Enzymatic Sindirim ve Manuel Ayrışma: C. elegans Embriyolarını Hücre Kültürüne Hazırlama Yöntemi

Overview

Bu video, embriyonik C. elegans hücrelerini in vitro olarak izole etmek ve steril olarak kültüre etmek için bir yöntem tanıtır.

Protocol

1. Embriyonik Hücrelerin Ayrışması

1. İşlemin sonraki adımlarını steril koşullar altında laminer akış davlumbaz kullanarak uygulayın. Hayvanlar bakteri plakalarında önlük iken, yıkamalar ve çamaşır suyu içeren lizis çözeltisi ile tedavi, tüm bakteriler olmasa bile en çok ortadan kaldırmalıdır. Böylece prosedürün bu noktasında laminar davlumbaz kullanmak yumurta süspansiyonunun yeni kirlenmesini önler.
2. Peletlenmiş yumurtaları 1 ml 2 mg/ml chitinase (yumurta tampon pH 6.5'te stoklayın) içinde yeniden depolayın ve yeni bir steril 15 ml konik tüpe aktarın. Oda sıcaklığında tüpü 10-30 dakika sallayın. Tam kuluçka süresi enzimin tazeliğine ve odanın sıcaklığına göre değişir ve bu nedenle her hazırlık için belirlenmelidir. Yumurtaları 10 dakikalık inkübasyondan sonra ters bir hücre kültürü mikroskobu altında izlemeye başlamanız önerilir. Not: Deneyimlerimize göre, düşük pH chitinase enzymatic aktivitesini arttırır. Bu nedenle chitinase'yi çözmek için pH 6.5'te yumurta tamponu kullanıyoruz (yukarıda bildirilen tarif, pH'ın NaOH kullanılarak 6.5'e ayarlandığı yer).
3. Yumurta kabuklarının ~ % 80'i kitine tedavisi ile sindirildiğinde (Şekil 1 A-B), yumurtaları 3 dakika boyunca 900 x g'da (~2.500 rpm) santrifüjleme ile peletler. Bir P1000 pipetörü ve steril uçlar kullanarak, süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 3 ml L-15 ortamı ekleyin.
4. Yumurtaları 6 cm çapında bir plakaya aktarın ve 18 G iğne ile donatılmış 10 ml steril bir şırınga kullanarak hücreleri hafifçe ayırın. Taze plastik petri kabına bir damla süspansiyon yerleştirerek ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izleyin. Hücrelere zarar vermemek için bu işlem sırasında şırındağa hava emiş etmeyin. Hücrelerin ~ % 80'i dağılana kadar ayrışma devam eder.
5. Süspansiyonu steril 5 μm Milipore filtre kullanarak filtreleyin. Hücre kümelerini, sindirilmemiş yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları çıkarmak için hücre süspansiyonları filtrelenmelidir. Tüm hücreleri kurtarmak için filtreden ilave 4-5 ml taze L-15 ortamı filtreleyin. Filtreye ve/veya hücrelere zarar vermemek için filtrasyon adımı sırasında aşırı güç kullanmayın.

2. Hücreleri Kültleme

1. 3 dakika boyunca 900 x g (~2.500 rpm) santrifüjleme ile ayrışmış hücreleri pelet. Bir P1000 pipetörü ve steril uçlar kullanarak tüm süpernatantları dikkatlice çıkarın. Peletlenmiş hücreleri tam L-15 orta ve plaka 1 ml / kuyuda yeniden biriktirin. Eklenen ortamın miktarı, kullanılan 8P plaka sayısına, solucanların plakalara birleşmesine ve hücreler üzerinde yapılacak deneylerin türüne bağlıdır. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. Yama kelepçe kayıtları için ~ 230.000 hücre / cm² kaplama yoğunluğu en uygun olanıdır.
2. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için 24 kuyu plakasını ıslak kağıt havlu içeren plastik bir Tupperware kabında saklayın. Kabı 20 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve ortam havasında saklayın.
3. Hücreler genellikle GFP belirteçlerinin morfolojik farklılaşması ve ekspresy ekspresyasyonu tamamlandığında 24 saat içinde deneylere hazırdır. Hücreler kültürde 2 haftaya kadar tutulabilir, ancak genellikle kaplamadan 7-9 gün sonrasına kadar en sağlıklıdırlar. Ortamın sağlıklı hücreleri korumak için günde bir kez değiştirilmesi gerekir.

Representative Results

Şekil 1. C. elegans embriyolarını kitin tedavisinden önce ve sonra. (A) Kitine maruz kalmadan önce yumurtaların fotoğrafı. Ok, bir embriyoyu çevreleyen şeffaf ve bozulmamış yumurta kabuğuna işaret eder. (B) Yumurtalar 10 dakika boyunca chitinase ile muamele edilir. Yumurta kabukları sindirilmiştir ve artık embriyoların etrafında görünmez. Oklar yumurta kabuğundan salınan üç katlı embriyoları işaret eder. Mavi kutu, hala birbirine bağlı olan bir grup hücreyi çevreler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator