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电化学 DNA 生物传感器检测食源性致病菌的研究进展

Bioengineering

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Summary

本文提出了一种电化学 DNA 生物传感器的研制方案, 包括聚乳酸稳定、金纳米粒子修饰、丝网印刷碳电极检测副溶血性弧菌

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Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

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Abstract

副溶血性弧菌 (副溶血性)是一种常见的食源性致病菌, 在全球范围内造成很大比例的公共卫生问题, 严重影响人类死亡率和发病率。常规的检测v. 副溶血性的方法, 如基于文化的方法、免疫学化验和基于分子的方法, 需要复杂的样品处理, 耗时、繁琐、费用高昂。近年来, 生物传感器已被证明是一种有前景的综合检测方法, 具有快速检测、性价比高、实用性强等优点。本研究的重点是利用 DNA 杂交原理开发一种快速检测具有高选择性和灵敏度的v. 副溶血性方法。在工作中, 采用 x 射线衍射 (XRD)、紫外可见光谱 (紫外-可见光)、透射电镜 (TEM)、场发射等方法, 对合成聚乳酸稳定金纳米粒子 (PLA-AuNPs) 进行了表征。扫描电镜 (FESEM) 和循环伏安法 (CV)。并对 PLA-AuNPs 的稳定性、灵敏度和重现性进行了进一步的测试。研究发现, PLA-AuNPs 在水溶液中形成了稳定纳米粒子的良好结构。我们还观察到, 由于较小的电荷转移电阻 (Rct) 值和活动表面积 (0.41 厘米2) 的增加, 灵敏度得到了改善。我们的 DNA 生物传感器的发展是基于对 AuNPs 和以亚甲基蓝 (MB) 为氧化还原指标的丝网印刷碳电极 (SPCE) 的改性。用差分脉冲伏安法 (DPV) 对固定化和杂交事件进行了评估。我们发现, 互补, 非互补, 和不匹配的寡核苷酸是专门区分的捏造的生物传感器。它还显示了对各种食物传播病原体的交叉反应性研究和在新鲜的蛤中鉴定v. 副溶血的可靠敏感检测。

Introduction

近年来公众和科学争论的一个主要话题, 食物中毒主要与3剂有关: 微生物1、化学试剂2和寄生虫3。受污染的食物会对人类造成严重的健康后果, 特别是在免疫系统薄弱、老年人、孕妇、婴儿和年幼儿童的高危人群中,4。由于非洲、亚洲和拉丁美洲5岁以下儿童每年发生100万多例急性腹泻, 食物中毒是全球主要疾病5,6 , 世界卫生组织已建立微生物作为最重要的贡献者7副溶血弧菌在最广泛公认的毒株中脱颖而出。通常在沿海、河口和海洋环境中发现8, 它是一种革兰阴性菌, 在高盐环境中活跃, 在未充分烹调、处理不当或未加工的海洋中进食时引起严重的人胃肠炎。产品9。此外, 一些人现有的医疗条件使他们容易受到伤口感染、败血症或耳部感染, 这是由v 副溶血10引起的。溶血素的毒力因子可分为两种类型, 分别为致病致病机制: TDH 基因编码的耐热直接溶血素 (TDH) 和 trh 基因11编码的 TDH 相关溶血素. 在临床标本中, 而不是在环境标本中, tdh 的毒力标志物 (trh 基因) 主要表现为副溶血性。

v. 副溶血性具有在广泛的条件下生存的能力, 迅速响应环境变化12。它的增殖机制随着细胞质量的增加, 其毒性也随之增大13, 从而提升其危险电位。更糟糕的是, 气候变化给这些细菌提供了充足的条件来加速他们的细胞数量增长14。由于其频率高, 需要在食品供应链上对v. 副溶血性进行监测, 特别是在海鲜的贸易和生产方面, 因为这些产品在很大数量上被发现,15,16在世界各地。目前, 细菌的识别和隔离使用了一系列的方法, 包括生物化学试验, 浓缩和选择性培养基17, 酶联磁吸附剂检测 (ELISA)18, 脉冲场凝胶电泳 (PFGE)19、乳胶凝集试验和聚合酶链反应 (PCR) 测试20。这些方法通常需要合格的人员, 先进的仪器, 和费力的技术, 没有立即提供污染的信息。这严重限制了及时检测有害污染和现场应用的可能性。快速检测工具仍然是一个突出的挑战。

生物传感正在成为检测食源性病原体的一个有希望的选择, 因为它提供了节省时间、经济高效、实用和实时分析方法 21, 22, 23, 24.然而, 尽管在尖刺样品和使用生物传感器的标准溶液中分析物检测有许多积极的结果, 但在水混合物或有机萃取物中, 仍缺乏对实际样品的研究25。最近, 利用直接和/或间接脱氧核糖核酸 (DNA) 检测的电化学生物传感器在科学家中得到了越来越多的关注, 因为它们通过杂交事件对互补靶的具体检测26,27,28,29. 与基于酶的生物传感器相比, 这些独特的方法更加稳定, 从而为小型化和商业化提供了一个有前景的技术。这项研究的目标是构建一个快速的工具, 能够检测出具有高选择性、灵敏性和实用性的、基于 DNA 序列特异性的杂交法. 识别策略包括聚乳酸稳定的金纳米粒子 (PLA-AuNPs)30和丝网印刷碳电极 (SPCEs) 在存在杂交指示剂, 亚甲基蓝 (MB)。利用细菌 DNA 裂解液和新鲜的蛤样, 进一步探讨了所研制的检测结构的潜力。

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Protocol

注: 所有使用的化学药剂和生化试剂均应采用分析级, 无需进一步纯化。使用无菌去离子水制备所有溶液。灭菌前的所有玻璃器皿。

警告: 在进行实验室活动时, 请使用所有适当的安全做法, 包括使用工程控制 (油烟机、glovebox) 和个人防护设备 (安全眼镜、手套、实验室大衣、全长长裤、闭合脚趾鞋)。

