Overview
וידאו זה מציג שיטה לבודד תרבות סטרילית עוברית C. elegans תאים במבחנה.
Protocol
1. ניתוק תאים עובריים
- בצע את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע זרימה למינארי. בעוד בעלי חיים הם שמלת על צלחות חיידקים, שטיפות ואת הטיפול עם פתרון תמוגה המכיל אקונומיקה צריך לחסל ביותר אם לא את כל החיידקים. לכן באמצעות מכסה המנוע למינאר בשלב זה של ההליך מונע זיהום חדש של השעיית הביצה.
- Resuspend ביצים כדוריות ב 1 מ"ל של 2 מ"ג / מ"ל chitinase (מלאי pH חיץ ביצה 6.5) ולהעביר אותם צינור סטרילי חדש 15 מיליליטר חרוט. רוק הצינור במשך 10 - 30 דקות בטמפרטורת החדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לרעננות האנזים וטמפרטורת החדר ולכן יש לקבוע לכל הכנה. מומלץ להתחיל לפקח על הביצים תחת מיקרוסקופ הפוך של תרבות התא לאחר 10 דקות של דגירה. הערה: מניסיוננו, רמת ה-pH הנמוכה מגבירה את הפעילות האנזימטית של הצ'יטינז. מסיבה זו אנו משתמשים במאגר ביצים ב- pH 6.5 כדי להמיס chitinase (מתכון שדווח לעיל, שבו pH מותאם 6.5 באמצעות NaOH).
- כאשר ~ 80% של קליפות ביצים מתעכלים על ידי טיפול chitinase(איורים 1 A-B),גלולה הביצים על ידי צנטריפוגה ב 900 x g (~ 2,500 סל"ד) במשך 3 דקות. באמצעות פיקטור P1000 וטיפים סטריליים, להסיר בזהירות את supernatant ולהוסיף 3 מ"ל של L-15 בינוני.
- מעבירים את הביצים לצלחת בקוטר 6 ס"מ ומפרקים בעדינות את התאים באמצעות מזרק סטרילי 10 מ"ל המצויד במחט 18 גרם. לפקח על מידת הדיסוציאציה על ידי הצבת טיפת השעיה לתוך צלחת פטרי פלסטיק טרי על ידי צפייה מתחת למיקרוסקופ. אין לשאוף אוויר לתוך המזרק במהלך הליך זה, כדי למנוע פגיעה בתאים. המשך את הדיסוציאציה עד ~ 80% מהתאים מנותקים.
- סנן את ההשעיה באמצעות מסנן סטרילי 5 מיקרומטר מיליפור. יש לסנן את המתלים בתאים על מנת להסיר גושי תאים, ביצים לא מעוכלות וזחלים בקעו. סנן 4-5 מ"ל נוספים של מדיית L-15 טרייה דרך המסנן כדי לשחזר את כל התאים. אין להשתמש בכוח מופרז במהלך שלב הסינון כדי למנוע פגיעה במסנן ו/או בתאים.
2. תאים Culturing
- גלולה התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה ב 900 x g (~ 2,500 סל"ד) במשך 3 דקות. באמצעות צינור P1000 וטיפים סטריליים להסיר בזהירות את כל supernatant. Resuspend את התאים כדוריים שלם L-15 בינוני צלחת 1 מיליליטר / טוב. כמות המדיום שנוספה תלויה במספר לוחות ה-8P שבהם נעשה שימוש, במפגש התולעים על הלוחות ובסוג הניסויים שיבוצעו על התאים. ניתן לקבוע את צפיפות התא באמצעות המוציטרומטר. עבור הקלטות מהדק תיקון ציפוי צפיפות של ~ 230,000 תאים / ס"מ2 הוא אופטימלי.
- שמרו את צלחת 24 הבארות במיכל טאפרוור מפלסטיק המכיל מגבות נייר רטובות כדי למנוע אידוי של מדיום תרבות. אחסן את המיכל באינקובטור לח ב 20 מעלות צלזיוס ואוויר הסביבה.
- התאים מוכנים בדרך כלל לניסויים בתוך 24 שעות כאשר הבידול המורפולוגי והביטוי של סמני GFP הושלמו. תאים יכולים להישמר בתרבות עד 2 שבועות אבל הם בדרך כלל בריאים ביותר עד 7-9 ימים לאחר הציפוי. המדיום צריך להיות מוחלף פעם ביום כדי לשמור על תאים בריאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1. ג. אלגנים עוברים לפני ואחרי טיפול chitinase. (א) תצלום ביצים לפני החשיפה לצ'יטינז. החץ מצביע על קליפת הביצה השקופה והשלמה המקיפה עובר. (ב) ביצים שטופלו בצ'יטינז במשך 10 דקות. קליפות הביצים מתעכלות ואינן נראות עוד סביב העוברים. החצים מצביעים על עוברים פי שלושה ששוחררו מסל הביצה. התיבה הכחולה מקיפה קבוצת תאים שעדיין מחוברים זה לזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
