توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل الأساسي لبطانة الرحم البشرية الاوليه التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية والاحتفاظ بخصائص نسيج بطانة الرحم الأصلي. يصف هذا البروتوكول الطرق من اكتساب انسجه الرحم إلى المعالجة النسيجية لهيكل بطانة الرحم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بطانة الرحم البشرية هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه هرمونيا في الجسم وضروري لأقامه الحمل. هذا النسيج يمكن أيضا ان تصبح مريضه وتسبب الاعتلال وحتى الموت. واقتصرت النظم النموذجية لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم البشرية علي نظم الاستزراع الأنبوبي لأنواع الخلايا المفردة. الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا الظهاريه ، واحده من أنواع الخلايا الرئيسية لبطانة الرحم ، لا تنتشر بشكل جيد أو الاحتفاظ بصفاتها الفسيولوجية في الثقافة ، التالي فهمنا لعلم الاحياء بطانة الرحم لا يزال محدودا. لقد ولدت ، للمرة الاولي ، الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. هذه العضوية لا تتطلب اي مواد سقالة الخارجية وتنظيم علي وجه التحديد بحيث الخلايا الظهاريه تشمل الهيكل الشبيه كروي وتصبح مستقطبه مع الخلايا اللحمية في المركز الذي ينتج وتفرز الكولاجين. يتم التعبير عن الاستروجين ، البروجسترون ومستقبلات الاندروجين في الخلايا الظهاريه واللحمية والعلاج مع المستويات الفسيولوجية من الاستروجين والتستوستيرون تعزيز تنظيم الهيكل التنظيمي. ويمكن استخدام هذا النظام نموذج جديد لدراسة البيولوجيا بطانة الرحم العادية والمرض بطرق لم تكن ممكنة من قبل.

Introduction

بطانة الرحم البشرية التجويف الرحمي وتعمل كاول اتصال للجنين اثناء الغرس. وتتكون بطانة الرحم من الخلايا الظهاريه المضيءه والغديه ، والخلايا الليفية الداعمة للورم ، والخلية البطانية والخلايا المناعية. معا, هذه الأنواع الخلية تشكل انسجه بطانة الرحم التي هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه لهرمونات الستيرويد الجنس1. التغييرات التي تحدث خلال كل دوره الحيض ملفتة للنظر. مطلوب النمو المناسب وأعاده تشكيل بطانة الرحم للسماح لزرع الاجنه ان يحدث. الاستجابة الشاذة للاستروجين والبروجستيرون يمكن ان يؤدي إلى بطانة الرحم الحرارية التي لا تسمح للنجاح في إنشاء الحمل ويمكن ان يؤدي حتى في الامراض بما في ذلك أورام بطانة الرحم.

من أجل دراسة الاستجابات الهرمونية والتغييرات الاساسيه التي تحدث في بطانة الرحم ، تم نشر الخلايا من انسجه بطانة الرحم التي تم استئصالها من المرضي اثناء الجراحة أو خزعة بطانة الرحم في ثقافة الخلايا. تنتشر الخلايا اللحمية لبطانة الرحم بشكل تفضيلي وتنتشر بسهوله ، ويمكن تلخيص عمليه التمايز التي يسببها البروجسترون في المختبر. ونتيجة لذلك ، تم تعلم الكثير خلال عمليه التفريق هذه ، التي سميت ديسيدواليزيشن2،3. نوع الخلية الرئيسية الأخرى في بطانة الرحم ، والخلايا الظهاريه التلالؤ والغديه ، ومع ذلك ، لا تنمو بشكل جيد كما أحادي الطبقات التقليدية ، وفقدان القطبية ، وتصبح السكون ، ووجود إمكانات محدوده التكاثري. ونتيجة لذلك ، فان اقل ما يعرف عن علم الاحياء ودورها في بطانة الرحم البشرية. وبما ان العديد من الأورام تنشا من الخلايا الظهاريه ، تظل أليات المرتبطة بفرط التنسج أو التحول إلى الخلايا السرطانية محدده بالبالكامل. وعلاوة علي ذلك, وقد وضعت دراسات ان الاستجابة هرمون ينطوي علي الإجراءات الحميمة paracrine بين الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم4,5.

في الاونه الاخيره ، تم تاسيس الثقافة العضوية ثلاثية الابعاد (3d) من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم من قبل مجموعتين مستقلتين6،7، والتي هي التقارير الاولي من العضوية التي تشكلت من انسجه بطانة الرحم. وتتالف هذه العضوية من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم جزءا لا يتجزا من مصفوفة البروتين (جدول المواد) ولم تشمل مقصوره استجابه الهامه هرمونيا من بطانة رحم بطانة الرحم ، والليفية اللحمية. كما يمكن ان تختلف البروتينات مصفوفة من الكثير إلى الكثير ، ويمكن ان تؤدي إلى مسارات الإشارات التي لا تحدث بالضرورة في الانسجه ، فانه سيكون من المثالي لاستبدال البروتينات مصفوفة مع مكونات بطانة الرحم. في الدراسة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل العضوي الخالي من السقالات من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. وجود الخلايا اللحمية لا يوفر فقط الدعم للخلايا الظهاريه ولكنه يوفر أيضا الإجراءات الضرورية paracrine التي تم إنشاؤها لتكون مهمة لاستجابه هرمون بطانة الرحم4,8,9 .

العضوية الجديدة لبطانة الرحم متعددة الخلايا تقدم نظاما نموذجيا لبطانة الرحم التي هي بسيطه لتوليد والتي تتضمن كلا من الخلايا الظهاريه واللحمية. ويمكن استخدام هذه العضوية لدراسة التغيرات الهرمونية علي المدى الطويل والاحداث المبكرة من الامراض مثل التورم بسبب عدم التوازن الهرموني أو الشتائم الخارجية. ويمكن في نهاية المطاف توسيع تعقيد هذه الاشكال العضوية لتشمل أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية والمناعية مع الخلايا العضلية ربما إلى تقليد حقا فسيولوجيا الانسجه البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم جمع عينات بطانة الرحم من النساء قبل انقطاع الطمث التي خضعت لعمليه استئصال الرحم الروتينية لظروف رحميه حميده في مستشفي النساء بجامعه نورث وسترن ، وفقا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية. وتم الحصول علي موافقه خطيه من جميع النساء المشمولات بالدراسة.

1. اعداد قوالب اجبرز

  1. قبل البدء في عزل الخلايا ، يلقي وتتوازن 1.5 ٪ القوالب الدقيقة الاغاروز (جدول المواد) لإيواء العضوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. توليد الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم

  1. حصاد الخلايا اللحمية الاوليه والظهاره
    1. في خزانه السلامة الاحيائيه باستخدام تقنيه العقيم ، واعداد محلول الانزيم (2.5 ملغ/مل كولاجيناز نوع انا + 0.1 مغ/مل DNase انا في 10 مل من يوزع [500 وحدات]) في 37 درجه مئوية ، ومعقمه-تصفيه الحل باستخدام فلتر حقنه 0.2 μm في أنبوب مخروطي 15 مل.
    2. في خزانه السلامة الاحيائيه باستخدام تقنيه العقيم ، كشط بطانة الرحم من الخزعات الرحمية والنسيج المفروم تحت غطاء محرك الطريق إلى قطع صغيره جدا مع مشرط.
      ملاحظه: الانسجه بطانة الرحم التي هي علي الأقل 20 مم × 10 مم × 1 مم مطلوب لتوليد اعداد كافيه من العضوية.
    3. ضعي الانسجه المفرومة الطازجة في محلول الانزيم في أنبوب مخروطي الشكل بحجم 15 مل. إغلاق الغطاء والتفاف الأعلى مع فيلم الشمع (جدول المواد) لمنع التلوث.
    4. وضع الأنبوب مع الانسجه في حمام مائي أو حاضنه في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه مع اهتزاز لطيف (80 − 100 دوره في الدقيقة).
    5. كومه مصفاه الخلية 100 μm علي راس مصفاه الخلية 20 μm علي أنبوب مخروطي 50 mL. تصفيه الحل من خلال اثنين من المصافي ، ومن ثم شطف أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل من محلول الملح هانك المتوازن (HBSS ؛ جدول المواد) ووضع الغسيل من خلال مصفاه لضمان جمع جميع الخلايا.
      ملاحظه: السائل تدفق من خلال يحتوي علي الخلايا اللحمية وخلايا الدم الحمراء (~ 20 مل المجموع). يتم جمع الخلايا الظهاريه علي مصفاه 20 μm. تبقي قطع من الانسجه غير مهضوم علي راس مصفاه 100 μm. تخلص من الانسجه غير المهضومة إلى حاويه نفايات المخاطر البيولوجية.
    6. عكس مصفاه الخلية 20 μm من الخطوة 2-1-5 علي أنبوب مخروطي جديد 50 mL وغسل الخلايا الظهاريه قباله مصفاه مع 20 مل من وسائل الاعلام organoid (جدول المواد) تستكمل مع 1 ٪ من القلم/بكتيريا.
    7. الطرد المركزي أنابيب مخروطيه من الخطوات 2-1-5 و 2-1-6 في 500 x g لمده 5 دقائق.
    8. مع الخلايا اللحمية التي تم جمعها ، وأزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه مع 10 مل من خليه الدم الحمراء تحلل العازلة.  احتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 − 15 دقيقه. الطرد المركزي أنبوب مخروطي في 500 x g لمده 5 دقائق ، وأزاله supernatant ، وأعاده تعليق بيليه مع 200 − 300 μl من وسائل الاعلام العضوية (انظر الخطوة 2-2-2 لمزيد من التعليمات).
    9. مع الخلايا الظهاريه التي تم جمعها ، وأزاله ماده طافي وأعاده التعليق مع 100 μl من وسائل الاعلام organoid (انظر الخطوة 2-2-2 لمزيد من التعليمات).
  2. خلايا البذر
    1. بعد تولد القوالب الاغاروز 1.5 ٪ في الآبار (1 العفن في بئر) من لوحه 24 بئر ، وأزاله وسائل الاعلام organoid علي الخارج من القوالب اجبرزت وأماله لوحه ثقافة الانسجه بحيث المتوسطة من غرفه البذر الخلية من الاطباق اجنشا يمكن أيضا ان تكون ازالتها بعناية.
    2. عرض الظهاريه (من الخطوة 2.1.9) واللحمية (من الخطوة 2-1-8) تعليق الخلية تحت المجهر.  أضافه المزيد من الوسائط العضوية إلى الخلية الظهاريه أو الخلايا اللحمية المعلقة 100 μL في وقت واحد ، بحيث تكون التعليقات متساوية تقريبا في الكثافة.
      ملاحظه: سوف تتجمع الخلايا الظهاريه معا ، وانه ليس من المستحسن لهضم/التريسيسيزي الخلايا الظهاريه في تعليق خليه واحده.
    3. الجمع بين 1 جزء من الخلايا اللحمية مع 3 أجزاء من الخلايا الظهاريه حسب الحجم.
    4. ماصه 50 μL (60,000 الخلايا) من تعليق الخلية مجتمعه في غرفه البذر الخلية من العفن اجبرزت.
    5. مره واحده يتم تعبئة قوالب الاغاروزها مع الخلايا ، أضافه بعناية 400 μl من وسائل الاعلام العضوية الطازجة في بئر من لوحه 24 بئر.
      ملاحظه: المتوسطة تصل فقط تحت سطح الاطباق اجنشا ولن يسبب الخلايا لتطفو من القوالب. بعد 2 − 3 أيام ، ستستقر الخلايا وتبدا في تشكيل الغدد العضوي.
    6. تغيير المتوسطة كل يوم الثاني مع 500 μL من وسائل الاعلام organoid.
    7. بعد 2-3 أيام ، تغيير المتوسطة إلى واحده التي تستكمل مع 0.1 nM استراديول (E) و 0.8 nM التستوستيرون (T) لتعزيز تنظيم الخلايا الظهاريه واللحمية.
      ملاحظه: علي الرغم من ان تنظيم الخلايا الظهاريه واللحمية يمكن ان تحدث مع أو بدون الهرمونات, وسوف تنظم أكثر organoids في وجود الهرمونات.

3. حصاد الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم للتجارب

ملاحظه: بعد الانتهاء من التجربة ، يمكن معالجه organoids بطانة الرحم لتحليل الانسجه أو الحمض الريبي النيبالي. تصف الخطوات التالية كيفيه معالجه العضو العضوي.

  1. انسجه
    1. ذوبت 1.5% [اغبرز] في فوسفات-مخزن ملحيه ([ببس]) ب يغلي. السماح للسائل السائل لتبرد إلى حوالي 50 درجه مئوية.
    2. تحت المجهر تشريح ، أماله الصفيحة 24 جيدا وماصه بعناية خارج الوسط من خارج العفن اجبرزت. ماصه بعناية خارج الوسط من الداخل من العفن اجبرزت لتجنب تعطيل الهيكل العضوي.
    3. تحت المجهر تشريح ، ماصه بعناية 70-75 μL من الدافئة (50 درجه مئوية) 1.5 ٪ اجنشا في غرفه الطبق اغبرز. احرص علي عدم إزعاج العضو العضوي.
    4. السماح لتبرد في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    5. أضافه 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في كل بئر من 24 لوحه جيدا وإصلاح كامل العفن المختومة التي تحتوي علي organoids بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. ثم تخزين في 70 ٪ الايثانول في 4 درجه مئوية حتى علي استعداد لعمليه لتضمين البارافين.
  2. [رنا] عزل
    1. تحت المجهر تشريح ، أماله لوحه 24 جيدا وماصه بعناية خارج الوسط من غرفه العفن اجبرزت.
    2. ماصه بالقوة 1 مل من المتوسطة العضوية الطازجة مباشره في العفن اجنشا بحيث يتم مسح الهيكل العضوي للخروج من ميكروويلس. يجب الحرص علي عدم خلق فقاعات كثيره جدا.
    3. كرر الأنابيب مره أخرى بنفس الوسط من الخطوة 3-2-2.
    4. جمع كل المتوسطة التي تحتوي علي organoids. أجهزه الطرد المركزي في السرعة القصوى لجمع organoids والمضي قدما إلى استخراج RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي للبروتوكول. تم الحصول علي انسجه الرحم من الجراحة بعد فحصها من قبل اخصائيي الامراض. وفصل بطانة الرحم من الورم العضلي عن طريق الكشط وتم هضم انسجه بطانة الرحم انزيمي إلى الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. وأضيفت الخلايا الظهاريه واللحمية إلى ميكروويلس في قوالب اجبرز. بعد 7 أيام في الثقافة ، عولجت العضوية مع E و T لمده 7 − 14 يوما اضافيه.

بالنسبة للمعالجة النسيجية ، تم إغلاق القوالب التي تحتوي علي الهيكل العضوي لبطانة الرحم مع الاغثار متبوعه بالتثبيت مع 4% من الليل. وقد تم تجهيز هذه القوالب لتضمين البارافين القياسية ، مقسمه والملون لأنسجه النسيج ، المناعي أو مناعي. وكشفت الهيلوكسيلين واليوزين (H & E) تلطيخ (الشكل 2ا) هيكل يشبه كروي مع طبقه واحده من الخلايا بطانة الخارج والخلايا في المركز. وكشفت علامات الخلية الخاصة لبطانة الرحم الظهاريه (البريد-الملتصقين) والخلايا اللحمية (الخلايا المفتولة) ظهاري الخلية المحيطة organoid مع الخلايا اللحمية في المركز (الشكل 2ب).

وأكدت علامات فسيولوجيا بطانة الرحم ان العضوي بطانة الرحم الاحتفاظ بخصائص معينه من الانسجه الاصليه. وأظهرت تلطيخ trichrome ، الذي بقع الكولاجين الأزرق والخلايا الحمراء ، وجود الكولاجين داخل المركز حيث أقامت الخلايا اللحمية ، مما يدل علي الإنتاج النشط وإفراز الكولاجين من الخلايا اللحمية مماثله للانسجه الاصليه (الشكل 3 ا). الاضافه إلى ذلك ، كشفت تلطيخ مناعي وجود مستقبلات الاستروجين (ER) ، ومستقبلات الاندروجين (AR) ، ومستقبلات البروجسترون (PR) في كل من الخلايا الظهاريه واللحمية (الشكل 3ب).

Figure 1
الشكل 1: توليد الهيكل العضوي لبطانة الرحم ثلاثية الابعاد الخالي من السقالات من خلايا بطانة الرحم الاوليه البشرية. تم الحصول علي انسجه الرحم من انسجه بطانة الرحم قبل انقطاع الطمث مع علم الامراض الحميدة وتم استئصال بطانة الرحم من قطعه النسيج. بناء علي الهضم الانزيمي ، تم بذر الخلايا الظهاريه واللحمية بطانة الرحم إلى 1.5 ٪ قوالب اغبرز بنسبه 3:1 بالحجم والحفاظ عليها في متوسطه خاليه من هرمون الجنس لمده تصل إلى 7 أيام. تمت أضافه استراديول (E) والتستوستيرون (T) إلى الثقافات ثلاثية الابعاد لتقليد مستويات E و T خلال المرحلة الجرابيه للدورة الشهرية10 ولتعزيز تنظيم الهيكل العضوي. مقتبسه من تياوات وآخرون ، (2019 )11.

Figure 2
الشكل 2: الانسجه وصبغ النيون المناعي لعلامات الخلايا المحددة علي الهيكل العضوي لبطانة الرحم. لوحظت organoids بعد 14 يوما من العلاج بالهرمونات المتدرجة محاكاة المرحلة الجرابيه من الدورة الشهرية العادية (0.1 nM E و 0.8 nM T لمده 7 أيام, 1 nM E و 0.8 nM T لمده 6 أيام اضافيه, تليها 1 nM E و 1.25 nM T لمده 1 يوم). (ا) تم تلوين H & E علي organoids المضمنة البارافين. (ب) تم تقييم علامات خليه محدده من قبل تلطيخ المناعية من البريد الكتروني (الظهاريه ، الأحمر) ، فيمنامين (اللحمية ، الأخضر) و 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (dapi ؛ نواه ، الأزرق) التي كشفت عن تنظيم الهيكلية للخلايا في الهيكل العضوي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. مقتبسه من تياوات وآخرون ، (2019) <11يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الهيكل العضوي لبطانة الرحم يحمل خصائص الانسجه الاصليه بعد 14 يوما من العلاج بهرمون الطور الجرابيه. (ا) وقد تم تلطيخ trichrome لتصور الكولاجين (الأزرق) والخلايا (الأحمر). وأجريت وصمه عار trichrome علي انسجه بطانة الرحم (اللوحة اليسرى) وبطانة الرحم العضوية (قضبان مقياس = 20 μm ، لوحه الحق). (B) وقد تم تلطيخ مناعي لل ER ، AR والعلاقات العامة في انسجه بطانة الرحم (شريط مقياس = 100 μm لوحات أسفل) وبطانة الرحم العضوية (شريط مقياس = 20 μm ، لوحات العليا). ويظهر وصمه عار ايجابيه في البني وتم أضافه محلول وصمه عاري الدم ووصمه عار المضادة التي تظهر باللون الأزرق. مقتبسه من تياوات وآخرون ، (2019 )11يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد ولدت لدينا الإنسان العضوي بطانة الرحم تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة الخارجية. في حين انه قد تم بالفعل تبين ان الخلايا الظهاريه بطانة الرحم الاوليه يمكن ان تشكل organoids6,7, وقد تم تضمين هذه الخلايا في مصفوفة الجيلاتين من البروتينات التي تفرزها خلايا ساركوما الفار (انظر جدول المواد) للمساعدة تشكيل هياكل تشبه كروي. الاضافه إلى ذلك ، كانت الخلايا اللحمية لبطانة الرحم غائبه. ونحن التكهن بان الخلايا اللحمية في نظامنا ، والذي هو عنصر داعم أساسي من انسجه بطانة الرحم ، قدمت سقالة للخلايا الظهاريه التمسك والإشارات paracrine وقعت بين أنواع الخلايا. وأشار تنظيم الخلايا الظهاريه حول الخلايا اللحمية إلى تفاعل نشط بين نوعي الخلية التي وفرت العظة الفسيولوجية. كما الاستجابة الهرمونية لبطانة الرحم يعتمد علي التفاعلات paracrine بين الظهاريه والخلايا اللحمية4،8،9، لدينا العضوية المتعددة الخلية توفر البديل ، تقليد أكثر تعقيدا من الام الانسجه.

وكانت الخلايا العضوية التي تم إنشاؤها هنا في الغالب الخلية الجسدية ، علي الرغم من ان نسبه صغيره من الخلايا كانت الجذعية مثل. لم نكن حتى الآن المرور هذه العضوية لأجيال متعددة ولا نعرف ما إذا كانوا البقاء علي قيد الحياة والنشر. الاضافه إلى ذلك ، فان الهيكل العضوي لبطانة الرحم غير متجانس في الطبيعة حيث انه ليست جميع الخلايا العضوية تحتوي علي نفس العدد من الظهاريه ، اللحمية أو الجذعية ، حتى تلك التي تنشا من نفس النسيج. واختلفت احجام الهيكل العضوي أيضا وفي حين ان معظم الخلايا شكلت كروي مثل الهياكل ، ولوحظت خلايا فضفاضة داخل كل microwell. ظهر وجود E و T لتعزيز تشكيل organoid مع تنظيم محدد من الخلايا الظهاريه بطانة الخلايا الخارجية واللحمية في المركز. نحن لم تختبر ما إذا كان E أو T وحدها من شانه ان يعزز تشكيل organoid وما هو الطول الأمثل للعلاج سيكون. اختبار اضافيه من المعلمات والظروف سيكون مفيدا لتوليد الهيكل التنظيمي المثالي بطانة الرحم مناسبه للتجربة المخطط لها.

المتوسطة عنصرا هاما من المكونات العضوية لتعزيز النمو والبقاء علي قيد الحياة. من تجربتنا في العمل مع خلايا بطانة الرحم ، ونمو الخلايا الظهاريه في الثقافة هو الأكثر تحديا علي النقيض من الخلايا اللحمية التي تنتشر بشكل جيد. تم اختبار وسائل الاعلام المختلفة ، بما في ذلك وسائل الاعلام العضوية من اختيار (جدول المواد) ، والذي يستخدم لتوليد ماموسفيريس والأورام من سرطان الثدي ، والتي هي من أصل الخلايا الظهاريه. كشفت اختباراتنا ان هذه الوسيطة سمحت بالحفاظ علي سلامتها الهيكلية وقدرتها علي البقاء علي مدار 14 − 28 يوما من الثقافات. ومع ذلك ، فان تاثير هذه الوسيلة علي الخلايا اللحمية يحتاج إلى تحقيق إضافي. وعلي الرغم من بقائها وإنتاج الكولاجين في وسائل الاعلام العضوية ، فان معدل الانتشار الذي لوحظ في الثقافة ثلاثية الابعاد كان اقل بكثير مما كان عليه في الطبقات الاحاديه. ولكن انخفاض الانتشار قد يكون بسبب هيكل 3D كذلك. النظر إلى ان وسائل الاعلام العضوية المستخدمة متاحه تجاريا ، تظل المكونات المتوسطة غير واضحة بسبب طبيعتها الاحتكارية.

في الدراسات المستقبلية ، ونحن نتصور زيادة تعقيد هذه العضوية بطانة الرحم لدمج أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في بطانة الرحم ، بما في ذلك الخلايا البطانية والمناعية. هذا هو مجرد بداية الهندسة تقليد بطانة الرحم الكاملة التي يمكن استخدامها لدراسة علم الاحياء ، وظيفة ، والمرض ، واختبار المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIHS/المعاهد القومية للصحة/NCATS UG3 غرانت (ES029073) وشمال غرب مدرسه Feinberg كليه الطب جسر الصندوق (JJK). نود ان نعترف بالمرفق الأساسي لعلم الامراض الشمالية الغربية لمعالجه العضوية الثابتة لتضمين البارافين. نود ان نعترف بالفريق UG3 بأكمله بما في ذلك وودروف ، Burdette ، ومختبرات اوربريك للمناقشات الثاقبة والتعاون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media - Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix - Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film - Parafilm VWR 52858-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25, (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331, (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357, (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144, (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19, (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139, (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34, (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78, (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics