C. 예인대 고나드 압출 : 빠른 해부 기술

Overview

이 비디오는 성인 C. elegans hermaphrodites에서 gonads를 해부하는 방법을 설명합니다, 면역 염색 및 형광 화상 진찰에 적합한 조직의 결과로.

Protocol

이 프로토콜은 저베이스와 아루르에서 발췌, C. elegans Germline에서 활성 ERK의 공간 및 시간 적 분석. J. 비스 익스펙. (2016).

1. 조나드 를 얻기위한 성인 웜의 해부

1. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서 M9 버퍼의 100 μL에서 원하는 특정 발달 단계(L1, L2, L3, L4, 성인 등)에서100-150 WT(N2) 또는 원하는 유전자형을 선택한다.
2. M9 버퍼의 900 μL로 마이크로 센심 분리기 튜브를 채웁니다(재료 표참조). 주변 온도에서 1 분 동안 미세 원심 분리기에서 1,000 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
3. M9 버퍼의 900 μL을 부드럽게 제거하고 폐기하십시오. 해부 현미경으로 버퍼를 제거하여 웜이 실수로 제거되지 않도록 합니다.
4. 매번 신선한 M9 버퍼로 1.2 - 1.3 단계를 두 번 더 반복합니다. 이것은 벌레와 함께 이월된 어떤 박테리아든지 효과적으로 멀리 세척된다는 것을 보장합니다.
5. 마지막 세척 후 튜브에서 M9 버퍼의 900 μL을 제거하고 폐기하십시오.
6. 나머지 100μL의 M9 버퍼는 100-150개의 웜을 200 μL-마이크로피펫 팁으로 평평한 바닥 유리 시계 접시에 옮길 수 있습니다. 마이크로피펫 팁이 사용하기 전에 10 μL 마크로 절단되었는지 확인합니다. 팁을 절단하지 않으면 웜의 전단이 발생합니다.
7. M9 버퍼에 벌레가 들어 있는 유리 시계 접시에 0.1 M 레바미솔의 1-3 μL을 추가합니다. 레바미솔과 M9을 부드럽게 소용돌이면 벌레가 움직이지 않을 때까지 믹싱을 할 수 있습니다.
   참고: 레바미솔 주식은 장기 보관을 위해 -20°C에 보관할 수 있습니다. 여기서, 동물에서 이동성의 급속한 손실을 얻기 위해 레바미솔의 0.2 -0.25 mM의 문학23에 설명된 것보다 1 -3 mM의 높은 농도를 사용한다. 동물이 액체 현탁액에서 너무 오래 동안 주변에 벗겨지면, 생식선에서 dpERK의 결과 패턴이 가변적 일 수 있습니다 (스트레스 또는 영양 부족 또는 둘 다). 해부를 위한 1 -3 mM 레바미솔로 더 재현 가능한 염색 패턴을 달성했습니다.
8. 2개의 25 G 바늘을 2개의 1mL 주사기에 붙입니다 (주사기의 크기는 중요하지 않으며, 바늘의 게이지는 중요합니다). 각 손에 주사기 1개를배치합니다(그림 1).
9. 해부 현미경하에서 각 바늘을 도 1에 도시된 대로 각 웜 아래에 놓고 가위와 같은 움직임에 두 번째 인두 전구 근처의 웜에 미세한 절단을 배치합니다. 벌레에 한 컷 후 접시에 있는 모든 동물이 적어도 한 번 절단 될 때까지 다음 동물로 이동합니다.
   참고: 1.8 - 1.9 단계는 시간에 민감하다는 점을 염두에 두어야합니다. 재현 가능한 dpERK 패턴으로 5분 이내에 접시에 있는 모든 웜을 해부합니다. 해부 시간이 길어지면 dpERK 신호가 꺼지며, 특히 Zone 1에서 꺼집니다. 할당된 시간 프레임에 머무르기 위해 필요한 경우 해부(예: 50 웜 대 150)의 라운드당 웜 수를 조정합니다.
   1. 해부 중에 압출 된 고나드가 보이지 않는 경우 동일한 동물에서 다른 절단을 시도하지 마십시오. 일반적으로 동물을 전단하고 고나드의 압출을 초래하지 않습니다. 대신, 다음 동물로 이동합니다. 조나드가 돌출되지 않는 웜은 섹션 6에서 만들어지고 이미징 중에 무시할 수 있는 슬라이드에 같이 나타납니다.
      참고: 모든 해부 및 처리 단계를 통해 gonad가 신체 / 시체에 부착 된 상태로 유지된다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 고나드와 몸을 바늘로 떼어 놓지 마십시오. 종종 몸에서 gonad를 분리하려는 시도에서 고나달 조직에서 비정상적인 파열이 가짜 항체 신호를 초래할 수 있습니다. 바디/시체는 이미징 단계 중에 무시할 수 있으며 이미지된 고나드만 무시할 수 있습니다. 또한, 때때로 장 세포는 또한 분석되는 항체를 위한 내부 통제/체세포 통제로 봉사할 수 있습니다.

그림 1: 해부 중 바늘 위치 의 데모. 왼쪽: 진행 중의 해부 사진. 오른쪽: 웜을 참조하여 바늘 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.