectoderme) et peuvent générer de nombreux lignages pour la médecine régénérative. ES cellules la culture in vitro est depuis longtemps l’objet de préoccupations répandues. Classiquement, les souris ES cellules sont maintenues en facteur inhibiteur sérique et la leucémie (LIF)-contenant le support. Toutefois, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, cellules montrent l’hétérogénéité dans la morphologie et le profil d’expression des gènes reliés à la pluripotence et sont pour la plupart dans un état métastable. En outre, des cellules ES pièce hyperméthylation globale, mais cellules ES naïve de la masse cellulaire interne (MCI) et les cellules germinales primordiales (PGC) sont dans un état de l’hypométhylation globale. L’État hypométhylés de l’ICM et PGC est étroitement associé à leur pluripotence. Pour améliorer les méthodes de culture cellulaire souris ES, nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode basée sur l’utilisation sélective combinée des deux composés de petites molécules pour maintenir l’état de hypométhylés et pluripotentes d’ADN. Ici, nous présentons qui le co-traitement de vitamine C (Vc) et PD0325901 permet d’effacer environ 90 % de la 5-méthylcytosine (5mC) à 5 jours dans les cellules ES de souris. Le contenu généré 5mC est comparable à celui dans le PGC. L’enquête mécaniste montre que PD0325901 up-régule l’expression Prdm14 pour supprimer Dnmt3b (de novo ADN méthyltransférase) et Dnmt3l (le cofacteur de Dnmt3b), en réduisant la synthèse de novo de 5mC. VC facilite la conversion de 5mC à 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) catalysée principalement par Tet1 et Tet2, en indiquant l’implication des demethylations ADN passives et actives. Par ailleurs, dans des conditions de Vc/PD0325901, cellules ES souris montrent morphologie homogène et état pluripotent. Collectivement, nous vous proposons un procédé nouveau et culture chimique-synergie pour atteindre l’hypométhylation de l’ADN et l’entretien de la pluripotence des cellules de souris ES. La méthode chimique dépendant de petites molécules permet de surmonter les lacunes importantes de la culture de sérum et promesse de cales pour générer des cellules ES homogènes pour davantage les applications cliniques et de recherches.

Introduction

CSEh est provenus de l’ICM un blastocyste1. Les cellules sont dans un état de pluripotence et peuvent former tous les lignages somatiques et de cellules germinales2. Mise en place de cellules d’ES fournit l’occasion d’étudier le développement des processus in vitro et peut générer des cellules médicales présentant un intérêt pour la médecine régénérative basée sur leur pluripotence3.

Deux groupes seminally établi les lignées de cellules de souris ES en 1981 et quand a cultivé des cellules dérivées de l’embryon précoce de souris en sérum fœtal (SVF)-contenant le support avec les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) que le chargeur couche1,4 . MEFs étaient inactivés mitose et ont été préalablement cultivées dans les plats avant mise en culture des cellules ES. MEFs appuient à la fixation des cellules ES de souris et produisent des facteurs de croissance pour promouvoir la propagation et de réprimer la différenciation5, tandis que le FBS propose des facteurs trophiques essentiels et hormones pour la prolifération cellulaire. Des études subséquentes indiquent que FRV produite par des cellules nourricières était la cytokine clée pour l’auto-renouvellement et l’entretien de pluripotence dans les cellules ES de souris, et l’addition de FRV dans le milieu pourrait remplacer alimentation cellules6. Actuellement, le maintien des cellules ES de souris dans un milieu FBS/FRV sur mangeoires est toujours la méthode standard adoptée par de nombreux chercheurs. Cependant, quelques problèmes avec cette approche de la culture classique. Tout d’abord, des cellules nourricières sécrètent des facteurs excessives et incontrôlées et peuvent causer la contamination pathogène7. Pour éviter cette ingérence, revêtement de la surface des plats avec de la gélatine et l’ajout de FRV dans contenant du sérum moyen sont des méthodes alternatives pour maintenir les cellules de souris ES sans cellules de la couche de conducteur. En outre, les cellules d’ES de souris cultivées dans des conditions de sérum/FRV pièce hétérogénéité morphologique dans les populations de cellules et même dans le niveau d’expression de facteurs liés à la pluripotence8. Des études récentes suggèrent que, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, les facteurs de transcription de base liées à la pluripotence (y compris OCT4, SOX2 et Nanog) peuvent maintenir la pluripotence FRV et WNT signaling ; Cependant, en particulier, ils activent également un signal de facteur de croissance (FGF) de fibroblastes pour déclencher la différenciation8. En raison de la double action ambivalente, les base de facteurs de transcription, souris ES cellules cultivées dans le sérum présentes hétérogénéité, composé de deux sous-groupes interchangeables, un semblable à l’ICM et une autre qui ressemble à l’épiblaste apprêtée état8. En outre, les cellules de souris ES dans le sérum présentent souvent hyperméthylation global9, tandis que ICM et PGC est dans un état de hypométhylés global, qui est étroitement lié à leur pluripotence9,10.

Il y a une demande considérable pour développer de nouvelles méthodes de culture de cellules de souris ES. Plusieurs protocoles améliorés ont été établis depuis 200311 , mais il y a encore quelques limitations et défauts7. Depuis 2008, l’utilisation combinée des deux inhibiteurs de la kinase de petites molécules, PD0325901 (l’inhibiteur de la protéine mitogène-kinase (MAPK) / extracellulaire-signal-regulated kinase ERK (MEK)) et CHIR99021 (l’inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3 (GSK3)), en N2B27 milieu avec FRV et sans sérum a ouvert des nouvelles perspectives culture souris ES cellules12. Ce nouveau milieu défini est caractérisé par l’utilisation de deux inhibiteurs (2i). Les cellules ES de souris cultivées dans un milieu 2i/FRV sont plus homogènes dans les populations de cellules et l’expression des facteurs de pluripotence. En outre, des cellules de souris cultivées 2i/FRV ES pièce hypométhylation de l’ADN dans le monde, qui est plus proche de cellules ICM9,13. Malgré cela, la culture 2i a ses inconvénients. PD0325901 et CHIR99021 sont insolubles dans l’eau sont généralement dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)-base de solution mère pour les ajouter dans le milieu de culture. Des études ont montré qu’à long terme et exposition de faible dose de cellules à DMSO peut conduire à la cytotoxicité14.

Ici, nous avons utilisé deux composés de petites molécules et mis au point une nouvelle méthode de culture de cellules de souris ES. La méthode de culture originale allie Vc et MEK inhibiteur PD0325901 pour promouvoir l’hypométhylation de l’ADN rapidement et efficacement à un niveau comparable de PGC, nommé comme le protocole de culture Vc/PD0325901. Les cellules de souris ES dans Vc/PD0325901-ajout d’un milieu contenant du sérum pièce homogénéité morphologique et sont maintenues dans un état fondamental. Par rapport à la culture de 2i, cellules ES de souris cultivées dans des conditions de Vc/PD0325901 pièce cinétique rapide de déméthylation de l’ADN et peuvent atteindre le niveau de l’hypométhylation comparable à celle du PGC. En outre, l’utilisation d’un inhibiteur d’unique (PD0325901) diminue la quantité d’entrée de DMSO en moyenne par rapport à celle utilisée dans la 2i (PD0325901/CHIR99021) et réduit les dommages aux cellules.

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Protocol

1. les préparatifs

  1. Préparer une solution de 1,0 mM PD0325901 (inhibiteur de la MEK) et 3,0 mM CHIR99021 (inhibiteur de GSK3).
    1. Peser 2 mg de PD0325901 et ajouter 4,15 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré.
    2. Peser 2 mg de CHIR99021 et ajouter 1,43 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré.
    3. Suivante reconstitution, stocker aliquotes (50 µL/tube en tube PCR 200 µL) à-20 ° C et l’abri de la lumière. Retirer un tube contenant le stock congelé d’une congélation et décongélation à température ambiante avant utilisation.
  2. Peser 0,0176 g du CR dans 1 mL d’un tube à centrifuger et reconstituer avec 1 mL d’eau stérile à une concentration finale d’avant 100 mM.
  3. Inactiver FBS : incuber 500 mL de FBS dans un bain d’eau à 56 ° C pendant 30 min.
  4. Préparez 600 mL de milieu de base pour la culture des cellules de souris ES.
    1. Utiliser une bouteille de milieu glucosé DMEM/haut (500 mL) et prélever 40 mL.
    2. Supplément 460 mL de milieu DMEM/haut glucose 20 % inactivé FBS (120 mL), 1 000 U/mL FRV (60 µL de solution-mère 107 U/mL), 0,1 mM non essentiels des acides aminés (NEAA) (6 mL de solution mère de 10 mM), le pyruvate de sodium 1 mM (6 mL de solution étalon de 100 mM) , 2 mM de L-glutamine (6 mL de solution mère de 200 mM), 0,1 mM β-mercaptoéthanol (600 µL de solution étalon de 100 mM) et 33 IU/mL de pénicilline et 33 µg/mL de streptomycine (2 mL de solution (10 000 UI/mL de pénicilline et 10 000 µg/mL de streptomycine) mixte de pénicilline-streptomycine) . Décrivez le milieu de base comme moyen de sérum.
    3. Distribuer 50 µL de la solution mère de PD0325901 (1,0 mM) et Vc (100 mM), respectivement, dans 50 mL de milieu sérum (concentration finale : 1,0 µM PD0325901 et 100 µM Vc) et définir le milieu comme support de Vc/PD0325901.
      NOTE : Préparer fraîches moyennes avant de l’utiliser en raison de l’instabilité du Vc Vc/PD0325901.
    4. À l’aide d’une pipette, transférer 50 µL de la solution mère de PD0325901 (1,0 mM) et CHIR99021 (3. 0 mM), respectivement, dans 50 mL de milieu sérum (concentration finale : PD0325901 1,0 µM et CHIR99021 3.0 µM) et définir le milieu comme support de 2i.
  5. Préparer les plats enduit de gélatine.
    1. Préparer la solution de gélatine de 0,1 % : dissoudre 0,3 g de gélatine dans 300 mL d’eau ultrapure dans un flacon de réactif de verre avec un bouchon et stériliser à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Store la solution stérile à la température ambiante.
    2. Incuber les récipients de culture de cellules (6 cm de diamètre) avec 2 mL de solution de gélatine de 0,1 % pendant 15 min à température ambiante et puis aspirer les feuilles de gélatine. Sécher la vaisselle à l’air et de les utiliser dans les 12 h.
  6. Préparer 10 mL de cellules de souris ES congélation moyen dans un tube à centrifuger 15 mL : 90 % SVF (9 mL) et 10 % DMSO (1 mL). Utiliser le support sous 1 jour.
  7. Préparer un récipient congélation : ajouter 100 % d’alcool isopropylique à la ligne de remplissage du conteneur congélation et jeter le vieux l’alcool isopropylique. Ajouter l’alcool isopropylique nouveau directement après chaque utilisation de cinquième.
  8. Faire le tampon de la digestion enzymatique : pesée 1,2114 g de poudre de Tris dans 100 mL d’eau ultrapure pour préparer 100 mM Tris solution et ajouter concentré HCl solution (environ 12 M) dans la solution de Tris pour ajuster le pH à 7,6 (environ 0,6 mL de solution de HCl concentrée).
  9. Préparation de 50 mL de tampon radio immunoprécipitation (tampon RIPA) : 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20 % de glycérol, 0,5 % NP40, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA. Compléter avec 1 millimètre DTT, 1 X cocktail inhibiteur de protéase et 1 mM avant PMSF à utiliser. Une fois le PMSF ajouté, utilisez la mémoire tampon dans les 30 minutes.

