Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

الهضم الأنزيمي والتفكك اليدوي: طريقة لإعداد أجنة C. elegans لثقافة الخلايا

Overview

يقدم هذا الفيديو طريقة لعزل وزراعة الخلايا الجنينية C. elegans العقيمة في المختبر.

Protocol

1. تفكك الخلايا الجنينية

  1. إجراء الخطوات التالية من الإجراء في ظل ظروف معقمة باستخدام غطاء محرك السيارة تدفق صفح. في حين أن الحيوانات هي ثوب على لوحات البكتيريا، يغسل والعلاج مع محلول تحلل تحتوي على التبييض ينبغي القضاء على معظم إن لم يكن كل البكتيريا. وبالتالي استخدام غطاء صفح في هذه المرحلة من الإجراء يمنع تلوث جديد من تعليق البيض.
  2. Resuspend البيض بيليه في 1 مل من 2 ملغ / مل chitinase (الأسهم في البيض العازلة pH 6.5) ونقلها إلى أنبوب جديد معقم مخروطي 15 مل. صخرة أنبوب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يتغير وقت الحضانة الدقيق وفقا لنضارة الإنزيم ودرجة حرارة الغرفة ، وبالتالي يجب تحديده لكل إعداد. يوصى بالبدء في مراقبة البيض تحت مجهر مقلوب لزراعة الخلايا بعد 10 دقائق من الحضانة. ملاحظة: في تجربتنا، وانخفاض الحموضة يزيد من النشاط الأنزيمي chitinase. لهذا السبب نستخدم البيض العازلة في درجة الحموضة 6.5 لإذابة chitinase (وصفة المذكورة أعلاه، حيث يتم تعديل درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام NaOH).
  3. عندما يتم هضم ~ 80٪ من قشر البيض عن طريق العلاج chitinase (الأرقام 1 A-B)، بيليه البيض عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز (~ 2500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. باستخدام P1000 pipettor ونصائح معقمة، وإزالة بعناية supernatant وإضافة 3 مل من L-15 المتوسطة.
  4. نقل البيض إلى لوحة قطرها 6 سم وتفكيك الخلايا بلطف باستخدام حقنة معقمة 10 مل مجهزة إبرة 18 G. مراقبة درجة الانفصال عن طريق وضع قطرة من التعليق في طبق بيتري البلاستيك الطازج ومن خلال عرض تحت المجهر. لا يستنشق الهواء في المحقنة أثناء هذا الإجراء لتجنب إتلاف الخلايا. استمر في الانفصال حتى يتم فصل ~ 80٪ من الخلايا.
  5. فلتر التعليق باستخدام فلتر ميليبور 5 ميكرومتر معقم. يجب تصفية تعليق الخلايا من أجل إزالة كتل الخلايا والبيض غير المهضوم واليرقات المفقسة. تصفية إضافية 4-5 مل من وسائل الإعلام L-15 الطازجة من خلال مرشح لاستعادة جميع الخلايا. لا تستخدم القوة المفرطة أثناء خطوة الترشيح لتجنب إتلاف الفلتر و/أو الخلايا.

2. زراعة الخلايا

  1. بيليه الخلايا المفككة عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز (~ 2500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. باستخدام أنبوب P1000 ونصائح عقيمة إزالة بعناية كل supernatant. Resuspend الخلايا بيليه في كامل L-15 المتوسطة ولوحة 1 مل / بئر. تعتمد كمية الوسط المضاف على عدد لوحات 8P المستخدمة ، والتقاء الديدان على اللوحات ، ونوع التجارب التي سيتم إجراؤها على الخلايا. يمكن تحديد كثافة الخلية باستخدام مقياس الدم. لتسجيلات التصحيح المشبك الطلاء كثافة ~ 230،000 الخلايا / سم2 هو الأمثل.
  2. الحفاظ على لوحة الآبار 24 في حاوية Tupperware البلاستيك التي تحتوي على المناشف الورقية الرطبة لتجنب تبخر الثقافة المتوسطة. تخزين الحاوية في حاضنة رطبة في 20 درجة مئوية والهواء المحيط.
  3. عادة ما تكون الخلايا جاهزة للتجارب في غضون 24 ساعة عندما يكتمل التمايز المورفولوجي والتعبير عن علامات GFP. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى أسبوعين ولكنها عادة ما تكون أكثر صحة حتى 7-9 أيام بعد الطلاء. يجب استبدال الوسيلة مرة واحدة في اليوم للحفاظ على الخلايا السليمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن ج. الأجنة elegans قبل وبعد العلاج chitinase. (أ) صورة للبيض قبل التعرض للتشيتيناز. يشير السهم إلى قشر البيض الشفاف وسليم المحيط بالجنين. (ب) البيض المعالج بتشيتيناسي لمدة 10 دقائق. وقد تم هضم قشر البيض ولم تعد مرئية حول الأجنة. تشير الأسهم إلى الأجنة ثلاثية الطيات المنبعثة من قشر البيض. يحيط المربع الأزرق بمجموعة من الخلايا التي لا تزال متصلة ببعضها البعض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid Invitrogen 11415-064
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16140-063
Penicillin-streptomycin Sigma P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus Sigma C6137-25UN
Peanut Lectin Sigma L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips USA Scentific 1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped USA Scentific 1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector VWR International Inc. 89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond VWR International Inc. 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile VWR International Inc. 14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific 1475-1611
Sterile 18 gauge Needles Becton, Dickinson and Co. 305196
Sterile 10 ml Syringes Becton, Dickinson and Co. 305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning 431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane VWR International Inc. 28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile VWR International Inc. 82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips VWR International Inc. 48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific 6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Centrifuge 5702 Eppendorf 22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

قيمة فارغة، مشكلة ،
الهضم الأنزيمي والتفكك اليدوي: طريقة لإعداد <em>أجنة C. elegans</em> لثقافة الخلايا
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST

المصدر: سانجاليتي، ر. بيانكي، L. A طريقة لزراعة الخلايا الجنينية C. elegans. ج. فيس إكسب. (2013). 

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter