Drosophila Aktivitätsmonitor (DAM): Eine Methode zur Messung der Bewegungsaktivität bei Fliegen

Overview

Dieses Video beschreibt das Drosophila Activity Monitor (DAM) System, das verwendet wird, um die Aktivität des Bewegungsapparates zu verfolgen. Die Forscher verwenden Aktivitätsdaten, die vom DAM gesammelt wurden, um zirkadiane Rhythmen in Fruchtfliegen zu untersuchen. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Man Fliegen im Gerät lädt und Aktivitätsdaten für zirkadiane Experimente aufzeichnet.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Laden von Fliegen in Aktivitätsröhren und Bewegungsüberwachungssystem

1. Bevor Sie Fliegen in Aktivitätsrohre laden, schalten Sie die Inkubatoren ein, mit denen die Aktivitätsmonitore untergebracht werden. Stellen Sie die Temperatur mit den Inkubatorsteuerungen ein und stellen Sie das Licht-Dunkel-Regime mit dem LICHTregler DAM System oder dem Inkubatoren-eigenen Lichtsteuerungssystem nach dem gewünschten experimentellen Design ein. Die Zeit, die zum Laden von Fliegen in Aktivitätsrohre erforderlich ist, sollte ausreichen, damit sich die Temperatur stabilisiert.
2. Anästhesisieren Sie die Fliegen mit Kohlendioxid.
3. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um eine einzelne Fliege vorsichtig in ein Aktivitätsrohr zu übertragen.
4. Schnappen Sie sich die Mitte eines einzelnen Garnstücks, das etwa einen halben Zoll mit feiner Zange ist, und legen Sie das Garn in das Non-Food-Ende des Aktivitätsrohrs ein, um die Öffnung zu stopfen und zu verhindern, dass die Fliege während des Experiments entweicht, während gleichzeitig Luftstrom in das Rohr ermöglicht wird. Alternativ können Kunststoffkappen mit kleinen Löchern (Trikinetics, Inc.) verwendet werden, um die Öffnung zu schließen.
5. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche auf ihren Seiten gelegt werden, bis die Fliege erwacht, sonst besteht die Gefahr, dass die Fliege an der Nahrung hängen bleibt.
6. Setzen Sie die Rohre in die Aktivitätsmonitore ein. Mit dem neueren, kompakteren Modell der Trikinetics-Monitore (Trikinetics DAM2 und DAM2-7) ist es notwendig, die Rohre mit Gummibändern an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass der Infrarotstrahl das Rohr in der Mittelposition passiert.
7. Setzen Sie die Aktivitätsmonitore in die Inkubatoren ein und schließen Sie sie über die Telefondrähte an das Datenerfassungssystem an. Überprüfen Sie die Dam-System-Sammlungssoftware, um sicherzustellen, dass alle Monitore ordnungsgemäß angeschlossen sind und Daten von jedem von ihnen gesammelt werden. Der Monitor strahlt Infrarotlichtstrahl über die Mitte jeder Glasaktivitätsröhre aus. Die bewegungsmotorische Aktivität der Fliegen wird als rohe Binärdaten aufgezeichnet, bei denen "eins" jedes Mal aufgezeichnet wird, wenn der Infrarotstrahl gebrochen wird, oder ein "Null" aufgezeichnet wird, bei dem der Infrarotstrahl nicht gebrochen wird.