2. la croissance de cellules ES souris sur enduit de gélatine plats

  1. La culture des cellules de souris Préchauffez ES (type sauvage, SvEv 129) moyen, la trypsine et solution tamponnée au phosphate (PBS) dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Le passage des cellules. Aspirez le milieu complètement de l’antenne et la pipette de 2 mL de PBS aux plats de rincer les cellules.
    1. Retirez le PBS avec une pipette et laver les cellules avec 2 mL de PBS.
    2. Retirez le PBS et ajouter 0,3 mL de trypsine-EDTA (0,25 %) à chaque plat.
    3. Couvrir le plat entier avec la trypsine rapidement et puis retirez-le immédiatement.
    4. Mettre le plat dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 min détacher les cellules du plat. Sortez les plats de l’incubateur et ajouter 2 mL de milieu de sérum pré chauffé pour mettre fin à l’action de la trypsine.
    5. Dissocier les colonies de cellules en suspension monocellulaire en resuspendant avec une pipette (embout de la pipette 5 mL) 10 fois.
  3. Transférer 150 µL de 2 mL de la solution de cellules (environ 190 000 cellules en comptant avec un hémocytomètre) dans une autre boite enduit de gélatine et compléter avec 3 mL de milieu de Vc/PD0325901 fraîchement préparé par boîte de Petri de 6 cm. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
  4. Toutes les 24 h pendant l’incubation, enlever le milieu de culture ancien et ajouter 3 mL de Vc/PD0325901-milieu frais dans la boîte de Petri en raison de l’instabilité de la confluence de la Vc. Expect 70 – 80 % après 2 – 3 jours.
  5. Après avoir atteint 70 à 80 % confluence, les cellules de passage et continuer à la culture à eux comme décrit aux points 2.2 à 2.4.

3. congeler et décongeler les cellules ES de souris

  1. Congeler des cellules de souris ES.
    1. Détacher les cellules de la vaisselle avec de la trypsine en suivant le point 2.2.
    2. Transférer les cellules dans un tube en plastique de 15 mL et centrifuger à 800 x g et à température ambiante pendant 3 min.
    3. Jeter le surnageant doucement dans un bécher et Resuspendre le culot cellulaire avec 1 mL de fraîchement congélation moyen. Préparer la congélation moyen 30 min avant cette étape pour s’assurer qu’il est à température ambiante avant utilisation.
    4. Les cellules au moyen d’un tube de microcentrifuge de 1,8 mL avec une pipette 1 mL de gel de transfert et placer le tube de microcentrifuge dans un récipient froid. Ajouter l’alcool isopropylique à la ligne de remplissage du conteneur congélation et gardez-le à température ambiante avant de l’utiliser.
    5. Laisser une nuit les conteneurs congélation dans un congélateur à-80 ° C.
    6. Transférer les tubes de microcentrifuge dans un contenant de l’azote liquide jusqu'à 2 à 3 ans.
      NOTE : Ne pas garder les cellules dans le milieu de congélation pendant un long temps et transférer rapidement les cellules à un congélateur-80 ° C en raison de la toxicité du DMSO.
  2. Décongelez les cellules de souris ES.
    1. Réchauffez 50 mL de milieu de sérum dans un bain-marie à 37 ° C.
    2. Sortir un flacon contenant des cellules du contenant de l’azote liquide et y plonger le flacon plafonné dans un bain-marie à 37 ° C. Agiter rapidement dans le bain d’eau à dégeler. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL avec une pipette de 1 mL. Ajouter 2 mL de milieu de culture de sérum pré chauffé dans un tube à diluer le milieu de congélation et puis centrifuger à 800 x g et à température ambiante pendant 3 min.
    3. Retirez le surnageant et remettre doucement les boulettes de cellule avec 3 mL de milieu frais de Vc/PD0325901 à l’aide d’une pipette de 5 mL.
    4. Transférer les cellules du tube de 15 mL dans un plat enduit de gélatine et de la culture les cellules pendant 24 h. Culture des cellules marche, comme décrit à l’étape 2.

