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Encyclopedia of Experiments

Digestión enzimática y disociación manual: un método para preparar embriones C. elegans para el cultivo celular

Overview

Este video introduce un método para aislar y cultivar estérilmente células embrionarias C. elegans in vitro.

Protocol

1. Disociación de células embrionarias

  1. Realice los siguientes pasos del procedimiento en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar. Mientras que los animales están vestidos en placas de bacterias, los lavados y el tratamiento con la solución de lisis que contiene lejía deben eliminar la mayoría si no todas las bacterias. Por lo tanto, el uso de una capucha laminar en este punto del procedimiento evita una nueva contaminación de la suspensión del huevo.
  2. Resuspend huevos peletizados en 1 ml de 2 mg/ml de quitosa (stock en tampón de huevo pH 6.5) y transfiéralos a un nuevo tubo cónico estéril de 15 ml. Balancee el tubo durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. El tiempo exacto de incubación cambia de acuerdo con la frescura de la enzima y la temperatura de la habitación y, por lo tanto, debe determinarse para cada preparación. Se recomienda comenzar a monitorear los huevos bajo un microscopio de cultivo celular invertido después de 10 minutos de incubación. Nota: en nuestra experiencia, el pH bajo aumenta la actividad enzimática de la cintinasa. Por esta razón utilizamos el tampón de huevo en el pH 6.5 para disolver la cintinasa (receta notificada anteriormente, donde el pH se ajusta a 6.5 usando NaOH).
  3. Cuando ~ 80% de las cáscaras de huevo son digeridas por el tratamiento de cintinasa(Figuras 1 A-B),peletizar los huevos por centrifugación a 900 x g (~ 2,500 rpm) durante 3 min. Con un pipeteador P1000 y puntas estériles, retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 3 ml de medio L-15.
  4. Transfiera los huevos a una placa de 6 cm de diámetro y disocia suavemente las células utilizando una jeringa estéril de 10 ml equipada con una aguja de 18 G. Monitoree el grado de disociación colocando una gota de suspensión en una placa de plástico petri fresca y viendo debajo del microscopio. No a aspirete aire en la jeringa durante este procedimiento para evitar dañar las células. Continúe la disociación hasta que ~ 80% de las células se disocian.
  5. Filtre la suspensión con un filtro estéril de 5 μm Millipore. Las suspensiones celulares deben filtrarse para eliminar los grumos celulares, los huevos no digeridos y las larvas incubadas. Filtre 4-5 ml adicionales de medios L-15 frescos a través del filtro para recuperar todas las celdas. No utilice fuerza excesiva durante el paso de filtración para evitar dañar el filtro y/o las células.

2. Células de cultivo

  1. Peletizar las células disociadas por centrifugación a 900 x g (~2.500 rpm) durante 3 min. Usando un pipeteador P1000 y puntas estériles retire cuidadosamente todo el sobrenadante. Resuspend las células peletadas en L-15 completo medio y placa 1 ml/pozo. La cantidad del medio añadido depende del número de placas 8P utilizadas, la confluencia de los gusanos en las placas y el tipo de experimentos que se realizarán en las células. La densidad celular se puede determinar mediante un hemociclo. Para las grabaciones de abrazadera de parches, la densidad de chapado de ~ 230.000 celdas/cm2 es óptima.
  2. Guarde la placa de 24 pozos en un recipiente tupperware de plástico que contiene toallas de papel mojado para evitar la evaporación del medio de cultivo. Guarde el recipiente en una incubadora humidificada a 20 °C y aire ambiente.
  3. Las células suelen estar listas para los experimentos dentro de las 24 horas cuando se completa la diferenciación morfológica y la expresión de los marcadores GFP. Las células se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 2 semanas, pero por lo general son más saludables hasta 7-9 días después del chapado. El medio necesita ser reemplazado una vez al día para mantener las células sanas.

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Representative Results

Figure 1
Figura 1. C. embriones elegans antes y después del tratamiento con quitosa. (A) Fotografía de óvulos antes de la exposición a la quitosa. La flecha apunta a la cáscara de huevo transparente e intacta que rodea un embrión. (B) Huevos tratados con quitosa durante 10 min. Las cáscaras de huevo han sido digeridas y ya no son visibles alrededor de los embriones. Las flechas apuntan a embriones triples liberados de la cáscara de huevo. La caja azul rodea un grupo de celdas que todavía están unidas entre sí.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

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Digestión enzimática y disociación manual: un método para preparar <em>embriones C. elegans</em> para el cultivo celular
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Fuente: Sangaletti, R. y Bianchi, L. Un método para la cultectación de células embrionarias C. elegans. J. Vis. (2013). 

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