Summary
여기에 설명하는 것은 lipopolysaccharide가 유선염을 시뮬레이션 할 수있는 유두, 일반적으로 세균 감염에 의한 조건을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술입니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에 Lipopolysaccharide 사출 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스의 발광 생물 이미징을 통해 시각화.
Abstract
인간의 질병의 동물 모델은 사전 임상 모델은 개입을 테스트로 엄격하게, 궁극적으로 질병의 진행 및 관련 메커니즘의 단계를 공부하고하기 위해 필요합니다. 이러한 방법으로, 우리는 lipopolysaccharide가 (LPS) 선의 유두 효과적으로 모델링 유선염, 또는 염증을 통해 lactating 마우스를 유선에 주입되는 기술을 설명합니다. 증가 핵 요소 카파 B (NF-κB) 신호에이 시뮬레이션 감염 결과는 NF-κB 루시 페라 제 리포터 마우스 1 발광 생물 이미징을 통해 시각화.
이러한 방법을 개발에 우리의 궁극적 인 목표는 lactating 자주 빨갛게이 포함되어 선, 붓기, 그리고 면역 세포 침투 2,3에서 유선염과 관련된 염증을 연구하는 것이 었습니다. 따라서 절개 또는 위해 피부, 젖꼭지, 또는 선에 남긴 상처의 유형은 수 LPS을 소개하는 것을 절실히 알고 있었다그 접근 방식이 가능성 염증의 읽기 아웃 먹이고 있기 때문에 우리의 방법으로 이용 될 수 없습니다. 우리는 또한 특별히 만든 손으로 그린 피펫 또는 장소에서 이러한 전문 도구를 개최 마이크로의 사용을 필요로하지 스트레이트 포워드 방법을 원하는. 따라서, 우리는 상업적으로 이용 가능한 인슐린 주사기를 사용하고 그대로 유두의 유방 덕트에 에이전트를 주입하기로 결정. 이 방법은 성공하고 우리는 분사의 과정에서 중첩 추가 효과없이 LPS 주입과 관련된 염증을 공부 할 수있었습니다. 또한이 방법은 또한 시각 및 양적 NF-κB는 LPS 주입 된 선 4에서 신호를 증가 보여 NF-κB 루시 페라 제 리포터 유전자 변형 마우스와 발광 생물 이미징 기술을 활용.
이러한 방법은 궁극적으로 lactating 유선에서 모델 질병에 기술을하고자하는 다양한 분야의 연구자의 관심을 끌 수있는여기에 설명이 물질의 수의 주입에 활용 될 수 있으며, 만 LPS에 한정되지 않습니다.
Protocol
모든 동물 실험은 밴더빌트 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 트렌스 제닉 마우스 준비
- NGL (N F-κB-G FP-L uciferase) 기자 transgene (이전 1 설명)에 대한 긍정적 인 여성 생쥐는이 절차에 사용됩니다. 여성의 나이가 최소한 육주 때, FVB 야생 형 남성과 그들을 친구. 번식 (1 남자와 새장에서 최대 4 여성) 사용할 수 있습니다 하렘. (참고 :. FVB 변형 마우스는 같은 C57Bl6과 같은 어두운 변형 마우스도 사용할 수 있습니다 본 연구에 사용되었지만,이 마우스는 이전 이미지로 면도해야합니다.)
- 15일 후 결합에서 시작하여, 임신의 징후 (대형 돌출 둘레)에 대해 정기적으로 여성을 선택합니다. 각각의 여성은 임신 한 분리 지난 여성이 임신을 먼저하게되면 수컷은 번식 케이지에서 제거해야합니다.
- 분리 여성보기D 쓰레기가 나타납니다 출생의 날짜를 확인합니다. 최소 6 새끼의 쓰레기는 충분한 젖 분비가 필요합니다. 쓰레기의 출생 후 8 일이 프로토콜 (타임 라인 도식에 대한 그림 1 참조)와 함께 진행합니다.