4. extrait de protéine totale de cellules

  1. Rincer les cellules recueillies avec 1 mL de PBS et puis centrifuger à 800 x g et à température ambiante pendant 3 min.
  2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire soigneusement avec un tampon RIPA additionné de DTT et inhibiteur de la protéase cocktail PMSF par pipetage doucement. Le volume de tampon RIPA est environ 5 fois celle de la cellule de granule.
    NOTE : Effectuer la remise en suspension des cellules sur la glace.
  3. Garder les cellules dans un tampon RIPA pendant 30 min sur glace et centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et stocker les aliquotes à-80 ° C.
  5. Déterminer la concentration de la protéine avec un kit de dosage de protéine de Bradford.

5. extraire l’ADN des cellules et l’ADN condensé dans un nucléoside unique à l’aide d’Enzymes

  1. Recueillir les cellules avec la trypsine, comme indiqué aux paragraphes 3.1.1 et 3.1.2.
  2. Effectuer l’extraction de l’ADN avec un kit de purification de l’ADN génomique suivant les instructions du fabricant.
  3. Stocker l’ADN extrait de tubes à centrifuger 1 mL. Ajouter 100 µL d’eau ultrapure dans le tube à centrifuger et dissoudre l’ADN en pipettant également, environ 15 fois. Déterminer la concentration et évaluer la qualité de l’ADN par la mesure de l’absorbance à 260 nm et 280 nm15. La concentration d’ADN est environ 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg d’ADN dans un système 50 µL de la solution : ajouter 5 µL de 100 mM Tris-HCl solution, pH 7,6 (concentration finale : 10 mM), 2 phosphatase intestinale de U veau, 1 U DNase I, 0,005 U phosphodiestérase du venin de serpent I et 5 µg d’ADN (calculer le volume ajouté selon la mesure concentration d’ADN rouge, ~ 10 µL) dans un tube à centrifuger et augmenter le volume de solution à 50 µL d’eau ultrapure. Incuber le mélange à 37 ° C pendant la nuit. Centrifuger la solution d’ADN digérée à 1 000 g et à température ambiante pendant 1 min recueillir la solution vers le bas des tubes.
  5. Transférer la solution d’ADN digérée provenant des tubes de centrifugeuse dans des tubes d’ultrafiltration (un poids de molécule coupure : 3 kDa) et centrifuger à 13 000 g et 4 ° C pendant 30 min éliminer les enzymes de la digestion.
  6. Préparer les échantillons pour l’analyse 5mC et 5hmC.
    1. Pour une analyse 5hmC : ajouter 36 µL de solution de filtration à une centrifugeuse nouveau tube (1 mL) et ajouter 4 µL de 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-désoxycytidine ([D3]-5hmC) avec la concentration finale de 3 nM.
    2. Pour l’analyse de 5mC : Ajouter 196 µL d’eau ultrapure dans un nouveau tube à centrifuger et ajouter 4 µL de solution de filtration dans le tube (50 fois dilution), en raison de la forte densité de 5mC dans l’ADN génomique. Transfert de 36 µL de la solution diluée dans un nouveau tube à centrifuger et ajouter 4 µL de (5'-(methyl-d3)-2'-désoxycytidine ([D3]-5mC) avec la concentration finale de 50 nM. Utilisation [D3]-5hmC et [D3]-5mC comme étalon interne pour calibrer les 5hmC et 5mC, respectivement.
  7. Transférer la solution d’échantillon aux tubes de mesure et stocker à 4 ° C. Analyser 5mC et 5hmC avec la spectrométrie de masse ultra performant liquid chromatography-triple quadripôle à multiple-reaction monitoring (UHPLC-MS/MS (MRM)) tel que décrit dans un précédent rapport15.

6. analyser 5mC et 5hmC à l’aide de UHPLC-MS/MS15

  1. Mis en place différents paramètres d’analyse 5mC et 5hmC en utilisant le logiciel UHPLC-MS.
    1. Mettre en place une nouvelle méthode. Ouvrez le logiciel et cliquez sur « fichier | Nouveau | Méthode ». Pièce de la boîte de message avec le contenu de « Éditeur de méthode » « Voulez-vous enregistrer les modifications pour la méthode actuelle » et cliquez sur « Non ».
    2. Établir les paramètres de l’échantillonneur. Cliquez sur « Sampler | Le programme d’installation | Injection ». Sélectionnez « Standard injection » et entrez « 5 µL à volume d’Injection ».
    3. Établir les paramètres de la pompe en UHPLC.
      1. Cliquez sur « BinPump2 | Setup » pour établir les paramètres de la pompe. Mettre en place « Flow » à « 0,25 mL/min » et « Arrêter le temps » à « 15 min ».
      2. Mettre en place « Solvant B à 5 % » et les « Limites de pression » au « bar Max 600 ».
      3. Cliquez sur « BinPump2 | Calendrier » pour construire l’isocratique paramètres d’élution pour analyse de 5mC. Cliquez sur « Ajouter » pour ajouter une ligne. Des commentaires « 0.00 » au « Time » et « 5.0 » à « B% ». Cliquez sur « Ajouter » une fois de plus pour ajouter une nouvelle ligne. Entrée « 15.00 » à « Time » et « 5.0 » à « B% ».
      4. Cliquez sur « BinPump2 | Calendrier » pour créer les paramètres de gradient d’élution pour l’analyse de 5hmC. Cliquez sur « Append pour ajouter une ligne. L’entrée de 0,00 à temps et 5.0 à « B% ». Cliquez sur « Ajouter » une fois de plus pour ajouter une nouvelle ligne. Des commentaires « 3.00 » au « Time » et « 5.0 » à « B% ». Cliquez sur « Ajouter » pour un autre 6 fois d’ajouter 6 rangs. Entrée « 3.01 » à « Time » et « 15,0 » à « B% », « 6.00 » à « Time » et « 15,0 » à « B% », « 6.01 » à « Time » et « 100 » « % B », « 10,00 » à « Time » et « 100,0 » à « B% », « 10.01 » à « Time » et « 5.0 » à « B% », « 15.00 » à « Time » et « 5.0 » à « B% » dans l’ordre.
        Remarque : Effectuer l’analyse de 5mC et 5hmC individuellement en raison des conditions de séparation différente de UHPLC.
    4. Établir les paramètres de la température de l’espace de la colonne (TCC) dans UHPLC.
      Cliquez sur « TCC | Le programme d’installation | température (à gauche) » et entrez « 30 ° C ».
    5. Établir les paramètres de la QQQ-SM/SM.
      1. Cliquez sur « MS QQQ | Arrêter le temps | Aucune limite/comme pompe », « Source d’ions | ESI », « temps filtrage | Largeur du PIC : 0,07 min ». Mettre en place « segments de temps : heure de début : 0 » ; « Scan Type : MRM » ; « Valeur Div : ms » ; « Delta EMV (+) : 200 » et « Delta EMV (-) : 0".
      2. Établir les paramètres de surveillance les transitions de 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC et D3-5hmC
        1. Cliquez sur « MS QQQ | Acquisition | Analyse des segments : habiter : 90" ; « Fragmentor : 90 » ; « Énergie de collision : 5 » ; « Cell accélérateur tension : 4 » et « polarité : Positive ».
        2. Entrée « 5mC » à « Compound Name », « 242 » at « Ion précurseur », « 126 » à « Produit Ion » pour l’analyse de 5mC. Cliquez avec le bouton droit et sélectionnez « Ajouter la ligne » ajouter une nouvelle ligne. Entrée « D3-5mC » à « Compound Name », « 245 » at « Ion précurseur », « 129 » à « Ion produit » pour D3-analyse de 5mC.
        3. Un autre supplément trois lignes en utilisant le même mode. Entrée « dC » à « Compound Name », « 228 » at « Ion précurseur », « 112 » à « Produit Ion » pour l’analyse dC. L’entrée « 5hmC » à « Compound Name », « 258 » at « Ion précurseur », « 142 » à « Produit Ion » pour l’analyse de 5hmC. Entrée D3-5hmC au nom composé, « 261 » at « Ion précurseur », « 145 » à « Ion produit » pour D3-analyse de 5hmC.
      3. Établir les paramètres de la source de gaz. Cliquez sur « MS QQQ | Source | Paramètres de la source : Temp de gaz : 300 ° C » ; « Débit de gaz : 11 L/min » ; « Nébuliseur : 15psi » ; « Positif-capillaire : 3500 V ».
      4. Enregistrer la méthode proposée. Cliquez sur « MS QQQ | Instrument | Enregistrer la méthode ». À choisir une voie pour la méthode proposée par « Répertoire » et donner un nom pour la méthode par l’introduction de la teneur en « Méthode », par exemple : analyse 5mC et 5hmC.
  2. Séparation de UHPLC et analyse MS/MS d’oligonucléosides
    1. Préparer la phase mobile pour 5mC et cytosine (C) analyse : former la phase mobile de la solution A et B. Solution A: 500 mL d’eau ultrapure avec 500 µL d’acide formique (concentration finale : 0,1 %) et la solution b : 500 mL de méthanol à 100 %. Mélanger une solution A et B à 95 : 5 (v : v) comme phase mobile pour éluer 5mC et C (définie à l’étape 6.1.3.3). Régler le débit à 0,25 mL/min (définie à l’étape 6.1.3.1).
    2. Préparer la phase mobile par solvant A et B pour l’analyse de 5hmC. Solvant A est de 2,0 mM NH4HCO3 soluté (pH 9,0) (500 mL), et le solvant B est 100 % de méthanol (500 mL). 5hmC séparées par une élution gradient optimisée : 0-3 min, 5,0 % B et 95 % A (v : v) ; 3-6 min, 15,0 % B et 85 % A ; 6-10 min, 100 % B ; 10-15 min, 5,0 % B et 95 % A (définie à l’étape 6.1.3.4). Régler le débit à 0,25 mL/min (définie à l’étape 6.1.3.1).
  3. Utiliser par électronébulisation MS/MS avec mode MRM (défini à l’étape 6.1.5.1) pour analyser l’élution de la colonne et adopter le mode d’ions positifs (défini à l’étape 6.1.5.2.1).
    1. Surveiller les transitions : 5mC, m/z 242→126 (énergie de collision, 5EV) ; [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV) ; dC, m/z 228→112 (5 eV) ; 5hmC, m/z 258→142 (5 eV) ; [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (défini dans l’étape 6.1.5.2.2).
    2. Régler les tensions capillaire et fragment à +3,500 V (définie à l’étape 6.1.5.3) et 90 V (définie à l’étape 6.1.5.2.1), respectivement.
    3. Régler le volume d’injection à 5 µL et analyser chaque échantillon 3 fois (définies à l’étape 6.1.2). Employer les courbes standards correspondantes pour évaluer la quantité de 5mC et 5hmC.
      1. Tracer la courbe d’étalonnage de 5mC : transférer 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentration finale) solution titrée de 5mC dans centrifugeuse tubes et ajouter 50 nM [D3]-5mC à tubes. Supplément au volume total de 50 µL. effectuer l’analyse de 5mC standard en suivant les instructions de l’exemple de 5mC (étape 6).
      2. Construire la courbe d’étalonnage du 5hmC : transfert de 1 à 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentration finale) solution titrée de 5hmC pour tubes de centrifugeuse et ajouter 3 nM [D3]-5hmC aux tubes. Supplément au volume total de 50 µL. effectuer l’analyse de 5hmC standard en suivant les instructions de l’exemple 5hmC (étape 6).