1. 用 PLA-AuNPs 修饰电极的制备与表征

  1. PLA-AuNPs 的制备与表征
    1. 快速添加10毫升柠檬酸钠溶液 (38.8 毫米) 到100毫升的沸腾水四氯金酸溶液 (1 毫米), 并冷却到周围温度。观察准备好的 AuNPs 溶液中的颜色变化, 开始为黄色, 变黑, 最后作为暗红宝石红色。
    2. 将 PLA 颗粒放入不锈钢模具中进行熔化, 并在温度为190摄氏度时将其预热10分钟. 按照按下的程序: 将其置于 2.2 MPa 的压力下, 作为 PLA 板料制备的一部分。在冷却大约3小时后, PLA 板将准备就绪。
    3. 在室温下搅拌, 在5毫升氯仿中溶解0.68 毫克的 PLA 片。将溶解的 PLA 与先前制备的 AuNPs 溶液的10毫升混合, 在室温下均匀搅拌。均匀的混合物可以表示为 PLA-AuNPs, 其特征是使用紫外可见光、XRD、TEM 和 FESEM EDX。
  2. 改性丝网印刷炭电极的制备与表征
    注: 本研究使用的 SPCE 包括三电极系统: 计数器电极、碳工作电极和银/AgCl 参考电极。
    1. 快速吸管25µL 的均匀溶液的 AuNPs 到 SPCE, 然后空气干燥24小时之前使用。
    2. 电化学特征的修饰电极, SPCE/PLA-AuNPs, 在氰化钾 (K3[Fe (CN)6]3-/4-), 以测量有源表面积, 电化学阻抗谱, 重复性,重现性和稳定性30

2. 电化学 DNA 生物传感器的研制

  1. 探头准备
    注: ssDNA 探针和互补 DNA 序列是根据国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库的信息选择的。
    1. 购买合成寡核苷酸 (20 ssDNA 探针, 20 的互补 dna, 20 不匹配的 dna, 21 的非互补 dna) 作为冻干粉从商业实验室, 根据以下序列:
      thiolated ssDNA 探针: 5′-/5ThioMC6-d-/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3′
      补充 DNA: 5′-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3′
      单基地不匹配 DNA: 5′-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG 3′
      三基不匹配的 DNA: 5′-CAGTGCTTCT ĊṪṪTAATCCG 3′
      非互补 DNA: 5′-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3′
    2. 用无菌 TE 溶液 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 7.5) 制备所有寡核苷酸 (100 µM) 的库存溶液, 分为分析部分。保持这个在-4 摄氏度, 然后做适当的稀释在使用之前。
  2. 固定化与杂交的优化
    注: 用 pla-AuNPs 修饰的 SPCE, 以 SPCE/PLA-AuNPs 为研究对象, 采用滴注法进行 DNA 固定化和杂交。
    1. 首先, 固定25µL 的 thiolated ssDNA 探针 SPCE/pla AuNPs, 然后空气干燥24小时室温, 然后它将最后被称为 SPCE/解放军-AuNPs/ssDNA。用三因素确定固定条件的优化: ssDNA 的浓度 (从0.2 到1.4 µM), 时间 (从30到210分钟不等), 温度 (从25到75摄氏度不等)。
    2. 吸管25µL 的补充 DNA 的表面上 SPCE/解放军-AuNPs/ssDNA 进行杂交事件后, 它可以最后被称为 SPCE/解放军-AuNPs/dsDNA。通过两个时间因素 (从5到30分钟不等) 和温度 (范围从25到75°c) 确定杂交条件的优化。
    3. 将固定化和杂交电极浸泡在20µM MB 30 分钟内, 通过洗涤0.5 米 ABS/20 毫米氯化钠 (pH 4.5) 去除非特异吸附的 DNA 和过量 MB, 然后用去离子水冲洗。使用 DPV 技术测量 MB 还原的峰值电流。使用不含指示器的0.1 米 PBS (pH 7) 执行 DPV 测量。
  3. 制备 DNA 生物传感器的特性研究
    1. 浸泡 SPCE/解放军-AuNPs 在20µM MB 30 分钟, 洗0.5 米 ABS/20 毫米氯化钠 (pH 4.5), 然后用去离子水冲洗之前测量。对所有的相互作用, 包括探针 dna, 互补 dna, 不匹配的 dna 和非互补的 dna 样本, 遵循类似的程序。
    2. 测量电化学还原。
      注意: 我们用一个商业制造的 Autolab 与接口软件测量 DPV。
      MB 电化学还原的 DPV 测量在可能范围从-0.5 v 到 0.25 v 进行, 具有 0.005 v 的步长电位, 调制振幅为 0.05 V, 以及 7.73 M PBS (pH-1) 中0.1 个 mv7的扫描速率, 不含指示器。进一步研究了制备的 DNA 生物传感器的选择性、灵敏度、重现性和热稳定性。报告的结果作为平均价值测量被提出了三复制。

3. 用真实样品验证制备的 DNA 生物传感器

  1. 细菌菌种的制备
    1. 根据海鲜的严重污染, 选择细菌样本31,32
      注:副溶血性为参考菌株和其他8株细菌 (空肠弯曲菌、李斯特氏细胞增生症、沙门氏菌伤寒沙门氏菌肠炎克雷伯杆菌肺炎、本文研究了常见食源性致病菌的大肠杆菌 O157:H7、蜡样芽孢杆菌弧菌携带溶藻) 的电化学 DNA 生物传感器验证。
    2. 每两周在各自琼脂上进行细菌菌株的例行亚文化以保持其生存能力, 请参阅表 1中的区域性条件。
    3. 保持长期保存的细菌菌株在其各自生长的汤含有 20% (v/v) 甘油在-80 摄氏度, 因为甘油保护细菌, 防止冰晶体的形成, 可以破坏他们在冻结过程中。其次, 将甘油类中保存的细菌细胞培养循环接种到各自的汤中。在需要恢复细菌时, 根据各自的生长时间和温度孵化汤。
    4. 使用扩展板技术 (33) 确定v. 副溶血性细胞的数量, 这是一种用于列举一系列稀释的微生物的标准和众所周知的方法。
      1. 文化v. 副溶血在胰酪胨大豆汤 (3% 氯化钠) 在37°c 在 140 rpm 震动情况。然后, 将细菌细胞培养的1毫升转化为9毫升的3% 氯化钠, 以获得 10-1稀释因子。
    5. 重复此步骤九次以获得多达10个-10稀释因子的完整系列。接下来, 分别将每个稀释因子的0.1 毫升 (从 10-1到 10-10) 传播到一个弧菌的选择性琼脂板上进行菌落计数。孵化的板块孵化在37°c 24 小时。
    6. 使用蚁群计数器计算单个菌落数, 然后返回计算 (计数 CFU/pipetted 量 x 稀释因子) 以获得每毫升密度的菌落形成单位 (CFU mL-1)。从 CFU mL-1的定标图中获得菌落形成单元 (CFUs) 在细菌细胞悬浮液中的浓度。
  2. PCR 法的制备
    1. 在经过改良的煮沸裂解过程中提取基因组 DNA34。首先, 对琼脂培养基上的单个细菌株进行条纹, 并将其接种在肉汤培养基中, 然后在其相对生长条件下孵化, 140 rpm 震动状态。
    2. 将1毫升的肉汤培养成微离心管。离心机这在 4830 x g 和4°c 为1分钟获得药丸。使用约500µL 的无菌 TE 缓冲器, 以重新悬浮与颗粒。在加热块中按住所产生的悬浮10分钟, 在98到2摄氏度, 并立即冷却它在-18 摄氏度为10分钟溶解细胞和释放 DNA。
    3. 离心机的基因组 DNA 在 4830 x g 和4°c 3 分钟, 以获得明确的悬浮和保持在-20 °c 的上清, 进一步使用。使用 biophotometer 测量与紫外线吸收在波长260毫微米 (作为核酸吸收波长的光) 并且在波长280毫微米 (作为蛋白质吸收波长的光) 确定提取的浓度和纯度基因组 DNA, 然后用标准生化化验方法确定所有菌株35并通过 16S rRNA 基因序列36进行验证。最后, 变性基因组 DNA 在92°c 2 分钟, 并在冰水中迅速冷却, 然后再应用到生物传感器。
    4. 通过 PCR 对 toxR 基因的靶向进行进一步确认. 使用底漆对 (5 '-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 ' 和 5 '-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3 ') 在 thermocycler 中执行此过程。优化 PCR 放大的总反应量25µL 由不育水 (15.5 µL), 缓冲器 (5 µL), 底漆 (1 µL, 10 µM), dNTP 混合 (1 µL), dna 模板 (2 µL), Taq dna 聚合酶 (0.2 µL, 10x)。
    5. 混合的成分, 并安排 PCR 放大的目标序列在 thermocycler 30 周期的放大程序。在我们的研究中, 每个周期包括三步反应i. e., 初始变性 (94 °c, 3 分钟), 其次为30循环变性 (94 °c, 1 分钟), 退火 (63 °c, 1.5 分钟) 和延伸 (72 °c, 1.5 分钟), 后跟最后的延伸 (72 °c, 7 分钟)。
    6. 通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳法测定扩增产品及其尺寸。用商业制作的凝胶文件系统捕捉凝胶图像。
  3. 蛤皮样品的制备
    1. 获取新鲜样品。
      注: 我们的新鲜的蛤 (Anadara 蚶) 是从雪兰莪沙登训练班的湿市场获得的, 并迅速带到实验室的冰冷却箱进行分析。将样本分成2组, 即被治疗和未处理的组, 假设在收割开始时, 它们会均匀地收获, 直到放入冷库。
    2. 在治疗组中, 先将其贮存在-20 摄氏度, 24 小时, 然后在 DNA 提取前, 在20摄氏度的紫外线照射下, 进行4小时的治疗。
      注: 用于对照组的冷冻温度和紫外线照射会杀死或至少限制在蛤中自然积聚的v. 副溶血。在本研究中, 不要采用更高的巴氏杀菌70摄氏度, 目的是模拟新鲜的蛤的实际情况。同时, 直接从未经治疗的组中分析样品, 一旦到达实验室就不进行任何预处理。
    3. 亚文化系一种v. 副溶血性 ATCC 17802 的菌株 (3% NaCl)。通过在 CA 上适当稀释 (3% NaCl), 确定接种中可行细胞的水平, 以获得接种 104 CFU mL-1 v. 副溶血性。在冷凝水中清洗每一个蛤, 然后在层流柜中使用无菌钳将其从外壳中取出, 然后将其擦洗干净。
    4. 六十年代, 在90毫升无菌的融汇 (3% NaCl) 中, 对10克的蛤皮组织样品进行了测定. 将已知量的v. 副溶血性添加到9毫升的匀质样品汤中。将 unspiked 示例用作负控制。估计v. 副溶血性的细胞计数通过电镀0.1 毫升样品在 CA, 并且随后, 吹打1毫升样品入离心管为脱氧核糖核酸样品提取, 将被使用在生物传感器和 PCR 试验。
    5. 在经过改良的煮沸裂解过程36后从尖刺和 unspiked 样品中提取出v. 副溶血性的基因组 DNA。最后, 确定 DNA 浓度和纯度的生物光度测量与紫外线吸收在波长 260 nm (作为核酸吸收波长的光), 也在波长 280 nm (作为蛋白质吸收波长的光)。

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Representative Results

通过柠檬酸钠的水溶液的颜色变化, 揭示了 AuNPs 的形成。这使颜色从淡黄色变为深宝石红色。从紫外可见光谱 (图 1) 中证实了 PLA-AuNPs 的产生, 其中表面等离子体共振 (SPR) 峰值的增长约为 540 nm。AuNPs 的形成和存在是在 500-600 nm 波长范围内, 这取决于粒子大小37。AuNPs 和 PLA-AuNPs 的 XRD 模式显示在图 2中。在31.7、38.2、44.4、64.7 和77.7°的2θ观察到所有的晶尖峰。它们归因于 (100) (111) (200) (220) 和 (311) 立方 FCC (面中心立方) 金 (金属) 纳米结构的晶体平面 (JCPDS 文件 no.-00-004-0783)。pla-AuNPs 微晶峰强度也随31.7°的衍射峰的增大而增加, 这意味着 AuNPs 嵌入在 PLA 中, 表明多相金纳米结构的形成为38。此外, 在 PLA-AuNPs 上显示的所有 AuNP 衍射峰都表明 AuNPs 具有稳定的结构。用谢瑞方程 (L = kλ/βcosθ) 计算了 PLA AuNPs 的平均尺寸, 通过确定布拉格反射的宽度 (100)。从 FWHM 和 d 间距 (表 2) 中, AuNPs 的晶粒尺寸计算为 27 nm。

利用 TEM 对 PLA-AuNPs 的尺寸及其形貌进行了进一步的研究。从透射电镜粒子分布曲线和聚乳酸 AuNPs 的图像来看, 金纳米粒子的形状几乎呈球形 (图 3)。纳米粒子的大小在大约 37 nm 的范围内, 比从谢瑞的公式中得到的略大, 这表明合成纳米粒子的多晶性质为39。与 TEM 相比, x 射线衍射更小的尺寸也在以前的研究中被观察到, 很可能是因为粒子结构在自然界中是多晶的, 因为大量的晶粒较小 (子粒子)40.图 4显示了 SPCE 上已准备好的 PLA AuNPs 的 FESEM 图像。从 FESEM 图像和 EDX 谱可见, SPCE/PLA-AuNPs 具有最高的重量百分比的黄金, 最大的密度, 和最大表面的纳米粒子覆盖。还可以特别指出的是,图 4(a) 显示了裸 SPCE 的 FESEM 图像。图 4(b) 中的 FESEM 图像显示了分布良好的 PLA AuNPs。为了确认合成的 pla-AuNPs 的化学成分, EDX 被用来调查所生产的 pla AuNPs 的化学成分, 如图 4(a) 4(b)。EDX 谱证实, 所生产的 PLA-AuNPs 仅由金 (Au) 组成, 除了与碳 (C) 和氧 (O) 相对应的峰值外, 没有显示其他元素。C 峰的存在是由于碳电极上的样品被丢弃。

EDX 谱也显示了 O 的存在, 表明氧气被吸附在碳电极上, 因为薄膜暴露在空气中。这证实了氧气是吸附在碳纳米管, 如果他们暴露在空气中很长一段时间41。虽然空气中有各种气体分子, 但据信氧是空气暴露的碳纳米管的主要吸附42, 可能是由于其吸附速度比其他分子43快。这是基于发现氧气是碳电极上的主要吸附在夜间空气暴露在样品准备和加强了 PLA-AuNPs 的化学纯度。阳极和阴极峰值 (ipa/ipc) 的比率几乎为 1, 随着扫描速率的增加44, 这给出了恒定的峰值电位。此外, 阳极和阴极峰值电位在不同的扫描速率下是一致的45表明电化学反应是基于峰值分离的可逆 (图 5)。用 Randles-Sevick 方程 (ipc = (2.69×105) n3/2 AD1/2 Cv1/2, 计算了修饰电极的有效表面积。从绘图 ipcv1/2图 5(a) 和(b) 的倾斜, 电极的表面积被计算为0.26 厘米2和 0.41 cm 2为裸露的 SPCE 和解放军-AuNPs, 分别。结果表明, 与裸 SPCE 相比, PLA-AuNPs 在活性表面积上的改善效果相对较高。所得结果与高分子嵌入金纳米粒子 (β-埃多斯 (n-[3-(trimethoxysilyl) 丙基] 乙烯-二胺基体封装的金纳米粒子) 相媲美, 表明高活性表面积增强了电子传输, 因此产生了更好的灵敏度46

改性 SPCE 电化学反应是在控制扩散过程中, 由 K3[Fe (CN)6]3-/4-峰值电流的减少所示, 这反过来又依赖于扫描速率平方根的当前 (v1/2)。为了更好地了解改性电极的性能, 本文进行了电化学阻抗谱 (EIS) 的研究, 与修正后的电极在 CV 测量中的性能相关。高频率下的半圆剖面与 EIS 中电子传递的极限过程相关。电荷转移电阻 (Rct) 直接测量为半圆的直径。这一结果与裸 SPCE 的 Rct的值吻合, 它是1932ω, SPCE/PLA-AuNPs 的修改减少到1444ω (图 6)。SPCE/PLA-AuNPs 中 Rct值的减少可能是由于本地介电常数和/或电双层47的厚度增加造成的, 这表明 K3[Fe (CN)6]3-/4-在金属/解决方案界面上吸附作用。这些输出符合来自 CV (图 7) 的测量结果。利用 PLA-AuNPs 对 SPCEs 进行修正后, 峰值电流逐渐增加, 这表明较高的灵敏度是下 Rct48的逆。因此, 修改后的电极 CV 值的增加和 Rct值的下降可能是由于水分子的逐渐更换 (水分子的体积是27.19 Å3), 通过吸附 K3[Fe (CN)6]3-/4-在金属表面上, 降低溶解反应的范围49