2. 사출을위한 준비
- E.를 해산 0.1 μg / μl의 최종 농도로 PBS에서 대장균의 LPS. 이 솔루션, 또는 5 μg의 총 50 μl은 유선에 주입 될 것입니다. 제어 분사에 사용되는 PBS 혼자의 두 번째 튜브를 준비합니다.
- 박리 범위와 isoflurane 마취 장비를 설정합니다. 코 - 콘 장치는 마우스가 배치 될 해부 범위의 무대에 고정해야합니다. 좋은 광원은 범위 자체에서 또는 추가 스포트라이트에서 여부도 준비해야합니다.
- 설정이 완료되면, isoflurane 기계 및 공기 흐름을 시작합니다.
3. LPS의 Intraductal 주입
- LPS 솔루션 50 μl로 짧은 바늘 주사기를로드합니다. 옆을 설정하십시오.
- 첫째 번 호흡이 둔화되어 후 isoflurane 가득 상자에 여성을 배치하고하여 주입 할 마우스를 마취, 무대에 그녀를 이동하고 코 - 콘에서 그녀의 코를 넣습니다. 마우스가 완전히 anesthetized이 확인 발가락 핀치를 사용하십시오. 절차를 통해 마우스의 호흡을 모니터하고 그에 따라 isoflurane 수준을 조정할 수 있습니다. 댐이 절차 후 반환 할 수있을 때까지 여성이에서 촬영되었는지 새끼의 쓰레기를 포함하는 케이지는 신중하게 옆 설정해야합니다.
- 코트는 평면 얘긴 못 나오게하고 마우스의 낮은 복부의 오른쪽 # 4 사타구니 유선에 부착 젖꼭지를 시각화하기 위해 70 % 에탄올의 작은 방울을 사용합니다.
- 유두의 최적의보기에 대한 해부 범위를 집중하십시오. 조심스럽게 멀리 피부에서 젖꼭지를 잡아 들일 고급 집게 세트를 사용하지만 소중히하지 않거나 어떤 방식으로 젖꼭지를 손상.포셉은 단단히 조직을 조작 할 때 함께 고정 없지만, 유두에 스트레스의 최소한의 금액을 요구하는 빛을 보류와 함께 사용해서는 안됩니다.
- 부드럽게 제자리에 젖꼭지를 잡고 왼쪽 손에 포셉을 사용합니다. 천천히 오른손을 사용하여보기의 입력란에 사전로드 된 주사기를 가지고. 주사기는 더 재배치는 내용을 삽입하기 위해 발생이 없습니다 있도록 실시해야합니다.
- 일단 주사기가보기에, 젖꼭지의 중심에서 작은 ductal 개구에 신중하게 목표로하고 주사기를 삽입합니다.
- 손을 변경하지 않고, 주사기의 내용을 삽입하고 유두에서 바늘을 제거합니다.
- 제어 분사에 대한 PBS의 50 μl로 두 번째 주사기를로드합니다. 무대와 마우스의 낮은 복부의 다른 측면에 왼쪽 # 4 사타구니 유선의 유두를 가장 잘 볼 수있는 방법은 마우스를 변경할 수 있습니다. PBS-로드 주사기를 사용하여 단계 3.4-3.7를 반복합니다.
- 두 주사는 compl이되면, 어서! 마취를 중지하고 복구 케이지에 마우스를 이동합니다. 그녀는 5 분 내에 이동이된다고 보장 할 수있는 여성을 모니터링 할 수 있습니다. 마우스가 1 시간에 복구 케이지에 남아 있도록 허용합니다. 복구 1 시간 후, 새끼 그녀의 쓰레기와 함께 케이지에 여자를 다시 넣습니다. 이미지로 이동하기 전에 마우스는 정기적으로 6 시간의 포스트 분사에 대한 모니터링해야합니다. 우리의 경험에서 더 불리한 결과가 주입 및 이미징 사이의 기간 동안 여성이나 새끼 하나에 언급되지 않았습니다. 고민의 흔적이 (물고 또는 분사 사이트, 일반 혼수를 지키고, 예를 들어 hunched 자세) 또는 새끼 (NO 운동, 피부의 푸른 색) 여성에서 관찰하는 경우 그러나, 실험은 중단되어야한다.
4. 발광 생물 이미징은 NF-κB 활동을 시각화하는 방법
- 일단 마우스가 이미지 시설로 이송되었으며, 소프트웨어를 열고 기계를 초기화하여 이미징 절차를 시작합니다. 이 켜십시오마취가 상자 및 이미징 챔버 모두 흐르는 있도록 oflurane 기계 및 공기 흐름.
- 맑은 마취 상자에 isoflurane 마취에서 마우스를 놓습니다. 호흡이 둔화되면 마우스를 완전히 anesthetized이 확인 발가락 핀치를 사용합니다. 그런 다음, 멸균 주사기를 사용하여 복고풍 궤도 분사 (5)에 의해 마우스에 luciferin 기판의 100 μl를 삽입.
- 즉시 이미징 챔버에 마우스를 전송하고이 자리 잡고 코 - 콘 isoflurane에서 그녀의 코를 넣습니다. 마우스가 위로 향한해야합니다. 테이프와 함께 무대에 각각 발을 고정합니다.
- IVIS 소프트웨어에 입력 적절한 설정을 하얀 빛 사진 이미지와 발광 생물 활동의 이미지를 모두 취할 수. 노출 시간은 10 초 있어야합니다. 이미지를 취득.
- 일단 이미지가 획득 한, 마우스가 복구 할 수 있도록하고 그녀의 새끼와 함께 우리에 그녀를 배치하고 주기적으로 모니터링 할 수 있습니다.
- 사진 및 발광이미지는 자동으로 중첩과 그림 2에서와 같이 화면에 표시됩니다. 마우스의 낮은 복부의 각 측면 (PBS 주입 된 선 이상 하나 LPS 주입 된 선에 하나)를 통해 관심 지역 또는 동일한 크기의 "ROI"원을 배치하여 획득 한 이미지를 분석합니다. 광자로 읽기 시작했다. 번호는 (그림 2B 참조) 각 투자 수익 (ROI) 이내에 감지 발광을 나타내는 표시됩니다. 통계 분석에서이 번호를 사용합니다.
- 최적의 이미지를 표시하려면 추가로 표시 신호의 임계 값을 조정합니다. 이 전체 발광을 읽어 아웃 변경되지 않습니다하지만, 제어 및 LPS-처리 선 사이의 차이를 배경 신호를 제거하고 시각화 할 수 있습니다. PBS 주입 된 글 랜드 배경 신호의 무료 될 때까지 표시 발광의 양을 줄이십시오. 이 그림 2에서 볼 수있는 이미지에서 아직 뚜렷한 LPS-처리 선에서 증가 신호 상태를 유지해야합니다.
- Additiona단백질과 RNA의 assays를 포함한 리터 분석은, 6 사후 여성에서 수집 한 유방 조직을 완료 할 수 있습니다.
5. 대표 결과
이러한 방법의 interpretable 결과를 얻으려면, LPS (또는 PBS) 인접 조직은 그대로두고, 단지 유방 덕트에 주입해야합니다. 젖꼭지를 둘러싼 피하 조직에 주입 오히려 시뮬레이션 감염보다 부상으로 인해 염증이 발생할 수 있습니다. 기술을 배우고 PBS에 희석 trypan 파랑 염료의 주입은. 도움이 될 것입니다 그림 3A는 PBS에 trypan 파랑의 100 μl를 주입 성공적으로 주입 선을 보여줍니다. 도시 된 바와 같이, 만 ductal 나무 주입 솔루션으로 가득해야하고, 사출 사이트에서 더 bolus이 없어야합니다. 이런 상황에서는 A "bolus"는이 유두에서 또는 ductal 나무에 주입하지 않고 젖꼭지를 주변 조직에 주입 액체의 구축이다. 이 쉬입니다그림 3B에서 자신의. 그림 3에 표시된 연습 주사는 젖 분비의 날 21시 여성에 완성 된 되오니, 이용에 참고하여주십시오. 젖 분비의 높이 (일 8-10, LPS는 현재 프로토콜을 사용하여 분사되는 단계) 동안, 우유 풍부한이며 관을 시각화 및 분사가 제대로 완료되었는지 확인하기 어렵습니다. 따라서, 젖 분비에 나중에 점은 연습 주사를위한보다 나은입니다.
의 유방 덕트 결과에 LPS의 성공적인 주입은 선 (腺)에서 NF-κB의 활동을 증가했다. 이 IVIS 이미징시 기자 마우스에 분명해야하고, LPS 주입 된 선이 (평균도 2에 도시 된 바와 같이, PBS 주입 된 선보다 실질적으로 더 높은 루시 페라 제 활동을 (광자 수에 의해 측정)이해야 LPS의 선은 읽 PBS 제어 신호 200 %). 빌려와 LPS-처리 분비 내 발광에 통계적으로 의미있는 증가contralateral 제어 ared은 4 마우스 4 그룹의 완성 불구하고 달성했다. 또 다른 연구는 또한 E. 하나의 intraductal 유방 주사를 활용 한 NF-κB 기자 트렌스 제닉에 대장균 또는 LPS. 우리 자신의 작품과 마찬가지로,이 저자는 E. 후 기자 활동을 6 시간에서 크게 증가했다 대장균 주입 2.
이전의 조작에도 기준에서 이미징 때 뇌 및 기타 복부 장기의 제정 NF-κB 활동으로 인해주의를하시기 바랍니다, 우리의 기자 마우스의 머리와 abdomens 지속적으로 신호를 보여줍니다. 따라서이 신호는이 실험에 관한 무시해야합니다. 명백한 신호는 이미지 읽기 아웃은 PBS의 선에 배경 발광을 최소화하기 위해 조정 한 후 LPS 주입 된 유선 내에 유지됩니다. 그림 2는 배경이 감소하여 이미지를 보여줍니다.
선에 실패한 주입 거예요유두에 손상 가능성이 가장 높은 결과를 가져올 수도 있습니다. 이 영상에 분명합니다 지적, 피부 수준의 염증의 원인이됩니다. 남긴 상처 신호의 이러한 유형의 관에 성공적으로 LPS 주입 후 본 바와 같이, 선 전역에서 나오는 아니라 매우 강하고 피해가 발생한 유두 영역에 국한 될 것입니다.
1 그림. 절차의 개략적.
그림 2. 배경이 감소하면서 IVIS 발광 생물 이미징.의 대표 결과는 (A) LPS 주입 된 선으로 증가 루시 페라 제 활동을 공개, 이미지 획득. (B)에서 이미지이자 quantifications의 지역이 추가로. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3 사례 분사 :.. 유선은 intraductal 주입을 통해 색소를 주입 유두를 통해 전달의 정확성을 테스트하려면, 젖 분비의 날 21에서 마우스가 PBS에 희석 trypan 푸른 염료의 100 μl를 주입했다. 희생 후, 선은 시각화를 위해 노출되었다. (A) 성공 분사와 유두에서 염료의 (B) bolus.
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Discussion
다음은 유전자 변형 NF-κB의 기자 마우스 및 모델 유선염에 최적화 된 사출 기술을 활용, 유방 조직의 염증이 가장 일반적으로 세균 감염에 의해 발생. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 intraductal 주사 자체입니다.
실제로, intraductal 주입이 성공했는지 여부를 보통 명백합니다. 대리인의 주입 (LPS 또는 PBS)는 유체 생각해야하며 주사기가납니다으로 저항 거의가 있어야합니다. 가장 일반적인 함정은 선에 방해 통로로 이어지는 유두에 손상입니다. 이 해부 범위를 통해 유두를보고하여 시각화 할 수 있습니다. 손상 충분한 연습 젖꼭지를 조작 진미, 그리고 (31G 이상) 바늘 만 작은이 절차를 수행하는 데 사용됩니다 수 있도록하여하여 방지 할 수 있습니다. 바늘이 제대로거나 위치하지 않는 경우 또한, 그것은 중반 사출, 빌드를 미끄러 져LPS 또는 PBS의 업은 주입 사이트에서 형성 할 수 있으며 액체가 관을 전면적으로 퍼지다하지 않습니다. 이 경우, 여러분은 시각적으로 유두 주변의 피부에 액체의 축적를 볼 수 있습니다, 또는 분사 유체 생각하지 않습니다. 이 함정은 완전히 제거 할 수 있지만, 사건은 연습 의해 적절한 도구의 사용을 통해 대부분 방지 할 수 있습니다.
주사를 보시려면 여기를 사용하는 기술은 특정 실험에 대한 중요했다. 유선에 intraductal 분사에 대한 일부 게시 방법은 절단 / 피부 7,8 통해 유두 및 / 또는 절개를 제거해야합니다. 이 경우, 연구의 엔드 포인트를 기본으로 선 내에서 NF-κB 관련 염증을 결정하는 것이 었습니다, 피부 나 유두의 절개 또는 섭동은 바람직하지 않은이었고 먹이고 싶은 조직 손상으로 인해 염증 신호를 유발 것 LPS 유도 신호.
또한, 우리주입은 젖꼭지 제거 9, 10을 사용하지 않는 분사에 대한 여러 가지 다른 방법에서와 같이 상업적으로 이용 가능한 인슐린 주사기와와 그린 micropipette 또는 마이크로의 사용없이 완료되었습니다. lactating 유두가 약간 확대와 젊은, 처녀 마우스 유두보다 삽입하기 더 쉬워이기 때문에 우리는이 만 가능했다 생각합니다. 처녀 쥐를 삽입하려면 더 엄격한 도구가 필요할 수 있습니다.
제대로 수행하면 마우스 유선의 덕트에 LPS를 주입은 NF-κB 루시 페라 제 리포터 활동의 증가에 의해 시각화와 같은 지역화 된 염증을 일으키는 그림 2에서 분명하다. 기타 E. 중 하나를 통해, 급성 유선염이 모델을 더 광범위하게 분석 한 유선 및 조직 2-3, 8, 10-14의 후속 분석에 대장균 또는 LPS 주입. 많은 연구 결과 가운데,이 연구는 설명이 염증 반응 전S CD14와의 상호 작용에 의해 조절, 그리고 그게 바로 유방 폐포 대 식세포에 의해 규제 호중구 유입에 결과를 표시합니다. 저희 이전에 다음 ID로 출판 일 4뿐만 아니라 다른 2 개의 유선염이 모델이 더 모유 수유 여성의 많은 3-33 %까지이 고통스러운 감염으로 고통 곳 인간의 관련 메커니즘과 치료학을 공부하는 데 사용할 수 있다는 것을 모두에 제안 15 일 (비율은 연구 방법론에 따라 다릅니다.) 또한 유선염 매년 16 우유 생산에 큰 손실로 이어지는 비용이 많이 드는 질병입니다 낙농 산업의 사람들을위한 유용한 연구 도구를 입증 할 수 있습니다.
마지막으로, 여기와 비슷하게 작동 HLL 기자 마우스 17 사용 NGL 형질 기자 마우스는 확인 수량화하고, 질병의 다양성과 급성 등의 개발 모델에서 NF-κB 활동의 위 또는 아래 규정을 추적하는 수많은 연구에 사용 된 공기가 신선한 빈터부상, 폐암,기도 브랜칭의 morphogenesis, 인슐린 저항성, 비만, 그리고 심근 경색 1, 17-21. 이 모델이 기자 트렌스 제닉의 유틸리티의 추가 예제를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 F Yull와 재향 군인의 담당 부서 (TS 블랙웰)에게 수여 NIH 보조금 CA113734로 운영되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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