2. Experimentelles Design zur Aufzeichnung von Daten zur Bestimmung der circadianen Periodizität und Amplitude

1. Fliegen werden synchronisiert und eingespannt, indem sie für 2-5 volle Tage dem gewünschten Licht-Dunkel-/Temperaturregime (LD) und Temperaturregime aussetzen. Die am häufigsten verwendete Zustand ist ein heller/dunkler Zyklus von 12 Std. Hell/ 12 Std. dunkel (12:12 LD) bei 25 °C. Diese allgemein anerkannte Standardbedingung basiert im Wesentlichen auf dem Gedanken, dass Drosophila von afro-äquatorialen Orten stammt. Beim Studium der zirkadianen Rhythmen gibt es eine Phraseologie, mit der man sich vertraut machen muss. Für dieses Protokoll ist die Zeit, zu der die Lichter im Inkubator einschalten, definiert als zeitgeber zeit0 (ZT0) und alle anderen Zeiten relativ zu diesem Wert (z. B. in einem 12:12 LD-Zyklus ist ZT12 die Zeit, in der die Lichter ausgeschaltet sind). Unter Standard 12:12 LD Bedingungen, wildTyp Drosophila melanogaster zeigen in der Regel zwei Anfälle von Aktivität; eine um ZT0 als "Morgen"-Spitze und eine andere um ZT12 als "Abend"-Spitze bezeichnet (Abbildung 1A). Die Morgen- und Abendkämpfe werden von der endogenen Uhr gesteuert, aber es gibt auch "erschreckende" Reaktionen, die vorübergehende Ausbrüche von Aktivität als Reaktion auf die hellen/dunklen Übergänge sind. Zwei Tage Eingewöhnung sind das Minimum und könnten z.B. in großfausdauernden Bildschirmen eingesetzt werden, die zeitaufwändiger sind und darauf ausgerichtet sind, freilaufende Zeiten bei konstanter Dunkelheit zu messen (siehe unten, Schritt 2). Wenn Sie jedoch daran interessiert sind, die Aktivitätsmuster während eines täglichen Hell-Dunkel-Zyklus zu studieren, ist es vorzuziehen, die Fliegen für 4-5 Tage in LD zu halten, um mehr Daten zu erhalten. Im Wesentlichen wird die Erhöhung der Anzahl der Fliegen oder der Anzahl der LD-Tage in der endgültigen Datenanalyse (z. B. Pooldaten aus den letzten zwei Tagen im Wert von LD-Lokomotor-Aktivität) zuverlässigere Tagesaktivitätsprofile und Messungen erzeugen (z. B. Zeitpunkt des Morgen- oder Abendspitzen). Darüber hinaus variiert die tägliche Verteilung der Aktivität in Abhängigkeit von Tageslänge (Fotoperiode) und Temperatur. Ein Hauptgrund für die Änderung der Photoperiode oder Temperatur vom Standard ist, wenn man untersuchen wollte, wie tägliche Aktivitätsmuster saisonale anpassungsbedingt durchlaufen (z.B. Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol). (2007)). Drosophila kann auch auf tägliche Temperaturzyklen (z.B. Glaser und Stanewsky, Curr Biol) eingespannt werden. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Temperaturzyklen, die nur um 2-3 °C variieren, reichen aus, um Aktivitätsrhythmen zu trainieren.
2. Freilaufende Bewegungsaktivitätsrhythmen werden unter konstanten Dunkel- und Temperaturbedingungen nach Abschluss der Entrainingszeit gemessen (siehe oben, Schritt 1). Die Einstellung für den Lichtzyklus kann jederzeit in der dunklen Phase am letzten Tag der LD so geändert werden, dass der folgende Tag des Experiments den ersten Tag der DD darstellt. Sieben Tage DD-Datenerfassung reichen aus, um die zirkadiane Periode und Amplitude (z.B. Kraft oder Rhythmusstärke) von Fliegen zu berechnen. Im Allgemeinen ist eine Stichprobengröße von mindestens 16 Fliegen erforderlich, um zuverlässige Freilaufzeiten für einen bestimmten Genotyp zu erhalten. Auch wenn man nur daran interessiert ist, die Tagesaktivität zu messen, ist es immer noch am besten, die freilaufenden Perioden der Fliegen in DD zu messen, da Veränderungen in der endogenen Periode die tägliche Verteilung der Aktivität in LD verändern können. Beispielsweise weisen Fliegen mit langen endogenen Perioden in der Regel verzögerte Abendspitzen in LD auf (siehe Abbildung 2).
3. Am Ende des Experiments werden mit der SOFTWARE DAM System gesammelte Binärdaten auf ein tragbares Datenspeichergerät, z.B. USB-Stick, heruntergeladen.
4. Die binären Rohdaten werden mit DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) verarbeitet und bei der Analyse zirkadianer Parameter in 15 und 30 Minuten in 15 und 30 Minuten-Abschnitte oder bei der Analyse von Schlaf-/Ruheparametern in 15- und 30-Minuten-Abschnitte zusammengefasst. Derzeit sind fünf zusammenhängende Minuten Inaktivität die Standarddefinition von Schlaf/Ruhe in Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho und Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
5. Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten, die auf dem DAM-System gesammelten Daten zu analysieren, aber wir werden nur diese Methoden bereitstellen, die routinemäßig in unserem Labor verwendet werden. Microsoft Excel wird verwendet, um Genotyp verschiedenen Beispielgruppen zuzuweisen. FaasX software (M. Boudinot und F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankreich) oder Insomniac (Matlab-basiertes Programm; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) werden verwendet, um zirkadiane (z. B. Periode und Leistung) bzw. Schlaf/Ruhe (z. B. prozentualen Schlaf, mittlere Ruhekampflänge) Parameter zu untersuchen.