表 3指示修改后的电极的重复性和可重复的相对标准偏差 (RSD)。常规 CV 记录 K3[Fe (CN)6]3-/4-为六个连续集进行了研究, 以调查修改后的电极的重复性。SPCE/解放军-AuNPs 的 RSD 为4.26%。AuNPs 改性电极经过多次测量后, 得到了较好的 RSD。另外, 采用相同的工艺, 对六种修饰电极进行了独立制备, 给出了 SPCE/pla-AuNPs 的 RSD 值 4.05%, 表明了 AuNPs 电极制备的较好重现性。根据 PLA-AuNPs 的修改后的基底在延长的持续时间内保持在37摄氏度。它还用于记录20周期和减少18% 的信号质量。为了实现生物传感器的最大输出, 对固定期、温度、ssDNA 浓度和杂交标准进行了研究。这些条件需要优化, 因为它们影响 DPV 的峰值电流。为了优化 ssDNA 浓度, SPCE/PLA-AuNPs pipetted 了不同浓度 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 µM) ssDNA 的60分钟, 从而确定了 ssDNA 的最佳浓度。基于图 8, 当使用较高的 DNA 浓度时, DPV 峰值电流增加。研究还发现, DNA 的优化浓度为1.2 µM ssDNA。

为了优化 SPCE/PLA-AuNPs 单链 DNA 的固定周期, 在不同时间 (30、60、90、120、150、180和210分钟) 对 ssDNA (1.2 µM) 的25µL 进行了试验。在图 9中, 研究结果显示, 固定期的增加导致 DPV 峰值电流持续增加。因此, ssDNA 的最佳固定时间选择为180分钟。为了优化固定温度, SPCE/PLA-AuNPs 在不同温度 (75、65、55、45、35和25°c) pipetted ssDNA (1.2 µM) 为180分钟。我们发现, 当固定温度增加到55摄氏度时, DPV 峰值电流最初升级后随后出现折旧 (图 10);因此, 55 °c 被选择作为优选的固定化温度将使用在随后实验中。从电极表面不动的 ssDNA 分离和杂交致残是由温度升高引起的。其他报告也有类似的结果50。更快速的分裂和退化的 DNA 从表面的金纳米粒子发生在较高的温度51。最近进行的研究报告说, 金和硫醇氧化的结合在环境中快速地降解, 例如当暴露在水、空气和光52,5354。本文还对杂交时间的影响进行了研究。

在不同杂交时间 (5、10、15、20、25和30分钟), 制备的 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 是以靶 DNA (0.2 µM) 的方法进行降铸的。DPV 的反应明显上升, 孵化时间增加了5分钟 (从5到10分钟) (图 11)。一旦获得这个值, 就观察到了10到30分钟的向下模式, 所以选择了理想的杂交时间为10分钟。杂交效率随温度的升高而增加, 从25°c 到35摄氏度 (图 12)。高电流被认为在温度高于35摄氏度时会慢慢减少。原因是夹层结构变性减少了检测信号。因此, 选择的最佳杂交温度为35摄氏度。我们用于检测v. 副溶血性的过程包括 AuNPs, 以增强工作电极的活动表面积, PLA 调解表面改性和氧化还原络合物, MB, 以减少到磅。这种氧化过程的结果是 ssDNA 和 MB55之间更好的亲和力。在 ssDNA 杂交过程中, 随附 MB 分子数量减少, DPV 电流随其互补序列的增加而降低。

我们对已开发的生物传感器的性能进行了进一步的调查。图 13中的 DPV 结果表明, 它能够有选择地区分探针 DNA、互补 dna、单基不匹配的 dna、三基不匹配的 dna, 以及 MB 作为检测标签56的非互补 dna,57. 最低峰值电流 (0.73 µA) 是由互补 dna 显示的, 它由一基不匹配的 dna (0.94 µA)、三基不匹配的 dna (1.05 µA)、非互补 dna (3.25 µA) 和探针 DNA (4.79 µA) 慢慢增加。目标 DNA 电流是寡核苷酸序列中最小的电流, 允许我们的生物传感器敏感地和具体地区分寡核苷酸序列。MB 与固定探针 DNA ssDNA 紧密绑定, 产生大 DPV 峰值电流。SPCE/解放军-AuNPs/非互补 dna 减少了固定探针 dna 电流的几乎一半, 只有少量 MB 组装在表面的 SPCE/解放军-AuNPs/dsDNA。这很可能是由于 MB 和鸟嘌呤基地之间无法接触的相互作用。dna 和 MB 的相互作用模式强烈依赖于诸如 pH 值、温度、DNA 浓度、离子强度和缓冲类型5859等实验条件。MB 通常通过 groove 和 intercalative 模式链接到 dsDNA, 从而在 dsDNA 表面60上产生 MB 累积。我们的捕获探针 dna 暴露在一个基地不匹配的 dna 和三基不匹配的 dna 持续减少 DPV 峰值电流和互补目标 DNA 继续这种趋势。表 4显示了 MB 峰值电流的选择性速率百分比。我们的总体发现是, 人工 dna 生物传感器的杂交是高度选择性的, 通过固定探针 DNA 在 SPCE/解放军-AuNPs 的表面上。

研究了不同浓度的互补靶寡核苷酸对 DNA 生物传感器的敏感性。图 14描述了随着补充 DNA 浓度的增加, SPCE/PLA-AuNPs 上 DPV 峰值电流逐渐耗尽。图 15展示了一个线性回归系数 0.96, 它是在减少的 MB 峰值电流的对数和目标 DNA 数浓度的对数 (0.2 pM 到0.02 毫米) 之间生成的。使用 3σ/m 公式 (σ为空白解的标准偏差, m 为线性曲线的斜率) 绘制了峰值电流变化图 (ΔP)61,62,63。计算了制备的 DNA 生物传感器的检测限为 4.43 pM, 比我们最小的实际实测样品高。这一结果与 0.2 pM 和下午2点 (2.65×10-6 a 和 2.81×10-6 a) 的标准偏差 (分别为 1.19×10-7 a 和 1.06×10-7 a) 的ΔP 一致。

为了计算制备的 DNA 生物传感器的 loq 矿用, 我们采用了 10σ/m 公式 (σ是空白解的标准偏差, m 是线性曲线的斜率), 发现结果为 14.8 pM 的增益。重复变性的补充 dna 进行评估 dna 生物传感器的再生能力方面。我们这样做是通过孵化0.2 µM 互补 dna 修饰电极在热水中86摄氏度8分钟变性双链 dna, 其次是在冰浴快速冷却, 以维持变性单链 dna64

在8的再生努力 (n = 5, RSD = 4.05%) 后, 杂交活性维持在最初反应的91%。基于 SAM 方法的 dna 生物传感器固定在 SPCE/PLA-AuNPs 的 dna 探针上, 稳定性高, 在重复变性过程中对补充 DNA 的检测具有良好的反应。进一步探讨了 DNA 生物传感器对热的稳定性。为此, 我们将 PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA 电极储存在温度为4摄氏度、25摄氏度和45摄氏度的密封铝袋中, 含有硅胶。在6月结束时, 我们评估了互补 DNA, 估计了信号产生的恢复百分比。图 16显示探测器 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 的稳定性非常稳定, 其初始信号的80% 以上仍可在6月的存储后恢复。在45摄氏度以下的温度下, AuNPs 和 ssDNA 之间的强烈反应是长期稳定的。

九种不同种类的细菌 (蜡样), L. 李斯特菌, C.致病菌,大肠杆菌 O157:H7,诉携带溶藻, s. 伤寒, s. 肠炎, K . 肺炎和 v。用 PCR 检测法筛选副溶血的)。在图 17中显示了从细菌培养中检测出的用于特定物种的 PCR 放大产品的v. 副溶血性。toxR 基因作为 PCR 底漆, 用于 v. 副溶血性鉴定, 因其存在于致病性分离中。从 pcr 分析中, 由于 toxR 基因 pcr 引物对 v. 副溶血性的特异性, 结果显示阳性。未发现其他细菌菌株的 PCR 产物。在交叉反应性评估后获得的 DPV 峰值电流表明, 与其他细菌种类相比, 对v. 副溶血的检测非常清楚, 如图 18所示。DPV 信号随着基对数量的减少而增加, 这是因为与探针绑定的 MB 分子量较大。与模拟食品样品环境的其他食源性病原体一样, 可明显地区分出副溶血性。

在这项研究中, 作为 DNA 生物传感器验证的真实样本被挑选出来, 因为它们是几种当地食物中很受欢迎的成分。众所周知, 生的蛤通常携带致病 V. 副溶血性, 可以将这些细菌传播到人类身上, 特别是当它们在收获65后在贮藏过程中没有充分冷藏。处理组的蛤皮样品储存在-20 摄氏度24小时, 并暴露在紫外线光20摄氏度, 在 DNA 提取之前, 我们的预处理步骤。图 19显示 PCR 分析在治疗和未经处理的 (尖刺) 样本中发现了v. 副溶血。这显示在7、8、9、10、11和12中, 与先前讨论中的殖民地计数相关。无 V. 副溶血出现在治疗和未经处理的 (unspiked) 样品中, 如1、2、3、4、5和6中的 PCR 结果所示, 尽管菌落计数确实表明它存在于样品中。一个可能的原因是存在污染代谢物, 如蛋白质在提取的 DNA66

图 20总结了使用已开发的 DNA 生物传感器的检测结果, 它成功地确定了由尖刺和 unspiked 样本组成的治疗组中是否存在v. 副溶血性。这些结果与先前讨论的 PCR 结果呈正相关。用 PLA 稳定的电化学生物传感器技术 (AuNP) 发现了 pcr 的每一个样本, DPV 峰区与由此产生的 pcr 强度带明显对应 (图 19图 20)。结果表明, 本研究中建议的纳米粒子电化学传感器在实际样品中成功检测到了v. 副溶血性, 从而证明它优于 PCR, 对结果的真实性没有影响。

Figure 1
图 1: PLA-AuNPs 的吸光度请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: PLA-AuNPs 的 x 射线衍射谱。适应以允许从 ref. [30]。版权所有 (2016) 博彩巴西 de Química.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 透射电镜频率分布和图象 AuNPs 在测量尺度50毫微米。重印以允许从 ref. [30]。版权所有 (2016) 博彩巴西 de Química.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: EDX 光谱和 FESEM 图像 (a) 裸 SPCE 和 (b) SPCE/解放军 AuNPs。重印以允许从 ref. [30]。版权所有 (2016) 博彩巴西 de Química.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 峰值电流氧化对扫描速率平方根和循环伏安的图: (a) 裸 SPCE 和 (b) SPCE/解放军-AuNPs 1.0 毫摩尔L-1 K 3[Fe (CN) 6] (pH 7)。扫描速率为300、250、200、150、100和 50 mV s1。适应以允许从 ref. [30]。版权所有 (2016) 博彩巴西 de Química.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 1.0 毫摩尔 L-1 中修饰电极的阻抗K3[Fe (CN)6] (pH 值 7)。振幅: 5 mV, 频率范围: 0.1-105 Hz. 适应了从 ref 的允许. [22]。版权所有 (2016) Elsevier请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 1.0 毫摩尔 L-1 中修饰电极的阳极峰值 电流K3[Fe (CN)6] (pH 值 7), 扫描速率为 0.1 V s-1使用循环伏安测量请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 0.1 摩尔 L-1中 ssDNA 固定化对 SPCE/PLA-AuNPs 的影响PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-1使用差分脉冲伏安法测量20µM MB 30 分钟后孵化请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 0.1 摩尔 L 中 ssDNA 固定时间对 SPCE/PLA-AuNPs 的影响-1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-1使用差分脉冲伏安法测量20µM MB 30 分钟后孵化请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 10
图 10: ssDNA 固定温度对 0.1 V s 扫描速率 SPCE/PLA AuNPs 的影响-1at 0.1 摩尔 L-1PBS (pH 值 7) 在20µM MB 的潜伏期30分钟后使用差分脉冲伏安法测量请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 11
图 11: 杂交时间对 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 0.1 摩尔 L 的影响-1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-1使用差分脉冲伏安法测量20µM MB 30 分钟后孵化请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 12
图 12: 0.1 摩尔 L 中杂交温度对 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 的影响-1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-130 分钟后孵化20µM MB 使用差分脉冲伏安法测量。重印以允许从 ref. [22]。版权所有 (2016) Elsevier请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 13
图 13: 0.1 摩尔 L 中使用不同类型的 DNA 的 MB 还原峰值电流的直方图 -1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-130 分钟后孵化20µM MB。该嵌入说明了在相同条件下的差分脉冲伏安。重印以允许从 ref. [22]。版权所有 (2016) Elsevier请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 14
图 14: 0.1 摩尔 L 中使用不同的 DNA 浓度的 MB 还原峰值电流的直方图 -1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-130 分钟后孵化20µM MB 使用差分脉冲伏安法测量。重印以允许从 ref. [22]。版权所有 (2016) Elsevier请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 15
图 15: 对0.1 摩尔 L 中不同 DNA 浓度的对数的 MB 的还原峰值电流的线性图集-1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-130 分钟后孵化20µM MB 使用差分脉冲伏安法测量。重印以允许从 ref. [22]。版权所有 (2016) Elsevier请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 16
图 16: 不同杂交温度对 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 的影响在6月的存储时间间隔(n = 3)。以0.1 摩尔 L-1 PBS (pH 7) 为单位进行测量, 其扫描速率为 0.1 V s-1 , 在 30 µM MB 的20分钟孵化后使用差分脉冲伏安法测量。重印以允许从 ref. [22]。版权所有 (2016) Elsevier请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 17
图 17: 琼脂糖凝胶电泳-PCR 扩增使用 16S rRNA 基因测序产品的选定细菌从细菌培养。车道 M: 1kb DNA 阶梯, 车道 C−: 阴性控制 (无菌蒸馏水), 车道 C +: 正面控制 (从大肠杆菌提取的脱氧核糖核酸 使用作为模板), 车道欧共体: 大肠杆菌 O157:H7, 车道 CJ: C., 泳道: B. 蜡样, 车道 KP: K. 肺炎, 车道 ST: S.. ...................... 李斯特, 车道 SE: S. 副溶血和车道: v. 携带溶藻请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 18
图 18: 0.1 摩尔 L 中对各种食源性致病菌的 DNA 生物传感器的跨反应性的 MB 还原峰值电流的直方图-1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-130 分钟后孵化20µM MB 使用差分脉冲伏安法测量。重印以允许从 ref. [23]。版权所有 (2017)请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 19
图 19: 琼脂糖凝胶电泳-PCR 扩增产品的v. 副溶血来自新鲜的蛤样。车道 M: 2ul 100 bp 脱氧核糖核酸梯子, 车道 1-3: 未处理的 unspiked 样品, 车道 4-6: 被对待的 unspiked 样品, 车道 7-9: 未处理的被刺的样品, 车道 10-12: 治疗的被刺的样品, 车道 C +: 正面控制 (v. 副溶血ATCC 17802)车道 C-: 阴性控制 (无菌蒸馏水)。重印以允许从 ref. [23]。版权所有 (2017)请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 20
图 20: 用于检测的 MB 还原峰值电流的直方图v. 副溶血性在新鲜的蛤样中使用 DNA 生物传感器在0.1 摩尔 L-1 PBS (pH 7) 的扫描率为 0.1 V s-1 30分钟孵化后20µM MB 使用差分脉冲伏安法测量。重印以允许从 ref. [23]。版权所有 (2017)请单击此处查看此图的较大版本.

电极组成 孵化时间 (h) 温度 (°c) 成长媒体
空肠弯曲菌 48 42 BA/BB
李斯特菌 48 30 TSA/储蓄银行
沙门氏菌 24 37 TSA/储蓄银行
沙门氏菌肠炎 24 37 TSA/储蓄银行
肺炎克雷伯菌 24 37 EMBA/储蓄银行
大肠杆菌 O157:H7 24 37 MA/信托
蜡样芽孢杆菌 24 37 MYPA/储蓄银行
携带溶藻弧菌 24 37 TSA+3 打印张数%nacl
副溶血弧菌 24 37 CA/TSA+3 打印张数%nacl

表 1:所选细菌的养殖条件.

样品 Pos [°2Th] FWHM [°2Th] d 间距 [Å] 晶粒尺寸 (nm)
解放军-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

表 2:PLA-AuNP 晶粒的大小。已根据 ref [30] 的权限进行了修改。版权所有 (2016) 博彩巴西 de Química.

修饰电极 % RSD (n = 6) 信号减少 (%)(n = 20)
重复 重复
SPCE/解放军-AuNPs 4.26 4.05 18

表 3: K 中与 AuNPs 和 PLA AuNPs 修饰有关的修饰电极的性能3[Fe (CN)6] 与1.0 毫摩尔L-1扫描速率为 0.1 V s 的浓度-1.适应以允许从 ref. [30]。版权所有 (2016) 博彩巴西 de Química.