7. analyser la signification statistique

  1. Effectuer l’analyse statistique en utilisant le logiciel.
    1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez « Colonne » dans « nouveau tableau & graphique ». Réglez les paramètres comme suit : « ECHANTILLONS | Démarrer avec une table de données vide » ; « Choisir un mode graphique, le premier » ; « Représentation graphique des répétitions ou des barres d’erreur | Tracer | Dire avec SEM. »
    2. Cliquez sur « Créer » à l’entrée des trois répétitions du groupe contrôle et Vc/PD0325901-traitées à la ligne « A » et « B », respectivement. Sélectionnez les données de six, puis cliquez sur « Analyser » en « Analyse ».
    3. Sélectionnez « testt (et tests non paramétriques) » dans les « Analyses de colonne » et cliquez sur « OK » pour accéder à l’interface suivante.
    4. Réglez les paramètres comme suit : « choisissez test | Nom du test | Test de non-appariés t ; Options | Bilatéral » ; « Les intervalles de confiance : 95 % » ; « Chiffres significatifs | Afficher les 4 chiffres significatifs ». Cliquez sur « OK » pour obtenir la valeur de p entre le traitement de la commande et Vc/PD0325901.
  2. Évaluer la signification statistique entre le contrôle et les groupes employant de l’étudiant à deux points et non appariées t-test16.
    Remarque : p < 0,05 désigne la différence possédant une signification statistique. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

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Representative Results

VC/PD0325901 induite en synergie l’effacement global de cellules ES de souris. Dans le sérum, les cellules de souris ES pièce hyperméthylation de l’ADN, tandis que les cellules pluripotentes ICM et PGC montrent l’effacement global de la méthylation de l’ADN et de l’État hypométhylés est étroitement lié à leur pluripotence9,10.

Auparavant, nous et autres découvrirent que Vc peut améliorer Tet-mediated 5mC déméthylation15,17. Pendant ce temps, 2i s’est avéré aussi pour inhiber la synthèse de novo de 5mC. Dans le contexte de ces constatations, nous avons proposé plus loin la manipulation synergique des cellules ES de souris à l’aide de Vc et 2i ensemble. Après l’analyse de UHPLC-MS/MS, nous avons constaté que Vc et 2i complétée dans le milieu contenant du sérum peuvent réduire considérablement le contenu 5mC de 3,2 à 0,33 100C (perte de 5mC de ~ 90 %) par jour 11 cellules de souris ES (Figure 1 a). En revanche, Vc ou 2i-traitement seul causée seulement 58 % effacement avec le niveau constant à 1,4 % 5mC, soit 61 % de réduction au niveau de 1,3 % 5mC.

Le milieu de 2i se compose de MEK inhibiteur PD0325901 et inhibiteur de la GSK3β CHIR99021. Ensuite, nous examinons quel composant induit la perte globale de 5mC pendant le traitement Co de Vc et 2i. Intéressant, Vc/PD0325901 a entraîné une baisse plus rapide taux de méthylation de l’ADN que Vc/2i. VC/PD0325901 atteint des niveaux de 5mC stable (~0.33% 5mC) après 5 jours, tandis que Vc/2i a atteint un niveau comparable au jour 11. En revanche, le supplément de CHIR99021 supprimée partiellement déméthylation Vc-triggered ADN (Figure 1 a). Ces données suggèrent clairement que PD0325901 en 2i contribue à la globale hypométhylation de l’ADN génomique dans les cellules de souris ES, tandis que CHIR99021 de 2i inhibe partiellement l’effacement de 5mC. Par conséquent, nous croyons que la déméthylation de l’ADN plus rapide induite par le Vc/PD0325901 par rapport à la Vc/2i peut être attribuée à l’inhibition partielle de CHIR99021 sur la déméthylation.

Nous avons supposé que l’effacement global de 5mC dans les cellules ES de souris induite par Vc/PD0325901 peut être partiellement pertinente à l’amélioration de la déméthylation de l’ADN. Par conséquent, nous avons examiné les produits d’oxydation génomiques de 5mC. Il a été signalé que 5mC peut être converti en 5hmC par oxydation catalytique de dioxygénases famille Tet, qui dépendent de Fe (II) et 2-oxoglutarate18,19. Génomique 5hmC peuvent être dilués par la réplication de l’ADN20. En outre, 5hmC peut être encore oxydé par Tet dioxygénases pour produire 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC), qui peut être efficacement excisée par la thymine DNA glycosylase (TMD) pour récupérer la cytosine non méthylé, ce qui indique une active de l’ADN déméthylation21,22.

