Overview
本视频介绍了一种在体外分离和无菌培养胚胎C.elegans细胞的方法。
Protocol
1. 胚胎细胞分离
- 使用层压流罩在无菌条件下执行下一步操作。虽然动物是细菌板上的礼服，洗涤和处理与裂解溶液含有漂白剂应消除大多数，如果不是所有的细菌。因此，在程序的此时使用层压罩可防止鸡蛋悬架受到新的污染。
- 将盆栽鸡蛋重新放入 1 毫升 2 毫克/毫升的辣椒酶（鸡蛋缓冲 pH 6.5 中的库存），并将其转移到新的无菌 15 毫升圆锥管中。在室温下摇动管子10-30分钟。确切的孵化时间根据酶的新鲜度和房间的温度而变化，因此应确定每次制备。建议在10分钟的孵化后，在倒置细胞培养显微镜下开始监测卵子。注意：根据我们的经验，低pH度会增加辣椒酶酶活性。因此，我们使用pH 6.5的鸡蛋缓冲器溶解辣椒酶（上面报告的食谱，其中pH值使用NaOH调整为6.5）。
- 当约80%的蛋壳被辣椒酶处理（图1 A-B）消化时，用离心机将卵子在900 x g（约2，500 rpm）下颗粒3分钟。使用 P1000 吹笛器和无菌提示，小心地去除超标，并添加 3 毫升 L-15 介质。
- 将鸡蛋转移到直径为 6 厘米的板中，然后使用装有 18 G 针的 10 毫升无菌注射器轻轻分离细胞。通过将一滴悬浮剂放入新鲜的塑料培养皿中，并在显微镜下观看，监控分离程度。在此过程中，不要将空气吸进注射器中，以免损坏细胞。继续分离，直到约80%的细胞分离。
- 使用无菌 5μm 米利波雷过滤器过滤悬架。细胞悬架必须过滤，以去除细胞团块、未消化的卵子和孵化的幼虫。通过过滤器过滤额外的 4-5 毫升新鲜 L-15 介质以恢复所有细胞。在过滤过程中不要过度使用武力，以免损坏过滤器和/或细胞。
2. 培养细胞
- 以离心机将分离的细胞以 900 x g（约 2，500 rpm）的速度旋转 3 分钟。使用 P1000 吹笛器和无菌提示小心地去除所有超标。在完整的L-15中等和板1ml/井中补充被撬的细胞。添加的介质量取决于使用的 8P 板数、板上蠕虫的汇合以及将在细胞上进行的实验类型。细胞密度可以通过血细胞仪确定。对于贴片夹记录电镀密度约 230，000 细胞/cm2是最佳选择。
- 将 24 个井板放在装有湿纸巾的塑料 Tupperware 容器中，以避免培养介质蒸发。将容器存放在 20 °C 的潮湿孵化器中，并储存在环境空气中。
- 当GFP标记的形态分化和表达完成时，这些细胞通常在24小时内准备好进行实验。细胞可以在培养中保存长达2周，但它们通常最健康，在电镀后7-9天。需要每天更换一次来维持健康的细胞。
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Representative Results
图1。C. 在奇蒂纳酶治疗前后胚胎。（A）接触辣椒酶前的鸡蛋照片。箭头指向胚胎周围的透明和完整的蛋壳。（B）用辣椒酶处理鸡蛋10分钟。蛋壳已被消化，在胚胎周围不再可见。箭头指向从蛋壳中释放出的三倍胚胎。蓝色的盒子围绕着一组仍然相互连接的细胞。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