电极组成 ipa (µA) Epa 选择性率 (%)
(n = 3) V
SPCE/解放军-AuNP/探针 DNA 4.79 @ 0.10 -0.46 -
SPCE/解放军-AuNP/非互补 DNA 3.25 @ 0.12 -0.44 67.85
SPCE/PLA-AuNP/3-bases 不匹配的 DNA 1.05 @ 0.11 -0.45 21.92
SPCE/PLA-AuNP/1-base 不匹配的 DNA 0.94 @ 0.12 -0.46 19.62
SPCE/解放军-AuNP/互补 DNA 0.73 @ 0.10 -0.45 15.24

表 4: MB 峰值电流在0.1 摩尔 L 中的 DPV 选择性-1PBS (pH 值为 7), 扫描速率为 0.1 V s-130 分钟后孵化20µM MB

电极组成 检测方法 线性范围 (M) 检测限制 (M) 引用
3D AuNPs DPV 1.5×10-6 -7.0×10-9 2.0×10-10 69
(+)AuNPs DPV 1.0×10-9 -1.5×10-12 2.6×10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3×10-9 -2.5×10-11 8.3×10-12 71
AuNPs-安全总局 DPV 5.0×10-8 -3.0×10-13  3.0×10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5.0×10-9 -1.0×10-11  5.0×10-11 73
AuNPs–GO DPV 1.0×10-9 -1.0×10-14 3.5×10-15 74
因为/AuNPs DPV 1.0×10-9 -1.0×10-12 7.0×10-13 75
解放军-AuNPs DPV 2.0×10-8 -2.0×10-13 5.3×10-12 这项工作

表 5: 最近开发的一些电化学 DNA 纳米传感器的比较。重印以允许从 ref. [22]。版权所有 (2016) Elsevier。

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Discussion

这类电化学生物传感器成功发展的框架中的关键步骤是为传感器 (核酸或 DNA) 选择合适的生物识别元件;构造传感器传感层的化学方法转导材料;DNA 固定化与杂交的优化研究并通过实际样品对所研制的生物传感器进行验证。

核心到成功开发的敏感和选择性电化学 DNA 生物传感器, 是优化的固定化和杂交条件。在这项工作中, 我们用 MB 作为氧化还原络合物。有多种原则的 mb DNA 相互作用: (i) 通过静电相互作用的 mb 阳离子电荷与磷酸盐主干阴离子电荷的 ssDNA 和 dsDNA;(ii) 通过在 dsDNA 中的交替 G C 基对之间成功插入 mb, 通过 mb 插层;(iii) 由共价键到目标 ssDNA 的末端, 导致低标号密度 (每脱氧核糖核酸链的一个或二 MB 分子);和 (iv) MB 与未绑定的鸟嘌呤基在 ssDNA 的相互作用。我们应用了第四原则, 它准确地确定了v 副溶血性从细菌和新鲜的蛤的交叉反应。在特别感兴趣的氧化之后, MB 和 ssDNA 之间有更强的亲和力。ssDNA 与其互补序列的杂交取代了粘结的 MB 分子, 从而减少了信号。

本文的一系列实验结果重点研究了利用 DNA 杂交原理快速检测具有高选择性和灵敏度的v. 副溶血性的方法。第一步是合成和表征聚乳酸稳定的金纳米粒子 (PLA-AuNPs), 用于修饰电极 (图 1-6表 2)。利用紫外可见光谱 (UV-可见光)、X 射线衍射 (XRD)、场发射扫描电子显微镜 (FESEM)、透射电镜 (TEM)、循环伏安法 (CV) 等方法对金纳米粒子的质量进行了评价, 并阻抗分析。开发的第二部分涉及修饰电极 (图 7-12表 3-4) 的电化学特性, 它决定了修饰电极相对于裸电极的成功增强。检测杂交事件的术语。

DNA 生物传感器发展的第三步是基于杂交事件实验条件的优化, 以及已开发的生物传感器在实际病原体检测中的应用 (图 13-20)。利用差分脉冲伏安法 (DPV) 对确定病原体检测成功的杂交事件进行了评估。通过减少电流, 表明靶向病原体的阳性存在。通过构造标定图和 LOD 的计算 (图 15) 评估了所开发的生物传感器的灵敏度。制备的生物传感器能够根据不同的电流还原水平 (图17和 18), 从其他病原体中明确区分v. 副溶血性。在图19和 20中介绍了已开发的生物传感器在实际食品样品中检测v. 副溶血性的可行性, 并指出了靶向病原体的阳性存在.dna 生物传感器的成功发展, 高度依赖于 dna 探针的选择、改进电极的增强以及实验条件的优化。这里的 DNA 探针已经从浩67的以前的工作中进行了调整。采用聚乳酸稳定的金纳米粒子对改性电极进行了增强, 使纳米标准化。金纳米粒子的作用是电催化材料的68 , 并采取行动, 以提高电子的传输速率, 并提供一个表面上锚定 DNA 探针。实验参数根据温度和潜伏期进行优化, 对 DNA 形成双工具有重要意义。杂交温度影响非特异吸附之间的分离, 这增加了传感器的选择性。杂交的孵化时间增加了双相形成的几率。为了确保 DNA 探针在合适的方向上形成双相地层, 必须对固定化过程进行优化。

表 5比较最近开发的电化学 DNA 生物传感器69,70,71,72,73,74,75,.基于 DNA 的生物传感是一种很有希望的替代分子技术的方法, 虽然有一些限制, 必须解决之前, 该方法可以移植足够的现场使用。主要的限制是样本处理 dna 提取作为纯度和 dna 的数量在现场提取不太可能是那么好, 从标准的实验室方法提取。然而, 如果 PCR 和凝胶电泳可以用微流控样品预处理系统代替, 则是一种很有前景的选择。

基于 DNA 的生物传感器对于许多应用 (包括医疗诊断、环境监测和食品监测) 可能有用。这项技术将使在线监测的质量控制过程和护理点监测的病人。整个传感器系统的可移植性将使诊断过程分散, 消费者可以在舒适的家里使用检测系统。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者希望感谢马来西亚马来西亚的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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