Overview
이 비디오는 시험관 내에서 배아 C. 엘레간 세포를 분리하고 살균하는 방법을 소개합니다.
Protocol
1. 배아 세포 해리
- 라미나르 플로우 후드를 사용하여 멸균 조건하에서 절차의 다음 단계를 수행한다. 동물은 박테리아 접시에 가운 동안, 표백제가 포함 된 용액을 가진 세차및 치료는 모든 박테리아가 아니라면 대부분제거해야합니다. 따라서 절차의이 시점에서 라미나르 후드를 사용하여 계란 현탁액의 새로운 오염을 방지할 수 있습니다.
- 펠렛 달걀을 2 mg/ml 치티나아제 1ml(계란 완충물 pH 6.5의 재고)로 재차 중단하고 새로운 멸균 15ml 원추형 튜브로 옮긴다. 실온에서 10-30 분 동안 튜브를 흔들어. 정확한 잠복기 시간은 효소의 신선함과 실내 온도에 따라 변경되므로 각 준비에 대해 결정되어야 합니다. 인큐베이션의 10 분 후에 반전된 세포 배양 현미경의 밑에 계란을 감시하는 것을 시작하는 것이 좋습니다. 참고: 우리의 경험에서, 낮은 pH는 치티나아제 효소 활동을 증가시킵니다. 이러한 이유로 우리는 pH 6.5에서 계란 버퍼를 사용하여 치티나아제 (위에 보고된 레시피, PH가 NaOH를 사용하여 6.5로 조정되는 경우)를 용해합니다.
- ~ 달걀 껍질의 80%가 치티나제 처리(그림1 A-B)에의해 소화되면, 계란을 원심분리로 3분 동안 900xg(~2,500rpm)로 환원분리한다. P1000 피펫터와 멸균 팁을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거하고 L-15 배지 3ml를 추가합니다.
- 계란을 직경 6cm 플레이트로 옮기고 18G 바늘이 장착된 10ml멸균 주사기를 사용하여 세포를 부드럽게 분리합니다. 신선한 플라스틱 페트리 접시에 서스펜션 한 방울을 넣고 현미경으로 볼 수 있도록 해리의 정도를 모니터링합니다. 이 절차 동안 주사기에 공기를 흡인하지 말고 세포를 손상시키지 마십시오. 세포의 80%가 해리될 때까지 해리를 계속한다.
- 멸균 5 μm 밀리포어 필터를 사용하여 서스펜션을 필터링합니다. 세포 현탁액은 세포 덩어리, 소화되지 않은 계란 및 부화 애벌레를 제거하기 위해 필터링해야합니다. 필터를 통해 4-5 ml의 신선한 L-15 미디어를 추가로 필터링하여 모든 세포를 복구합니다. 여과 단계에서 과도한 힘을 사용하지 말고 필터 및/또는 세포를 손상시키지 마십시오.
2. 세포 배양
- 3 분 동안 900 x g (~2,500 rpm)에서 원심 분리에 의해 해리 된 세포를 펠릿. P1000 피펫터와 멸균 팁을 사용하여 모든 상퍼를 조심스럽게 제거합니다. 완전한 L-15 배지및 플레이트 1 ml/well에서 펠렛 세포를 다시 중단합니다. 첨가된 배지의 양은 사용되는 8P 플레이트의 수, 플레이트에 있는 웜의 합류, 그리고 세포상에서 수행될 실험의 유형에 따라 달라집니다. 세포 밀도는 혈종계를 사용하여 결정될 수 있다. 패치 클램프 레코딩의 경우 ~ 230,000셀/cm2의 도금 밀도가 최적입니다.
- 배양 매체의 증발을 피하기 위해 젖은 종이 타월이 들어있는 플라스틱 Tupperware 용기에 24 개의 우물 접시를 보관하십시오. 20°C및 주변 공기에 가습된 인큐베이터에 용기를 보관하십시오.
- 세포는 일반적으로 GFP 마커의 형태학적 분화 및 발현이 완료될 때 24시간 이내에 실험에 대비합니다. 세포는 최대 2 주 동안 배양에서 보관 할 수 있지만 일반적으로 도금 후 7-9 일까지 가장 건강합니다. 매체는 건강한 세포를 유지하기 위하여 하루에 한 번 교체될 필요가 있습니다.
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Representative Results
그림 1. C. 치티나아제 치료 전후에 예족 배아. (A) 치티나아제에 노출되기 전에 계란의 사진. 화살표는 배아를 둘러싼 투명하고 그대로 달걀 껍질을 가리킵니다. (B) 10 분 동안 치티나아제로 처리 된 계란. 달걀 껍질은 소화되었으며 배아 주위에 더 이상 볼 수 없습니다. 화살은 달걀 껍질에서 방출된 3배 배아를 가리킵니다. 파란색 상자는 여전히 서로 부착된 셀 그룹을 둘러싸고 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