Conformément aux précédents travaux15, traitement contenant du Vc (Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc, Vc/CHIR99021) augmenté de fréquence de 5hmC (5hmC/106 C) après 1 jour, puis a diminué graduellement des niveaux 5hmC (Figure 1 b) due à la progressivement la réduction 5mC substrat. Notamment, Vc/PD0325901 et Vc/2i a montré le plus rapide cinétique de la perte de 5hmC par rapport à la Vc et Vc/CHIR99021 cause de la réduction plus rapide de 5mC. En outre, nous avons également observé qu’au jour 1, Vc-traitement stimulée par une génération plus de 5hmC par rapport à la Vc/CHIR99021, indiquant que les CHIR99021 en partie supprimé la production induite par le Vc de 5hmC et inhibe la déméthylation de l’ADN. 5hmC perte de traitement 2i devrait être attribuée à la diminution du substrat 5mC. Pris ensemble, ces résultats ont montré que l’activité ADN Vc-enhanced déméthylation en partie contribué à la synergie hypométhylation de co-traitement des Vc/PD0325901 et Vc/2i.

Les deux Habibi et al. 23 et von Meyenn et al. 24 a également signalé que cellules ES souris dans des conditions de 2i a montré global ADN hypométhylation et naïve pluripotence. ont montré des niveaux de 5MC décliner progressivement et atteint un état d’équilibre (5mC ~ 1 %) à 12 à 14 jours après le retour du sérum à 2i. Dans le système de culture Vc/PD0325901, le co-traitement causé plus rapide déméthylation de l’ADN et atteint un niveau stable (0,33 % 5mC) après la supplémentation du Vc/PD0325901 dans un milieu sérum pendant 5 jours, en raison de l’effet synergique du Vc/PD0325901. Le niveau atteint méthylé (0,33 % 5mC) est prononcé inférieur à celui dans des conditions de 2i rapportées par Habibi et al. et von Meyenn et al., tandis que 5hmC taux sont plus élevés en raison de la génération promu au grade de CR.

PD0325901 élevé Prdm14 expression pour réprimer Dnmt3b et Dnmt3l, mais pas Dnmt3a25. Pour étudier l’action de PD0325901 à provoquer une perte de 5mC, une série d’expression de la protéine 5mC a été examinée, y compris la maintenance (Dnmt1) et de novo (Dnmt3a et Dnmt3b) méthyltransférases de l’ADN et leur cofacteur (Uhrf1 et Dnmt3l) et Règlement protéine (Prdm14) 8,9,26. Après analyse par Western blot, Prdm14 fut prononcé élevé en PD0325901, dont la culture (Figure 2). En revanche, Dnmt3b et son cofacteur Dnmt3l a montré considérable vers le bas-règlement d’expression de protéine dans le PD0325901, y compris traitement (Figure 2). CHIR99021 traitement n’a montré ou léger effet sur le niveau de Prdm14, Dnmt3b et Dnmt3l. L’expression de Dnmt3awas n’a pas changé et ne sait pas la cause. En outre, l’entretien ADN méthyltransférase Dnmt1 et son facteur de ciblage Uhrf1 a également ne montrent aucune modification et les données y figurent pas.

Des études récentes indiquent que les Prdm14 peuvent recruter polycomb 2 complexe répressif (PRC2) à certains promoteurs de gènes pour réprimer leur expression, par exemple les méthyltransférases de l’ADN de novo (Dnmt3a et Dnmt3b) et leur cofacteur (Dnmt3l) et contribue à maintenir l’hypométhylation sous 2i conditions8,27. Nos données ont révélé que PD0325901 élevé le niveau d’expression de Prdm14 d’inhiber Dnmt3b et Dnmt3l et réduit la synthèse de novo de 5mC génomiques par le mécanisme.

Pour explorer le maintien de la pluripotence des cellules de souris ES conditions Vc/PD0325901, ARNm de l’expression de plusieurs facteurs liés à la pluripotence de noyau ont été examinés, et ces facteurs ont été confirmés à jouer un rôle vital dans la pluripotence28. Analyse PCR en temps réel constaté que Oct4, SOX2, Esrrb et Sall4 ont montré des niveaux d’expression uniforme à travers 5 jours de traitement avec Vc/PD0325901 contrairement à la culture de sérum (Figure 3 a). Nanog et Tcf3 a augmenté de 1,3 et 1,6 fois, respectivement. En revanche, Klf4 montre 42 % vers le bas-règlement et Rex1 diminuait seulement environ 12 %. Ces résultats suggèrent que Vc/PD0325901 cotraitement provoquent des modifications diverses dans l’expression des facteurs de pluripotence ; Toutefois, Oct4 et SOX2, les plupart des facteurs de base, maintenu des niveaux presque constants d’expression.

Ensuite, un test de la phosphatase alcaline (PA) a été réalisé afin de déterminer si des cellules de souris ES étaient dans un État indifférencié ou différencié. Photos de cellules (Figure 3 b et 3C) ont été extraites d’une caméra connectée à un microscope inversé avec amplification de 10 fois par un porte-objectif. Après culture continue de 26 jours dans un milieu sérum Vc/PD0325901-ajoutés, les cellules de souris ES a montré la morphologie homogène. En outre, presque toutes les cellules ont été colorés violet-noir et présentaient un état semblable au ballon sans excroissance (Figure 3), montrant un État indifférencié. En revanche, dans des conditions de sérum, une partie des cellules au jour 26 souris ES étaient violet-noir après coloration et avaient un état semblable au ballon dans la morphologie, d’autres présenté selon la couleur de la lumière avec multiplicateur marquée par des ovales blancs pointillés (Figure 3 b) ; Cela indique que les cellules de souris cultivées en sérum ES sont hétérogènes en morphologie et ├á le ├⌐tat de pluripotentes, ce qui est conforme aux précédents rapports13. Collectivement, les données prises en charge que le PD0325901 en combinaison avec Vc pourra maintenir excellente morphologie et un État indifférencié dans les cellules ES de souris.

Figure 1
Figure 1 : Vc/PD0325901 synergie induit l’effacement global de cellules de souris ES génomiques 5mCin. (A) 5mC fréquence (5mC/C) et (B) 5hmC fréquence (5hmC/C) temps-dépendant changement lors d’un traitement de 26 jours d’un supplément continu avec Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 ou Vc/CHIR99021 en contenant du sérum moyen. Barre d’erreur montre l’écart-type (SD) de trois analyses répétées par UHPLC-MS/MS. C: cytosine. Ce chiffre a été modifié par Li et al. 25. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’altération d’expression de protéine de Prdm14 et ADN méthyltransférases (Dnmt3a, Dnmt3b et Dnmt3l). Les bandes présentés (de gauche à droite) ont été obtenues grâce à un traitement de 5 jours de culture de sérum (contrôle), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 et Vc/2i, respectivement. L’expression de 14 par est régulée et Dnmt3b et Dnmt3l ont diminué après la PD0325901, dont la culture. Dnmt3a exposé sans changement. Β-tubuline a été définie comme une référence interne. Con : Contrôle ; PD : PD0325901 ; CH : CHIR99021. Ce chiffre a été modifié par Li et al. 25. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Vc/PD0325901-induced altération dans l’expression de l’ARNm de gènes pluripotentes et dans l’activité de la phosphatase alcaline. (A) l’ARNm niveau des gènes pluripotentes partielle a été modifié par un traitement de 5 jours de Vc/PD0325901 par rapport à celle dans des conditions de sérum (contrôle). Données étaient représentées en moyenne ± SD La signification statistique a été évaluée et p < 0,05 était statistiquement significative. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 et ns représentent non significative. PD : PD0325901. Souris ES cellules dans le sérum pendant 26 jours (B) ont montré l’excroissance partiel marqué par des pointillés blancs ovales, tandis que le milieu de sérum Vc/PD0325901-ajout maintenu morphologie grande et un État indifférencié (C). Ces images ont été acquis d’un microscope inversé connecté avec une caméra dans le champ lumineux. Ce chiffre a été modifié par Li et al. 25. échelle bars = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans le travail, nous avons démontré une méthode originale de combiner Vc et PD0325901 afin de soutenir des cellules de souris ES à un État indifférencié et hypométhylés, qui a été réalisé par une action synergique favorisant la déméthylation de l’ADN par CR et la suppression de novo de l’ADN méthylation de PD0325901. En outre, souris ES cellules montrent morphologie grande sous le système de culture Vc/PD0325901.

Afin de mieux soutenir l’état de cellules de souris ES dans le système de culture Vc/PD0325901, il y a quelques étapes cruciales. Tout d’abord, FBS lots doivent être préapprouvées pour trouver et stock les meilleurs lots ; en outre, remplacement fréquent du sérum est préjudiciable à la prolifération des cellules et au maintien de la pluripotence. Deuxièmement, éviter sur cellules pipetage au cours de la dissociation des colonies cellulaires à une suspension de cellules du même au stade de passage de la cellule. Troisièmement, pour atténuer les effets négatifs de la trypsine pendant la culture cellulaire, la trypsine doit être enlevée immédiatement après qu’il couvre les cellules dans les plats pendant le passage de la cellule. En outre, le milieu de culture Vc/PD0325901 doivent être remplacé tous les jours en raison de l’instabilité du CR.

Par rapport à la culture classique de sérum, cellules de souris ES conditions Vc/PD0325901 montrent une population plus homogène de cellules (Figure 3 b, C) et un état de hypométhylés, qui ressemble à l’ICM et PGC. En outre, par rapport à la culture de 2i récemment développés, notre méthode peut réaliser l’hypométhylation avec une cinétique plus rapide, et l’utilisation d’un inhibiteur d’unique (PD0325901) réduit la quantité d’entrée de DMSO, diminuant ainsi les dommages aux cellules. Toutefois, en raison de l’ajout de FBS dans notre système de culture, les actions doubles ambivalentes de FBS peuvent provoquer la différenciation cellulaire au cours de la culture à long terme. Dans l’ensemble, ce système de culture roman est adapté pour l’entretien et l’expansion à grande échelle des cellules ES de souris.

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Disclosures

Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt potentiel.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (21435008 et 21327006 à H.W.) et le programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDB14030200 à H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

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References

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