Drosophila In Vivo Imágenes de calcio: Un método para la toma de imágenes funcionales de la actividad neuronal

- Realizar imágenes in vivo de calcio en el sistema nervioso Drosophila, dirigirse a la expresión de un indicador de calcio genéticamente codificado, como GCaMP, a las neuronas de interés. Cuando las neuronas disparan un potencial de acción, la rápida despolarización de la membrana hace que se abran canales de calcio bloqueados por voltaje, lo que conduce a una afluencia de calcio extracelular a la célula.

GCaMP es una proteína de fusión en la que la proteína fluorescente verde mejorada, o EGFP, se modifica y fusiona con el fragmento M13 de la cadena de luz de miosina en la N-terminus, y a la proteína de unión al calcio, calmodulina, en la terminal C. El calcio se une a la calmodulina, desencadena cambios de conformación en GCaMP, causando un aumento en la fluorescencia de la proteína.

Para realizar cambios de imagen en la fluorescencia GCaMP como proxy para la actividad neuronal in vivo, exponga la región del sistema nervioso con actividad anticipada.

En el protocolo de ejemplo, veremos imágenes funcionales GCaMP que se utilizan para visualizar las respuestas en los cuerpos de hongos del cerebro durante el aprendizaje asociativo olfativo.

- Para la visualización de los indicadores de calcio basados en GFP, afinar el láser de un microscopio multifoto equipado con un láser infrarrojo y un objetivo de inmersión en agua, instalado en una mesa aislada de vibración, a una longitud de onda de excitación de 920 nanómetros, e instalar un filtro de paso de banda GFP. Usando la perilla de ajuste Z gruesa, escanear a través del eje z del cerebro para localizar la región cerebral de interés. tamaño a 512 por 512 píxeles y seleccione la región a escanear, teniendo en cuenta el tiempo de escaneo calculado para cada fotograma para lograr una velocidad de fotogramas de al menos 4 Hertz.

Para la visualización transitoria de calcio evocada por olores, inicie un paquete macro preprogramado capaz de vincular el software de adquisición de imágenes y el programa de entrega de olores e inicie la medición en el software del microscopio durante 6,25 segundos para establecer un valor de línea base F0. En el sistema de entrega de olores, entregar un estímulo de olor de 2,5 segundos, indicado aquí por la iluminación de LED, desencadenado por la apertura y cierre de válvulas específicas de la copa de olor, seguido de 12,5 segundos de grabación al final del desplazamiento del olor.

Para realizar el acondicionamiento asociativo en esta configuración, utilice el sistema de entrega de olores controlado por ordenador para presentar el estímulo acondicionado más olor durante 60 segundos, junto con descargas eléctricas de 12 90 voltios. Después de un descanso de 60 segundos, presente el estímulo de la condición menos olor solo durante 60 segundos sin descarga eléctrica.