Representative Results

Abbildung 1: Eduction-Graphen, die mit FaasX erzeugt werden und die tägliche bewegungsmotorische Aktivitätsrhythmen rhythmischer Wildtypfliegen (w pro⁰ Fliegen mit einem per+-Transgen) (A und B) vs. arrhythmische w pro⁰ Mutanten (C und D) zeigen. Männliche Fliegen wurden bei 25 °C gehalten und für 4 Tage in 12:12 LD (hell: dunkel) Zyklen, gefolgt von sieben Tagen in DD (konstante Dunkelheit) eingespannt. Für jede Fluglinie wurden die Aktivitätsstufen der einzelnen Fliegen (n>32) in 15-Minuten-Behältern gemessen und dann gemittelt, um einen Gruppenprofilvertreter für diese Linie zu erhalten. A und C zeigen die Aktivitätsdaten, die aus der Mittelung des zweiten und dritten Tages im Hell-Dunkel-Zyklus (LD 2-3) generiert wurden, während B und D die Aktivitätsdaten zeigen, die aus der Mittelung des zweiten und dritten Tages bei konstanter Dunkelheit (DD 2-3) generiert wurden. Vertikale Balken stellen die Aktivität (in beliebigen Einheiten) dar, die in 15-Minuten-Behältern während der Hellenperiode (hellgrau) oder der dunklen Periode (dunkelgrau) aufgezeichnet wird. Horizontale Balken am unteren Rand von LD-Eduktionsdiagrammen; weiß, Leuchtet an; schwarz, Lichter aus. ZT0 und ZT12 stellen den Anfang bzw. das Ende der Photoperiode dar. Für DD-Eduktionsdiagramme; CT0 und CT12 stellen den Beginn und das Ende des subjektiven Tages bei konstanten dunklen Bedingungen dar, die durch den grauen Balken bezeichnet werden. In Panel A, M = Morgenspitze; E = Abendspitze. Die Pfeile in Panel A stellen das vorausschauende Verhalten von Morgen- und Abendspitzen dar, die bei Wildfliegen beobachtet werden, die in w pro⁰ Arrhythmikfliegen fehlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Doppelplot-Actogramm, das mit der FaasX-Software generiert wird, um bewegungsmotorische Aktivitätsdaten von Fliegen mit Wildtyp, kurzer oder langer Periode zu veranschaulichen. Männliche Fliegen wurden bei 25 °C gehalten und für 4 Tage in 12:12 LD-Zyklen eingeenkt, gefolgt von acht Tagen in konstanter Dunkelheit (DD) für die Berechnung der freilaufenden Periode (t) mit Cycle-P in FaasX. Drei Fliegenlinien mit Wildtypperiode [w pro⁰; pro+; pro⁰ mutiertem Tragen pro+ Transgen], lange Periode [w pro⁰; per(S47A); pro⁰ mutiertem Tragen pro(S47A) Transgen] und kurzer Zeitraum [w pro⁰; per(S47D); pro⁰ mutiertes Tragen per(S47D) Transgen] sind hier dargestellt (Chiu et al. 2008). X-Achse stellt ZT- bzw. CT-Zeit in LD bzw. DD dar, und Y-Achse stellt Aktivitätszahlen (willkürliche Einheiten) dar, die in 15-Minuten-Abschnitte summiert sind. Die rot gepunkteten Linien verbinden die Abendspitzen für jeden Tag der Experimente. Beachten Sie, dass während der LD die Abendspitze 'gezwungen' wird, die Synchronität mit dem 24-Stunden-LD-Zyklus beizubehalten, während in DD die freilaufende Periode von 24 Stunden abweichen kann. Zum Beispiel, für Fliegen mit kurzen Zeiträumen wird der Zeitpunkt der Abendaktivität früher an jedem aufeinanderfolgenden Tag in DD auftreten (wenn auf einer 24-Stunden-Zeitskala dargestellt, wie hier gezeigt), während eine Verschiebung nach rechts für Fliegen mit langen Zeiträumen beobachtet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014